日本免费黄色网址_国产又粗又大又爽大片精华液_午夜一区国产一级 片_深夜草莓视频下载APP_秋霞午夜理论2019理论中文_在线免费欧美成人亚洲_熟妇人妻av中文字幕_嫩草91久久精品中文字幕_四川小幺女国产一级毛片_波多野结衣无码在线

影響因子：10.3

足細(xì)胞對維持腎小球?yàn)V過屏障至關(guān)重要。與腎病綜合征相關(guān)的基因突變導(dǎo)致足細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)鈣升高，并導(dǎo)致濾過屏障功能的破壞。鈣信號是否在濾過屏障的初始形成中起作用尚不清楚。通過在斑馬魚幼魚和人類腎臟類器官兩個模型中使用活鈣成像，作者證明足細(xì)胞鈣信號在足細(xì)胞分化過程中是活躍的，是足細(xì)胞自主的，獨(dú)立于鄰近細(xì)胞類型發(fā)生，并且是足突和狹縫隔膜形成所必需的。他們的研究結(jié)果還表明，發(fā)育鈣信號的發(fā)生機(jī)制與疾病相關(guān)的鈣干擾不同，是足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和過濾屏障形成的關(guān)鍵調(diào)控信號。

足細(xì)胞對維持腎小球?yàn)V過屏障至關(guān)重要，并且已知腎病綜合征基因的突變會影響足細(xì)胞鈣信號傳導(dǎo)。然而，鈣信號在足細(xì)胞發(fā)育過程中的作用尚不清楚。

我們利用斑馬魚幼魚和人類腎臟類器官對發(fā)育中的足細(xì)胞進(jìn)行了鈣信號的實(shí)時成像。為了評估發(fā)育過程中的鈣信號，以及對通道阻滯劑和遺傳缺陷的響應(yīng)，鈣生物傳感器GCaMP6s在斑馬魚足細(xì)胞中表達(dá)。我們使用電子顯微鏡來評估斑馬魚的過濾屏障形成，并使用Fluo-4來檢測人腎類器官分化足細(xì)胞中的鈣信號。

未成熟的斑馬魚足細(xì)胞(受精后2.5天)產(chǎn)生鈣瞬態(tài)，與形成腎小球毛細(xì)血管的相互作用相關(guān)。鈣瞬態(tài)持續(xù)到受精后4天，并在腎小球屏障形成完成后消失。我們在成熟的人類類器官腎小球中檢測到類似的鈣瞬變，這提示了一個保守的機(jī)制。在這兩種模型中，SERCA或IP3受體鈣釋放通道抑制劑阻斷了足細(xì)胞中的鈣瞬態(tài)，而鑭則無效，表明鈣來源自足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存。鈣瞬態(tài)不受阻斷心跳或內(nèi)皮、內(nèi)胚層發(fā)育的影響，且在離體腎小球中持續(xù)存在，提示足細(xì)胞自主鈣釋放。抑制磷脂酶C-γ1的表達(dá)可顯著降低鈣活性，而抑制Nephrin或磷脂酶C-ε1的表達(dá)則不能。最后，阻斷鈣釋放影響腎小球形狀和足細(xì)胞足突形成，支持鈣信號在腎小球形態(tài)發(fā)生中的關(guān)鍵作用。

這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了足細(xì)胞自主鈣信號是足細(xì)胞分化的一個突出且進(jìn)化保守的特征，并證明了足細(xì)胞足突形成的必要性。

材料與方法

斑馬魚(Danio rerio)成魚和幼魚按照既定方案飼養(yǎng)。本研究使用的魚線見表1。所有胚胎和幼魚均用0.02%三卡因甲烷磺酸鈉麻醉(MS 222；Sigma-Aldrich)，并在0.2%三卡因甲烷磺酸鈉中安樂死。所有的研究都遵循美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南，并得到了馬薩諸塞州總醫(yī)院機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會的批準(zhǔn)。

為了在表達(dá)wt1b的細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ERT結(jié)構(gòu)域與Gal4融合的Tg(wt1b:Gal4ERT)斑馬魚系，將wt1b啟動子從pCRII-TOPO-zfwt1b質(zhì)粒(Englert實(shí)驗(yàn)室的禮物)擴(kuò)增到p5E載體中，然后使用p5E-wt1b、pME-Gal4-ERT-VP16、32 p3E-ploy(a)和pDestTol2a-crystallin mCherry通過三片段通道反應(yīng)(Invitrogen)組裝到最終表達(dá)載體中。

參照文獻(xiàn)報(bào)道誘導(dǎo)Tg(wt1b:Gal4ERT)表達(dá)，不同之處是采用(E/Z)-鹽酸多西芬(E8284；Sigma)代替4-羥基他莫西芬。Endoxifen以10 mM的原液濃度溶解在乙醇中，然后在受精后12小時(hpf)以10 μM的終濃度加入魚水中，直到胚胎成像(約24 hpf)。

根據(jù)Kimmel等人的方法進(jìn)行胚胎和幼魚分期，人工脫色，用0.02%的三卡因甲磺酸麻醉，然后裝在裝有1.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖的玻璃底培養(yǎng)皿中。鈣成像采用蔡司LSM 510共聚焦顯微鏡(鈣成像，卡爾蔡司)，配40倍水物鏡，在1 Hz下進(jìn)行，約8分鐘(500秒)。如前所述，使用Fiji和MATLAB進(jìn)行圖像分析。我們根據(jù)SD z投影手動選擇感興趣的區(qū)域。ΔF/F和活動的歸一化積分是用MATLAB編寫的自定義腳本計(jì)算的(可在https://github.com/lydiadjenoune/calcium_analysis_podocytes獲得)。與GCAMP6s信號相關(guān)的熒光變化定義為Δ函數(shù)ΔF/F。每個感興趣區(qū)域的ΔF/F計(jì)算為ΔF/F=(F[t]?F0)/F0，其中F0為光漂白校正后手動選擇的基線，F(xiàn)(t)為給定時間的熒光強(qiáng)度。利用二階多項(xiàng)式在ΔF/F軌跡上擬合閾值最小值，通過減法修正基線，然后利用梯形積分近似在修正后的ΔF/F軌跡上計(jì)算積分/ ΔF/F。對于涉及多個實(shí)驗(yàn)條件的成像，除非另有說明，否則所有溶液均為浴液。在所有散點(diǎn)圖上，一個點(diǎn)代表一個單元格。在原始痕跡上，前后痕跡表示藥物治療前后給定細(xì)胞的活性。請注意，對于所有藥物治療，在藥物應(yīng)用之前和之后分析了完全相同的細(xì)胞的活性。

腎類器官是使用先前描述的iPSC MAFB^mTagBFP2/+報(bào)告細(xì)胞系，按照我們之前發(fā)表的定向分化方案生成的。簡單地說，iPSCs單層培養(yǎng)7天后分化為后腎間質(zhì)。在第7天(D7)，細(xì)胞被解離并生物打印成三維結(jié)構(gòu)，形成類器官。然后將類器官培養(yǎng)19天(D7+19)，然后作為完整的類器官進(jìn)行分析，或者使用機(jī)械解離和篩選分離腎小球(分離的類器官腎小球，OrgGloms)。簡單地說，通過溫和的移液和TrypLE Select酶(Thermo Fisher Scientific)的孵育，類器官被酶和機(jī)械分離。均勻的細(xì)胞懸浮液然后通過一系列過濾器分離完整的腎小球細(xì)胞聚集體。

整個類器官免疫染色

固定腎類器官用以下一抗和二抗進(jìn)行免疫染色:LAMA5 (Abcam 1:300, cat# ab77175)、Nephrin (NPHS1 1:300, Bioscientific, cat# AF4269)、Claudin-1 (CLDN1 1:100, Thermo Fisher Scientific, cat# 71-7800)、Alexa fluor 405驢抗小鼠(Abcam, cat# ab175659)、Alexa fluor 488驢抗山羊(Molecular Probes, cat# A11055)和Alexa fluor 568驢抗兔(Life Technologies, cat# A10042)。

腎臟類器官和細(xì)胞浸潤均與鈣指示物Fluo-4、AM、細(xì)胞滲透(Fluo-4、5 μM、F14201、Thermo Fisher Scientific)在必需6培養(yǎng)基(05946，干細(xì)胞技術(shù))中稀釋1小時和10分鐘，分別在37℃孵育。成像前用100 μM鑭(La³⁺)、20 μM環(huán)吡唑酸(CPA)、1 μM thapsigargin和30 μM 2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)或載體(DMSO)處理細(xì)胞，時間為30分鐘。使用配備20倍空氣物鏡的蜻蜓旋轉(zhuǎn)圓盤共聚焦顯微鏡(Andor Technology)在1 Hz下記錄2-4分鐘的鈣通量。鈣通量記錄在37°C和5%二氧化碳的控制溫度下進(jìn)行。鑒定出局限于MAFB^mTagBFP2/+表達(dá)足細(xì)胞的感興趣區(qū)域，并對斑馬魚樣本進(jìn)行圖像分析。實(shí)驗(yàn)在三個生物重復(fù)上進(jìn)行，其中每個生物重復(fù)是一個獨(dú)立的定向分化實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗(yàn)。

為了檢測足細(xì)胞鈣瞬態(tài)是否在細(xì)胞內(nèi)儲存或細(xì)胞外隔室釋放后產(chǎn)生，我們使用鈣通道阻滯劑La³⁺(100μM, 298182, Sigma)，肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑CPA(20μM, C1530, Sigma)和thapsigargin(1μM, T9033, Sigma)和IP3受體抑制劑2-APB(30μM, D9754, Sigma)在受精后3天(dpf) Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)斑馬魚幼魚。為了測試血管緊張素通路的作用，我們使用了選擇性血管緊張素AT1受體拮抗劑氯沙坦(100μM, 3798, Tocris)。為了測試血管壓力的貢獻(xiàn)，我們使用心跳阻滯劑安哌唑(30μM, AOB5283, Aobious)。為了誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，我們將通過黃嘌呤氧化酶途徑誘導(dǎo)氧化損傷的嘌呤霉素氨基核苷(PAN, 45 mg/ml, P7130, Sigma)注射到5 dpf Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)幼魚的主靜脈或心包囊中，并在7 dpf時進(jìn)行成像。

將Morpholinos(基因工具)重懸在無菌水中，作為2mm的原液保存在?20°C。注射時，用0.1 M氯化鉀、0.01M HEPES和0.2%酚紅稀釋morpholino寡核苷酸，使用Nanoliter 2000微量注射器(World Precision Instruments)進(jìn)行注射。在單細(xì)胞期注射Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)斑馬魚胚胎。本研究中使用的Morpholinos見表2。只有顯示預(yù)期表型的突變體，如前所述，在3 dpf下進(jìn)行成像和隨后的分析，并使用先前發(fā)表的引物通過RT-PCR確定敲低效率的驗(yàn)證(見表2中的參考文獻(xiàn))。

為了成像游離腎小球足細(xì)胞鈣活性，首先將表達(dá)Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)的幼魚懸浮在HBSS中(10-527F, Lonza)。然后在HBSS中加入二硫蘇糖醇(10 mM, BP172-5, Fisher Scientific)，室溫下攪拌30分鐘，然后用HBSS洗滌三次。然后用10 mg/ml的2型膠原酶(Worthington)在HBSS中處理幼魚，在28.5°C下處理30分鐘，移液勻漿3次。過量加入HBSS使反應(yīng)停止。然后在徠卡熒光立體鏡下篩選(人工選擇)離體腎小球，并將其小心地置于1.5%瓊脂糖覆蓋的HBSS中。

在0.02%三卡因甲磺酸溶液中麻醉幼魚，然后在0.2%三卡因甲磺酸溶液中安樂死，然后在含有1.5%戊二醛、1%多聚甲醛、70 mM磷酸鈉(pH 7.2)、3%蔗糖和1%單寧酸的溶液中于4°C固定過夜。如前所述，對傳播EM的幼魚進(jìn)行了準(zhǔn)備。在EMbed 812中包埋后，用3× Ultracut E (Reichert-Jung, Nussloch, Germany)進(jìn)行半薄(300 nm)和超薄(90 nm)切片，切片轉(zhuǎn)移到銅狹縫網(wǎng)格上(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)。然后用醋酸鈾乙酯和檸檬酸鉛對網(wǎng)格進(jìn)行染色，并使用Morgagni電子顯微鏡(FEI, Eindhoven, NL)在80 kv下進(jìn)行成像。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用Brown-Forsythe和Welch方差分析，Dunnett T3多重比較檢驗(yàn)。

除非另有說明，否則使用T檢驗(yàn)比較藥物治療前后或腎小球加工前后的細(xì)胞鈣活性。所有數(shù)據(jù)集的顯著性水平均P<0.05。P值表示為:*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001， ****P<0.0001。所有量化均以95%置信區(qū)間的中位數(shù)表示。使用Prism8 (GraphPad)制作所有圖表并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

為了檢查腎小球形態(tài)發(fā)生的動力學(xué)，我們對標(biāo)記前腎原細(xì)胞(綠色)和內(nèi)皮細(xì)胞(紅色)的Tg(wt1:GFP)和Tg(flk1:mCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系進(jìn)行了成像(圖1,A和B)。在30至72 hpf之間的實(shí)時成像顯示了腎小球?yàn)V過屏障形成的早期階段，當(dāng)足細(xì)胞運(yùn)動時，向中線主動脈遷移，并與形成毛細(xì)血管相互作用(圖1,C-G,補(bǔ)充視頻1)。為了探索鈣活性在腎小球形態(tài)發(fā)生中的作用，我們使用Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)或Tg(wt1b:Gal4ERT;UAS:GCaMP6s)(針對36 hpf之前的時間點(diǎn))對基因編碼的鈣生物傳感器GCaMP6s在分化足細(xì)胞中的實(shí)時成像(圖1，H-J)。我們觀察到遷移的足細(xì)胞沒有表現(xiàn)出顯著的鈣活性(從1到2 dpf;圖1 j)。然而，一旦足細(xì)胞原基的中線匯合完成，可以檢測到頻繁的細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變(3 dpf;圖1,I和J，補(bǔ)充視頻2)。足細(xì)胞胞質(zhì)鈣瞬態(tài)表現(xiàn)出快速的峰值和衰減行為，平均持續(xù)時間約為40秒(補(bǔ)充圖1,a和C)。振幅，以ΔF/F的任意單位表示，相對恒定(圖1I，補(bǔ)充圖1B)。足細(xì)胞在分化過程中表現(xiàn)出鈣瞬變(3~4 dpf;圖1J)，并在鑒別大小的腎小球?yàn)V過屏障形成完成的階段恢復(fù)到沉默狀態(tài)(5-7 dpf;圖1J，補(bǔ)充視頻2)。鈣信號積分值的變化(圖1J)以相對恒定的幅度反映了瞬態(tài)頻率的變化(圖1I，補(bǔ)充圖1A)。結(jié)果表明，在斑馬魚腎小球?yàn)V過屏障成熟過程中，存在一種以前未被發(fā)現(xiàn)的鈣信號活動。

為了確定足細(xì)胞成熟過程中的鈣信號傳導(dǎo)是否是脊椎動物的共同特征，我們研究了iPSC衍生的人腎類器官腎小球形成過程中的鈣動力學(xué)(圖2)。腎類器官是由MAFB^mTagBFP2/+ iPSC報(bào)告系產(chǎn)生的，當(dāng)足細(xì)胞在類器官中產(chǎn)生時，熒光標(biāo)記(藍(lán)色)。這有助于確定類器官內(nèi)的腎小球，使我們能夠?qū)崟r成像它們的發(fā)育(圖2B)。早在腎發(fā)生誘導(dǎo)后10天(D7+10)就可以識別出MAFB⁺足細(xì)胞，這些細(xì)胞在隨后的9天內(nèi)成熟形成明確的腎小球，其特征是極化的NPHS1⁺足細(xì)胞位于GBM上，并被CLDN1⁺壁上皮細(xì)胞包圍(圖2C)。在類器官培養(yǎng)的兩個階段，分別為“早期”和“晚期”時間點(diǎn)(D7+12/14和D7+18/19，圖2A)，用鈣指示劑Fluo-4標(biāo)記腎類器官(圖2D)或OrgGloms(圖2E)，對鈣活性進(jìn)行成像。有趣的是，足細(xì)胞鈣活性在早期足細(xì)胞中是有限的，而在后期時間點(diǎn)成像的足細(xì)胞中則顯著增加(圖2H)。值得注意的是，F(xiàn)luo-4鈣探針在OrgGloms中的擴(kuò)散得到了改善(補(bǔ)充圖2,A和B)?？偟膩碚f，我們能夠在完整腎臟類器官和OrgGloms(分別圖2,F和G，補(bǔ)充視頻3)的后期時間點(diǎn)顯示成熟足細(xì)胞中可靠且可重復(fù)的鈣瞬變。這些結(jié)果表明，鈣信號的增加是腎小球形態(tài)發(fā)生的一個保守特征。

為了確定腎小球形態(tài)形成過程中足細(xì)胞鈣活性的潛在途徑，我們研究了血管活性激素血管緊張素II (Ang II)的作用。事實(shí)上，在培養(yǎng)的大鼠足細(xì)胞中觀察到Ang II增加了細(xì)胞質(zhì)鈣活性。然而，在我們的系統(tǒng)中，Ang-II受體阻滯劑氯沙坦對分化足細(xì)胞鈣活性沒有顯著影響(圖3A)，這表明足細(xì)胞的發(fā)育依賴于不同的鈣信號通路。由于在足細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了膜鈣通道，包括TRPC5/6，我們接下來測試了細(xì)胞外鈣的貢獻(xiàn)。我們用鈣通道阻滯劑La3+處理斑馬魚胚胎，并沒有觀察到斑馬魚和人類類器官發(fā)育足細(xì)胞中鈣活性的顯著降低(圖3、B和D，分別為補(bǔ)充視頻4和5)。盡管有報(bào)道稱，在病理?xiàng)l件下，成年小鼠的La3+會刺激TRPC5并影響足細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但在發(fā)育中的斑馬魚腎小球中并未觀察到該通道的表達(dá)，也未在人類ipsc衍生的OrgGloms中富集。為了確定鈣是否從細(xì)胞內(nèi)儲存中釋放，我們使用了SERCA泵抑制劑CPA和thapsigargin，以及IP3受體阻滯劑2-APB。使用這些化合物，我們觀察到斑馬魚和人類類器官足細(xì)胞中鈣活性的顯著降低(圖3、C和D分別見補(bǔ)充視頻4和5)。這些數(shù)據(jù)表明，在人和斑馬魚足細(xì)胞分化過程中觀察到的鈣活性依賴于通過IP3受體從細(xì)胞內(nèi)儲存中釋放出來，而不是通過細(xì)胞膜鈣通道介導(dǎo)。

為了進(jìn)一步探索足細(xì)胞發(fā)育過程中觸發(fā)鈣釋放的信號通路，我們測試了BP誘導(dǎo)的足細(xì)胞機(jī)械拉伸是否會引起鈣瞬變。我們通過morpholino敲低肌鈣蛋白T-2 (tnnt2，也被稱為沉默的心臟)和使用小分子amperozide從藥理學(xué)上阻斷斑馬魚的心跳(圖4,A和B)。這兩種治療方法都沒有顯著降低鈣瞬態(tài)活性，這表明足細(xì)胞發(fā)育鈣瞬態(tài)不是由血管壓力誘導(dǎo)的。由于足細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸，我們通過檢查cloche突變體來測試是否需要來自內(nèi)皮的信號來啟動足細(xì)胞鈣信號，其中內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育被阻斷，導(dǎo)致缺乏內(nèi)皮細(xì)胞的突變胚胎。盡管足細(xì)胞中線遷移失敗，在cloche突變體中仍然觀察到鈣瞬變(圖4C，補(bǔ)充視頻6)。我們通過使用sox32 morpholino注射阻斷所有內(nèi)胚層發(fā)育來測試內(nèi)胚層信號的貢獻(xiàn)。在缺乏內(nèi)胚層的胚胎中，未觀察到足細(xì)胞鈣活性降低(圖4D)。這些結(jié)果表明，在腎小球分化過程中，足細(xì)胞鈣瞬變不是由內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)胚層誘導(dǎo)的，并提示，自分泌來源的刺激導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣釋放。

為了確定足細(xì)胞是否自主產(chǎn)生鈣信號，我們分離腎小球并將其鍍上HBSS成像。即使在不接觸鄰近組織的分離條件下，新分離的斑馬魚足細(xì)胞仍然表現(xiàn)出鈣瞬態(tài)(圖4E，補(bǔ)充視頻7)。與我們在體內(nèi)觀察到的結(jié)果一致，從7dpf幼魚中分離的足細(xì)胞在體外對鈣瞬態(tài)是沉默的，這表明鈣信號是受發(fā)育調(diào)節(jié)的(圖4E，補(bǔ)充視頻7)。這也表明在3dpf離體腎小球中觀察到的鈣瞬變不是由于細(xì)胞解離引起的損傷。同樣，人腎類器官足細(xì)胞鈣瞬態(tài)不受腎小球分離的影響。分離后斑馬魚或類器官足細(xì)胞的平均振幅和平均持續(xù)時間均未受到明顯影響(圖2，補(bǔ)充圖1、B和C)。注意，斑馬魚游離足細(xì)胞的La3+處理不影響其鈣活性，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)釋放是鈣的來源(補(bǔ)充圖1D)。

IP3調(diào)控的鈣從細(xì)胞內(nèi)儲存的釋放依賴于PLC的活性和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成IP3。已有兩種PLC酶在足細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮作用:PLCe(其突變導(dǎo)致人類蛋白尿腎病)和PLCg(一種廣泛表達(dá)的PLC同型)。此外，狹縫隔膜細(xì)胞粘附分子Nephrin的磷酸化已被證明在異位表達(dá)時刺激鈣釋放。為了測試這些候選調(diào)控因子的參與，我們用反義morpholino寡聚物瞬時擊倒它們，并對由此產(chǎn)生的鈣活性進(jìn)行了表征。盡管敲低PLCe和Nephrin對鈣活性沒有顯著影響，但敲低PLCg強(qiáng)烈抑制足細(xì)胞中的鈣釋放(圖4F，補(bǔ)充視頻8)?？紤]到異位表達(dá)的Nephrin導(dǎo)致鈣釋放的報(bào)道，我們證實(shí)，在完全缺乏野生型Nephrin mRNA的胚胎中，鈣瞬態(tài)仍然存在(補(bǔ)充圖3)。我們的結(jié)果表明足細(xì)胞是自主信號細(xì)胞，通過細(xì)胞接觸或局部產(chǎn)生的配體，刺激PLCg和IP3的產(chǎn)生，導(dǎo)致鈣從細(xì)胞內(nèi)儲存中短暫釋放。

足細(xì)胞鈣瞬變與腎小球毛細(xì)血管袢的形成和濾過屏障的形成相關(guān)。腎小球?yàn)V過屏障的定義是足細(xì)胞足突交叉和特化細(xì)胞黏附的建立，即狹縫橫膈膜。斑馬魚過濾屏障的最終成熟發(fā)生在3.5-4.5 dpf之間。我們通過抑制斑馬魚幼魚中鈣的釋放，并通過EM檢查濾過屏障的超微結(jié)構(gòu)，來測試鈣瞬態(tài)是否需要形成濾過屏障。為了避免影響整個胚胎，我們建立了低劑量的SERCA泵抑制劑CPA或thapsigargin，它們阻斷足細(xì)胞鈣的釋放，但不影響心跳。用DMSO處理的對照幼魚表現(xiàn)出正常的足突和過濾屏障形成，足突粘附在主動脈中線(圖5、A和B)。相反，用20μM CPA或1μM 3.5至4.5 dpf的apsigargin處理的幼魚的足突形成被阻止或抑制，沒有證據(jù)表明足突形態(tài)正常，足突出現(xiàn)大的、被抹去的足突(圖5B)。與對照組相比，與基底膜接觸的細(xì)胞過程的量化顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑存在時，每微米GBM中確定的細(xì)胞過程數(shù)量顯著減少(圖5C)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑治療期間未觀察到細(xì)胞損失(圖5D)。結(jié)果表明，自主鈣信號是濾過屏障形態(tài)成熟和足細(xì)胞足突形成所必需的。

足細(xì)胞中的鈣信號與足突交錯和細(xì)胞骨架重排的高度動態(tài)階段有關(guān)，這些階段被鈣缺乏所阻斷。在后期，當(dāng)濾過屏障根據(jù)分子大小功能性地區(qū)分血液溶質(zhì)時，鈣瞬態(tài)(圖1J)和活躍的細(xì)胞重排停止。在體內(nèi)足細(xì)胞損傷后，足突收縮和消失，導(dǎo)致蛋白質(zhì)滲漏到濾液或蛋白尿中。為了確定足細(xì)胞損傷是否與鈣瞬態(tài)重新啟動相關(guān)，我們用PAN處理了7dpf斑馬魚幼魚，并測定了鈣活性。PAN處理導(dǎo)致鈣瞬態(tài)顯著增加(圖5E，補(bǔ)充視頻9)，表明鈣信號可能在細(xì)胞重排的動態(tài)狀態(tài)中是必需的，無論是發(fā)育狀態(tài)還是作為損傷反應(yīng)的組成部分。

在這項(xiàng)研究中，我們報(bào)道鈣信號是腎小球形態(tài)發(fā)生過程中足細(xì)胞發(fā)育的一個重要和進(jìn)化保守特征。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)這種活性是足細(xì)胞自主的，對足突的正常分化至關(guān)重要，并且在斑馬魚和人類類器官腎小球之間是保守的?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們提出自主調(diào)節(jié)的PLCg/ ip3介導(dǎo)的鈣從細(xì)胞內(nèi)儲存中釋放觸發(fā)導(dǎo)致足細(xì)胞足突分化和腎小球?yàn)V過屏障形成的必要過程。

我們的結(jié)論是，足細(xì)胞鈣瞬態(tài)有助于足細(xì)胞足突的分化，這主要基于兩個觀察結(jié)果。鈣信號活動在斑馬魚足細(xì)胞末梢分化之前達(dá)到峰值，在3.5-4.5 dpf之間建立了與交叉足突形成的時間聯(lián)系。此外，在成熟足細(xì)胞中，只有在損傷后，當(dāng)足突發(fā)生消退和重塑時，才能觀察到鈣瞬態(tài)，進(jìn)一步表明這種活性是導(dǎo)致足突重組的信號通路的基礎(chǔ)。重要的是，在足細(xì)胞終末分化過程中阻斷鈣的釋放會損害足突的形成，導(dǎo)致一種被抹掉的、無序的細(xì)胞投射表型。足細(xì)胞鈣瞬變不太可能促進(jìn)中線細(xì)胞的遷移，因?yàn)檫@沒有被SERCA抑制劑阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)，也因?yàn)槭軅淖慵?xì)胞(主動發(fā)出鈣信號)不會遷移。

人類類器官腎小球代表一個獨(dú)特的三維模型的人腎小球與適當(dāng)?shù)幕蚝偷鞍踪|(zhì)表達(dá)。類器官腎小球內(nèi)足細(xì)胞呈極化、狹縫隔膜和足突形成。他們對人類腎小球發(fā)育模型的準(zhǔn)確性證明了他們能夠復(fù)制幾種遺傳性先天性腎病綜合征(包括NPHS1 (NPHS1突變)和nos1ap相關(guān)腎病綜合征)中存在的腎小球缺陷，并反映腎毒性反應(yīng)，包括PAN腎病和慶大霉素治療。然而，就GBM成熟而言，這些器官腎小球顯然仍然不成熟，大多數(shù)類器官腎小球缺乏腎小球毛細(xì)血管。來自斑馬魚的數(shù)據(jù)將預(yù)測后者不是裂隙隔膜形成的屏障，因此類器官腎小球被證明是研究人類腎小球成熟過程中鈣在細(xì)胞骨架動力學(xué)中的作用的可靠模型。

TRP通道TRPC5和TRPC6已被確定為鈣內(nèi)流通路，介導(dǎo)足細(xì)胞鈣離子傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架變化。盡管如此，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜鈣通道并不參與發(fā)育足細(xì)胞鈣信號傳導(dǎo)，這表明足細(xì)胞在分化早期依賴于不同的鈣釋放途徑。細(xì)胞膜鈣通道不參與早期鈣信號的發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)TRPC6功能獲得性突變患者僅表現(xiàn)出晚發(fā)性FSGS的報(bào)道是一致的，早在腎臟發(fā)育完成后。此外，小鼠TRPC6敲除不會導(dǎo)致早期腎小球形態(tài)發(fā)生缺陷或尿白蛋白排泄/蛋白尿的改變。同樣，在病理?xiàng)l件下，TRPC5的過表達(dá)或激活不會引起腎屏障損傷或加重足細(xì)胞損傷。這些結(jié)果表明，TRPC6和TRPC5在成人腎功能中起作用較晚，而在分化足細(xì)胞中不起作用。

斑馬魚和人腎類器官的足細(xì)胞鈣瞬態(tài)是通過IP3受體從細(xì)胞內(nèi)儲存中釋放出來的。這種類型的鈣釋放依賴于PLC的活性和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成IP3。也許令人驚訝的是，我們的斑馬魚敲除篩選顯示PLCg1，而不是與fsgs相關(guān)的PLCe1，是涉及的關(guān)鍵PLC同型。PLCg廣泛表達(dá)，并與細(xì)胞骨架重塑有關(guān)。小鼠PLCg1嵌合突變體表現(xiàn)出多囊腎發(fā)育不良伴硬化腎小球，與腎小球成熟或功能中的作用一致。PLCg1的另一個主要產(chǎn)物二酰基甘油激活蛋白激酶C，促進(jìn)Nephrin從足細(xì)胞細(xì)胞膜上移除，提示裂隙膜蛋白的動態(tài)周轉(zhuǎn)可能是足細(xì)胞足突形成的一個特征。據(jù)報(bào)道，腎素磷酸化可通過募集和激活PLCg觸發(fā)鈣信號。然而，我們的研究結(jié)果表明，體內(nèi)足細(xì)胞鈣活性并不需要Nephrin，這表明其他足細(xì)胞蛋白，例如酪氨酸激酶底物Neph蛋白，可能會彌補(bǔ)Nephrin的缺乏，正如它們在缺乏Nephrin基因的雞中所做的那樣。

在斑馬魚腎小球形態(tài)發(fā)生過程中，足細(xì)胞鈣釋放在離體足細(xì)胞組中是自主的，在體內(nèi)不需要鄰近內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)胚層的信號。這一結(jié)論部分是基于斑馬魚突變體cloche的表型，其中神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4樣轉(zhuǎn)錄因子的突變阻止了所有內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞譜系的分化。我們在SERCA抑制劑實(shí)驗(yàn)中觀察到，cloche突變足細(xì)胞中鈣信號的持續(xù)存在，以及足突形成對鈣信號的需求，與cloche突變足細(xì)胞足突形成的EM結(jié)果一致，盡管完全缺乏內(nèi)皮細(xì)胞。類似地，在人腎類器官中，盡管很少有內(nèi)皮細(xì)胞存在，但幾乎所有組織中MAFBmTagBFP2/+陽性足細(xì)胞簇都顯示鈣信號。雖然我們不能完全排除內(nèi)皮細(xì)胞的存在，但大多數(shù)細(xì)胞浸潤是無血管的，這支持斑馬魚中足細(xì)胞瞬時鈣離子不需要內(nèi)皮細(xì)胞的觀察結(jié)果。然而，更廣泛地說，斑馬魚腎小球的形態(tài)發(fā)生和哺乳動物腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)和選擇性通透性的維持需要內(nèi)皮細(xì)胞、系膜和足細(xì)胞信號的復(fù)雜相互作用。盡管如此，發(fā)育中的足細(xì)胞鈣信號和足突的初始形成似乎是足細(xì)胞自主的。

當(dāng)斑馬魚腎小球成熟時，鈣信號被抑制，提示激活信號丟失或被腎小球成熟信號主動抑制。成熟腎小球中鈣信號的停止對腎小球功能的穩(wěn)定是必需的，這可以從TRPC6突變引起的FSGS的發(fā)生和受傷足細(xì)胞中短暫鈣的重現(xiàn)中得到證明(圖5E)。我們發(fā)現(xiàn)，與發(fā)育中的鈣瞬變的啟動相似，鈣瞬變的停止獨(dú)立于內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生，這是因?yàn)?和6dpf時鐘突變體在鈣信號傳導(dǎo)方面是沉默的，與相同年齡的野生型胚胎相似(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)合我們在體外維持的7dpf斑馬魚足細(xì)胞不顯示鈣瞬變的發(fā)現(xiàn)，這些數(shù)據(jù)表明鈣信號的啟動和停止可能由足細(xì)胞自主機(jī)制介導(dǎo)。進(jìn)一步研究自主細(xì)胞信號系統(tǒng)，如Neph狹縫隔膜蛋白相互作用或自分泌信號，可能會揭示足細(xì)胞特異性的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放誘導(dǎo)劑。另外，足細(xì)胞可能通過鈣誘導(dǎo)的鈣釋放完全自主地發(fā)出信號，就像在腎微血管中發(fā)生的那樣。

足細(xì)胞損傷導(dǎo)致足突消退，涉及肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排。與我們的結(jié)果一致，其他研究報(bào)道足細(xì)胞損傷后細(xì)胞內(nèi)鈣增加，這與鈣在肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑和足突消退中的作用一致。雖然短時間的鈣瞬變可能不足以引起蛋白尿，但長期穩(wěn)定足細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣，在腎病綜合征的情況下，可能對防止進(jìn)一步的腎小球損害至關(guān)重要。我們的研究建立了斑馬魚幼魚和人腎類器官作為鈣信號受損引起腎小球疾病的模型，并作為篩選腎小球疾病中調(diào)節(jié)足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的新物質(zhì)的平臺。