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影響因子：3.8

在航天飛行過程中，宇航員的骨密度(BMD)在負(fù)重部位明顯下降。破骨細(xì)胞似乎會受到重力變化的影響，然而，其分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TRAP-GFP/Osterix-DsRed雙轉(zhuǎn)基因青鳉魚在國際空間站飼養(yǎng)56天后，其咽骨和牙齒區(qū)域的礦物質(zhì)密度降低，破骨細(xì)胞被激活。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞線粒體圓度較低。在全轉(zhuǎn)錄組分析中，fkbp5和ddit4基因在飛行組中顯著上調(diào)。這些魚的異常行為被拍攝下來，有趣的是，青鳉魚在暴露的后期往往變得不動。這些結(jié)果揭示了微重力下機(jī)械力的變化導(dǎo)致的生理功能受損，這種損傷伴隨著破骨細(xì)胞的激活。

目前認(rèn)為重力是影響骨組織構(gòu)建和重塑的關(guān)鍵因素。微重力環(huán)境的性質(zhì)使我們認(rèn)為，外力的改變會導(dǎo)致靜態(tài)感覺、細(xì)胞活動和生理的失衡。事實(shí)上，已知宇航員的骨密度會下降，這表明破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞會受到重力變化的影響。最近有報道稱，雙膦酸鹽治療聯(lián)合運(yùn)動對長時間太空飛行期間的人類骨丟失有保護(hù)作用，這表明破骨細(xì)胞在微重力下被激活。然而，其機(jī)制尚不清楚;大多數(shù)體內(nèi)研究沒有顯示出太空飛行期間破骨細(xì)胞數(shù)量或活性的明顯變化。

為了研究微重力環(huán)境下動物生長過程中與骨形成和骨吸收相關(guān)的細(xì)胞活動，在本研究中，我們利用轉(zhuǎn)基因青鳉魚從幼年期到成年期的骨生長進(jìn)行了太空實(shí)驗(yàn)。我們主要檢查了咽區(qū)，那里有很多破骨細(xì)胞，這個區(qū)域在成年魚中含有數(shù)百顆牙齒，因?yàn)檫@個區(qū)域的牙齒密度很高，所以對重力高度敏感。

在60天的微重力系統(tǒng)飼養(yǎng)中，這些魚的異常行為被拍攝了下來。我們發(fā)現(xiàn)青鳉魚在國際空間站飼養(yǎng)56天后，其咽骨和牙齒的礦物質(zhì)密度下降，破骨細(xì)胞被激活。在國際空間站飼養(yǎng)60天的青鳉魚頜骨組織的全轉(zhuǎn)錄組分析中，糖皮質(zhì)激素受體(GR)下游的幾個基因在飛行組中顯著上調(diào)。此外，我們發(fā)現(xiàn)15個線粒體相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)，電鏡下可見破骨細(xì)胞線粒體圓度較低。因此，我們的研究為微重力下骨丟失的調(diào)控提供了新的見解。

材料與方法

本研究使用的是青鳉魚(O. latipes)的自交系野生型Cab。實(shí)驗(yàn)按照日本宇宙航空研究開發(fā)機(jī)構(gòu)(JAXA)機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)的政策和方案進(jìn)行。將魚置于28℃光照14 h /黑暗10 h的光照條件下飼養(yǎng)。采用隨機(jī)雜交法獲得魚卵，并保持上述溫度不變。胚胎采集后在28℃孵育。孵化后置于室溫下孵育。早前，我們通過將用于顯示破骨細(xì)胞的TRAP-GFP系與用于顯示成骨細(xì)胞的Osterix-DsRed系交配，建立了雙轉(zhuǎn)基因青鳉魚，并利用了這雙轉(zhuǎn)基因系中的雜合子青鳉魚。

青鳉魚于1994年搭乘航天飛機(jī)升空，在第二個國際微重力實(shí)驗(yàn)室交配并維持了15天。至于青鳉魚的破骨細(xì)胞，我們之前報道了多核破骨細(xì)胞位于咽齒區(qū)域，通過使用TRAP啟動子-GFP轉(zhuǎn)基因系來觀察破骨細(xì)胞，以研究骨重建過程中的骨吸收。此外，通過使用Osterix啟動子-DsRed轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，成骨細(xì)胞被可視化。

將312條生長水平相近的TRAP-GFP/Osterix-DsRed雙轉(zhuǎn)基因青鳉(參照鱗生長確定)帶至貝Baikonur空間站，飼養(yǎng)至從頭尖到尾鰭尖的總長度為16 mm。在此期間，以總長度為指標(biāo)檢查青鳉的生長水平，并將生長水平較高的青鳉作為一組在同一水箱中飼養(yǎng)。最后，采用旋轉(zhuǎn)儀對青鳉視力進(jìn)行檢查，由4名裁判員對青鳉視力進(jìn)行評定，并將青鳉分為4個等級。其中，16條魚(孵化6周后)被選擇在國際空間站(ISS)長期飼養(yǎng)，另外8條魚在抵達(dá)ISS后被選擇作為mRNA來源。2012年10月23日，聯(lián)盟號(編號32S)于10:51(格林尼治時間)從Baikonur發(fā)射。

視覺測試是根據(jù)早期使用青鳉進(jìn)行的飛行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的。這些魚被放在一個圓形的魚缸里，魚缸的旋轉(zhuǎn)墻壁上畫著黑白相間的垂直條紋。當(dāng)墻旋轉(zhuǎn)時，魚有一種跟隨條紋游動的傾向，從而在魚缸周圍游動。有良好視力的魚會在魚缸周圍游來游去，即使魚缸的墻壁旋轉(zhuǎn)得很快，而視力差的魚很快就會看到旋轉(zhuǎn)的條紋變得模糊而停止移動。

水生棲息地是由JAXA根據(jù)用于航天飛機(jī)的水生動物設(shè)施開發(fā)的。這個水生棲息地被用來飼養(yǎng)小型淡水魚，如青鳉或斑馬魚，它們可以在太空中生活90天。該棲息地由一個封閉的水循環(huán)系統(tǒng)組成，該系統(tǒng)包括一個水循環(huán)單元、用于交換循環(huán)水中溶解氣體的氣體交換器、一個用于水凈化的生物過濾器和2個作為魚類棲息地的水族箱。水循環(huán)裝置包括水泵、流量傳感器、溫度控制器和用于控制魚類居住環(huán)境的蓄能器。水循環(huán)系統(tǒng)總水量為3.2 L，每個水族箱水量為0.7 L。水族館有一個自動喂食器，為魚提供人工粉狀食物。此外，每個水族館都配備了一個LED燈，用于產(chǎn)生晝夜周期，以及一個用于觀察魚類的CCD相機(jī)。在JAXA的主頁上顯示了水生棲息地的輪廓和流動示意圖。這些組件在國際空間站的日本實(shí)驗(yàn)艙(JEM)的多用途小有效載荷架(MSPR)中組裝。

魚類在水生棲息地生活期間，水溫保持在25.5 ~ 26℃，每個水族箱的水量控制在0.1 L / min。通過與艙室氣體交換，使溶解氧飽和度保持在90%以上，采用硝化菌生物過濾器控制水質(zhì)。宇航員每周用試紙檢查水質(zhì)1 ~ 2次，在實(shí)驗(yàn)過程中沒有氨或亞硝酸鹽的積累。使用白色LED燈獲得晝夜周期，控制在光照14小時(380 lux)和暗光照10小時(10 lux;這種昏暗的光被用于魚類的背光反應(yīng))。通過水族箱內(nèi)的自動喂食器，每天2次或3次給魚喂食Otohime B-1和Kyowa N250和N400三種粉狀食物。

青鳉魚被放置在“載魚器”中，并乘坐聯(lián)盟號TMA-06M(俄羅斯聯(lián)邦航空公司)飛行。抵達(dá)國際空間站(ISS)的日本空間實(shí)驗(yàn)室KIBO后，青鳉被運(yùn)送到“多用途小有效載荷架(MSPR)”的“水生棲息地(AQH)”進(jìn)行機(jī)載飼養(yǎng)。考慮到魚類的背光響應(yīng)，從魚缸的上方照明。從儲罐底部自動分配進(jìn)料。使用過濾器來自動澄清水。隨后，在選定的時間，魚被“捕魚器”捕獲并運(yùn)輸?shù)健棒~固定裝置”，用于分析組織學(xué)或mRNA表達(dá)。

最初，每個水族箱飼養(yǎng)8條魚。飼養(yǎng)14 d后，用3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(三卡因)麻醉6條魚，用多聚甲醛(PFA)固定，3 d后洗滌，4℃保存在ISS的冰箱中。這6條魚樣本是2012年11月19日由聯(lián)盟號帶到地球的。在開始飼養(yǎng)56天后，另采集6條魚用于PFA固定，4天后洗滌，然后在4℃保存。此外，飼養(yǎng)開始后60天，剩余4條魚使用RNAlater (Sigma-Aldrich, MO, USA)處理，并在ISS中保存在- 95℃。返回地球后，PFA固定的標(biāo)本被沖洗幾次，并儲存在鈣酸鹽緩沖液中。這些標(biāo)本在整個實(shí)驗(yàn)期間保持在4℃或- 95℃，并從莫斯科轉(zhuǎn)運(yùn)到日本。在飼養(yǎng)條件下，在相同的時間過程實(shí)驗(yàn)中，在地面上采樣相同數(shù)量的魚類作為對照。對照組除航天飛行外，其余條件與飛行組相同。

為了比較地面組和飛行組青鳉魚的行為，在60d的實(shí)驗(yàn)中，每天用CCD攝像機(jī)記錄2 ~ 3次視頻。

對整條青鳉進(jìn)行軟X射線成像(Sofron sro-M50, Sofron Co.， ltd.東京，日本)。采用ImageJ軟件測量白信號強(qiáng)度。咽骨區(qū)域的灰度值通過頭內(nèi)區(qū)域的背景進(jìn)行校正。

應(yīng)用圖像分析軟件(TRI/3D-view, Ratoc System Engineering, Tokyo, Japan)獲得咽骨和椎骨的三維重建圖像，分析微焦計(jì)算機(jī)斷層掃描(μ-CT;ScanXmate-E090 [147 μA, 48 kV];Comscan，神奈川，日本)。部分咽骨樣本采用SCANCO Medical μCT 35系統(tǒng)(145 μA, 55 kV, Nippon densi - SCANCO Medical, Brüttisellen, Switzerland)進(jìn)行高分辨率圖像分析，該系統(tǒng)具有3.5 μm的各向質(zhì)體素大小。采用日本denshio -Scanco Medical公司的Scanco μCT Version 6.1軟件對圖像進(jìn)行重建和分析，獲得病灶平均厚度。采用外周定量ct (peripheral quantitative computed tomography, pQCT;XCT Research SA+;準(zhǔn)直器B，戰(zhàn)略醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，普福爾茨海姆，德國)。由于青鳉魚脊椎的礦物質(zhì)含量遠(yuǎn)低于嚙齒動物的骨骼，我們建立了新的骨密度測定標(biāo)準(zhǔn)。因此，不能采用690 mg/cm³作為骨皮質(zhì)與骨小梁分離的標(biāo)準(zhǔn)。骨密度被認(rèn)為是局部骨密度超過100 mg/cm³的骨段。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用非配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。被認(rèn)為是顯著的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.05)。

用PFA固定的標(biāo)本用80%的甘油平衡。采用激光共聚焦顯微鏡(Olympus, Center Valley, PA;FV1000)。所有連續(xù)圖像在咽骨和椎骨的間隔均為2 μm。對每個組織的范圍進(jìn)行足夠的調(diào)整以包含組織的熒光。第56天上咽骨覆蓋130片，下咽牙和骨覆蓋140片。第56天的椎骨被90個切片覆蓋。通過Volocity Demo (Perkin Elmer)軟件計(jì)算GFP和DsRed表達(dá)細(xì)胞的體積。我們避免了顏料熒光信號作為背景。

完成CLSM檢查后，從每只青鳉魚采集一對附著牙齒的下咽骨，分為左、右兩半。這些標(biāo)本通過一系列上升的乙醇脫水，嵌入Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmBH, wehheim /Ts，德國)，并在低溫下聚合。將下咽骨和牙齒的Technovit固化塊連續(xù)切成4 μm厚的切片，并進(jìn)行von Kossa染色。在pH 5.8(37℃30 ~ 45 min)條件下，偶氮染色法檢測抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。收集連續(xù)切片的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)字顯微照片，采用計(jì)算機(jī)軟件(Photoshop 7.0或CS5 Extended, Adobe, USA)分別統(tǒng)計(jì)von Kossa陽性結(jié)構(gòu)(Kossa區(qū))和TRAP陽性結(jié)構(gòu)(TRAP區(qū))的表面積(像素?cái)?shù))。計(jì)算飼養(yǎng)56 d組的Kossa/TRAP區(qū)域像素比。飼養(yǎng)14 d組，計(jì)算TRAP面積/整個單位面積的像素比。正常青鳉魚的咽骨和牙齒在相同的時間和正常重力下的攝食條件下被同樣處理和檢查，并作為對照。利用計(jì)算機(jī)軟件DeltaViewer對von kossa陽性礦化結(jié)構(gòu)和TRAP陽性破骨細(xì)胞進(jìn)行三維重建。

每條魚的一對上咽骨和牙齒的一半在中和10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脫鈣1周，然后石蠟包埋和切片。

對于免疫組織化學(xué)，我們使用了以下一抗:1∶1000的山羊抗gfp抗體(fitc標(biāo)記)(abcam, ab6662)、1∶1000的兔抗dsred抗體(Living Colors, 632496)和1∶200的兔抗pfak抗體(Invitrogen, 44624G)。二抗為1:1000的山羊抗兔Cy-3抗體(Jackson ImmunoResearch 711-165-152)。

在防止與2% BSA/TBS非特異性結(jié)合后，將切片與初級抗體在4℃反應(yīng)過夜，然后與二級抗體和DAPI在室溫下孵育30分鐘。采用激光共聚焦顯微鏡(Olympus, Center Valley, PA;FV1000)。

收集咽骨和牙齒連續(xù)切片的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)字顯微照片，使用計(jì)算機(jī)軟件(Photoshop CS4或ImageJ)分別測定抗gfp、抗dsred和抗pfak抗體反應(yīng)區(qū)域的熒光面積(像素?cái)?shù))和熒光強(qiáng)度(平均值)。我們從總DsRed信號中剔除了牙芽中的DsRed陽性信號，因此我們只在56天飼養(yǎng)組的咽骨中使用DsRed信號。

為了顯示膠原基質(zhì)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用Azan染色試劑盒(Muto Pure Chemicals Co.，ltd)的試劑對石蠟切片進(jìn)行染色。隨機(jī)選取牙胚，用計(jì)算機(jī)軟件(Photoshop CS4)確定藍(lán)色區(qū)域。

cDNA測序用于全轉(zhuǎn)錄組分析(Takara bio)。使用TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (illuminakk.co.jp)構(gòu)建cDNA文庫。以PolyA+RNA片段為模板合成雙鏈cDNA。序列數(shù)據(jù)使用HiSeq系統(tǒng)(illuminakk.co.jp)和序列庫進(jìn)行分析。

從用RNAlater保存的頜骨中提取總RNA，用PrimeScript RT試劑盒合成cdna并進(jìn)行g(shù)DNA Erase (TaKaRa)處理。RT-PCR檢測按照說明書使用EX Taq (TAKARA)進(jìn)行。引物序列如下:fkbp5f、tgtccagggtttgatgtggga;fkbp5r GTTCTTTGCGTTCCCGACTG;ddit4f GTCCAACAATGGCAGCAGAA;ddit4r TTCCTCCAGTGGGTCAAAGAA;gapdhf CTTGGATACACAGAGGACCAGG;gapdhr、GCCAAACTCATTATCGTACCAT。

結(jié)果

首先，我們建立了TRAP啟動子-GFP /Osterix啟動子-Dsred雙轉(zhuǎn)基因青鳉魚，因?yàn)樵谠撧D(zhuǎn)基因系中，咽部除牙芽外的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞被2個熒光信號分隔。從312尾魚中，按照無病、大小與生長發(fā)育一致、視力良好3個標(biāo)準(zhǔn)，篩選出24尾總長16 mm(孵化后6周)的候選魚。這24條候選魚類被運(yùn)送到太空，并在國際空間站“Kibo”部分的AQH(水生棲息地)飼養(yǎng)了2個月。在AQH中開始飼養(yǎng)后，在第0天和第60天分別從8條魚和4條魚中分離出RNA，在國際空間站的宇航員的幫助下，在第14天和第56天分別用PFA固定了6條魚(補(bǔ)充表1)。 

為了觀察青鳉魚對微重力環(huán)境的適應(yīng)，我們在兩個月的時間里拍攝了青鳉魚的獨(dú)特行為(圖1A)。在第0天的觀察中，即運(yùn)輸?shù)紸QH后的第1天，觀察到魚在水中緩慢游動，很少出現(xiàn)“繞圈行為”，即在水中緊密地繞圈游動，這表明魚有能力適應(yīng)微重力環(huán)境(補(bǔ)充視頻1)。在第14天，在被PFA固定之前，魚垂直和繞圈游動，表現(xiàn)出倒立的行為，似乎表明它們試圖在微重力下以適當(dāng)?shù)淖藙葸M(jìn)食或游泳(補(bǔ)充視頻2)。第27天，在微重力條件下成功誘導(dǎo)魚交配(補(bǔ)充視頻3)。有趣的是，青鳉在第47天變得不動，這表明它們表現(xiàn)得像運(yùn)動功能低下的動物(補(bǔ)充視頻4)。這些視頻展示了為適應(yīng)微重力而特定的異常行為，表明飛行魚和宇航員一樣發(fā)生了生理變化。

為了檢查骨組織，在第14天和第56天，將青鳉魚用4%多聚甲醛固定(圖1B)。地面組和飛行組的總長度測量(飼養(yǎng)前5天，飼養(yǎng)開始后14天和56天)顯示出相同的生長趨勢(圖1C)。在咽部牙齒的發(fā)育方面，微重力暴露的青鳉在第14天的牙齒數(shù)量略低于地面組，但在第56天的牙齒數(shù)量幾乎與地面組相同(補(bǔ)充圖1)，這表明從牙胚形成的角度來看，飛行組的牙齒發(fā)育是正常的。 

為了評價微重力下的礦化，我們對整魚進(jìn)行了軟x射線分析(圖2A)。飛行魚組第56天，與地面對照相比，咽骨區(qū)域的鈣化區(qū)域(白色信號)減少(圖2B、C)，而第14天的鈣化無顯著差異(補(bǔ)充圖2)。上咽骨和牙齒區(qū)域的礦物質(zhì)密度接近。與地面組相比，pQCT分析降低了24%(圖2D，地面組:129.417±13.904 mg/cm3 n = 6，飛行組:98.14±19.265 mg/cm3 n = 5, p < 0.05)。此外，μCT成像顯示飛行組青鳉魚的骨骼較薄(圖2E)。對于椎體骨，其骨密度略有下降(補(bǔ)充圖3)。此外，在另一個鈣化區(qū)域，耳石的骨密度在飛行樣本和對照樣本之間沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。

由于TRAP是破骨細(xì)胞的標(biāo)記物，osterix是成骨細(xì)胞的標(biāo)記物，因此我們采用激光共聚焦掃描顯微鏡對第56天的整個上、下咽骨進(jìn)行成像(圖3A、B)。由于細(xì)胞體積是除吸收表面積外反映骨吸收能力的重要參數(shù)，根據(jù)理論計(jì)算細(xì)胞融合和骨吸收能力，利用軟件測量熒光TRAP-GFP和Osterix-DsRed的體積。通過對GFP(圖3C,D)和DsRed(圖3E,F)體積的定量分析，飛行組的GFP體積增加尤為明顯。由于咽骨的大小不同，破骨細(xì)胞的體積被成骨細(xì)胞的體積歸一化，結(jié)果是GFP體積除以DsRed體積的相對比率在飛行過程中增加(圖3G,H)。這一發(fā)現(xiàn)表明，飛行組青鳉魚的破骨細(xì)胞體積比表達(dá)osterix的成骨細(xì)胞體積增大。然而，椎體的熒光成像顯示只有輕微但沒有顯著的破骨細(xì)胞增大(補(bǔ)充圖4)。接下來，為了檢測上咽骨中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和面積，我們使用抗GFP和抗DsRed抗體進(jìn)行了雙重免疫染色(圖3I)。飛行組第56天的破骨細(xì)胞信號除以成骨細(xì)胞信號的比值計(jì)算出的相對熒光強(qiáng)度比地面組增加了50.4%(圖3J)，飛行組的破骨細(xì)胞區(qū)域除以成骨細(xì)胞信號計(jì)算出的相對熒光面積比地面組增加了23.8%(圖3K)。另一方面，只有飛行組的熒光強(qiáng)度在第14天增加(補(bǔ)充圖5)。連續(xù)切片的全三維重建顯示，飛行組青鳉魚的GFP信號增強(qiáng)(補(bǔ)充視頻5)。由于破骨細(xì)胞是通過細(xì)胞融合而成熟的，我們確定了幾種具有不同核數(shù)的GFP陽性破骨細(xì)胞的數(shù)量，例如，1個核(單個核)，每個細(xì)胞2個核(圖3L)，每個細(xì)胞10個細(xì)胞核(圖3M)等，并統(tǒng)計(jì)了含有這些細(xì)胞核數(shù)量的trap - gfp陽性細(xì)胞的數(shù)量(圖3N和補(bǔ)充表2)。這一結(jié)果表明，雖然核總數(shù)在地面組和飛行組之間沒有顯著差異(圖3O)，但在微重力條件下，多核增加了。三維成像顯示飛行組上、下咽骨全區(qū)域破骨細(xì)胞熒光信號增強(qiáng)(補(bǔ)充視頻6)。

接下來，為了檢測負(fù)責(zé)骨吸收的酶活性，我們在第14天對下咽骨進(jìn)行了TRAP染色(補(bǔ)充圖6A-H)。以單位面積表示的TRAP陽性面積在飛行組中增加(補(bǔ)充圖6I)。TRAP染色標(biāo)本的3D成像顯示了飛行組的動態(tài)骨吸收(補(bǔ)充圖7)。此外，第56天的下咽骨被切片并染色以檢測TRAP活性，并使用Von Kossa檢查骨吸收與骨礦化面積的比例(圖4A)。結(jié)果顯示該相對比率的增加(圖4B);飛行組的三維成像顯示trap陽性區(qū)域的聚集，表明那里存在大的破骨細(xì)胞(圖4C;補(bǔ)充視頻7)。這一發(fā)現(xiàn)與3D成像發(fā)現(xiàn)的飛行組下咽骨中GFP陽性細(xì)胞的面積增加一致(補(bǔ)充圖8)。因此，von Kossa染色中發(fā)現(xiàn)了一個缺口，表明礦物質(zhì)可能從骨中溶解(圖4C)。接下來，我們進(jìn)行了電子顯微鏡分析，以檢測破骨細(xì)胞細(xì)胞器的形態(tài)變化。我們的結(jié)果顯示，在飛行組頜骨中，破骨細(xì)胞中的線粒體呈低圓度(圖4D和補(bǔ)充圖9)。

為了研究飛行期間骨質(zhì)流失的分子機(jī)制，我們從第60天的青鳉魚頜骨中提取RNA，cDNA測序后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。不幸的是，由于難以使用RNAlater保存喉后部的組織，從咽骨中提取的RNA似乎已發(fā)生降解。頜骨和牙齒的骨被破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞重塑，類似于咽骨的重塑(補(bǔ)充圖10)。根據(jù)我們的結(jié)果，成骨細(xì)胞基因的表達(dá)減少，包括osterix和1型膠原蛋白的表達(dá)(補(bǔ)充表3)。azan染色顯示飛行組基質(zhì)中膠原蛋白的量有減少的趨勢(補(bǔ)充圖11)，盡管通過電子顯微鏡檢查的成骨細(xì)胞形態(tài)在地面組青鳉魚和飛行組青鳉魚之間沒有差異(補(bǔ)充圖12)。此外，RANKL和NFATc1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示)，表明飛行組青鳉魚的破骨細(xì)胞沒有在成骨細(xì)胞的支持下被激活。

為了發(fā)現(xiàn)異常線粒體結(jié)構(gòu)對破骨細(xì)胞的影響，我們檢測了線粒體相關(guān)分子，包括糖皮質(zhì)激素受體(GR)通路。在轉(zhuǎn)錄組測序中，fkbp5和ddit4被發(fā)現(xiàn)是飛行組中轉(zhuǎn)錄水平升高最高的基因。有趣的是，fkbp5在許多器官如鱗片、軀干的一部分、腦、肝、卵巢和腸(Mitani博士，個人交流)以及飛行組的頜骨中被強(qiáng)烈和廣泛地誘導(dǎo)，通過RT-PCR分析證實(shí)了fkbp5的轉(zhuǎn)錄水平升高(補(bǔ)充表3和圖5A,B)。fkbp5和ddit4被認(rèn)為是GR下游的分子，據(jù)報道GR可被剪切應(yīng)力激活。由于剪切應(yīng)力上調(diào)FAK的磷酸化，我們使用抗磷酸化FAK (pFAK)檢測其在破骨細(xì)胞中的磷酸化狀態(tài)，并使用抗GFP抗體測定破骨細(xì)胞面積(圖5C)。pFAK信號通過除以GFP陽性面積進(jìn)行歸一化(圖5D,E)，結(jié)果表明pFAK信號在飛行期間增強(qiáng)。這一結(jié)果表明，微重力對飛行組產(chǎn)生了應(yīng)力。此外，與地面對照組相比，15個線粒體相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)至少1.2倍(P < 0.05;補(bǔ)充表3)，破骨細(xì)胞相關(guān)基因cebpb、fosl1、fosB、c-fos和junb-b的表達(dá)較地面對照組增加至少1.5倍(P < 0.05;補(bǔ)充表3)。這些結(jié)果表明，在飛行組青鳉魚中，活化的破骨細(xì)胞中線粒體生物發(fā)生增強(qiáng)。

通過破骨細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號計(jì)算破骨細(xì)胞體積，免疫染色法檢測抗GFP抗體陽性面積，TRAP染色法檢測酶活性，觀察飛行組和地面對照組破骨細(xì)胞活性的變化。所有這3種方法都顯示了咽骨區(qū)域的破骨細(xì)胞激活。飛行組第56天的多核破骨細(xì)胞數(shù)量增加，但GFP陽性細(xì)胞核總數(shù)無明顯變化，表明在第56天的微重力環(huán)境下，破骨細(xì)胞分化并未增強(qiáng)，但促進(jìn)了破骨細(xì)胞融合過程。這些結(jié)果表明，在航天飛行中，已經(jīng)定位于骨表面的破骨細(xì)胞被激活，這與報道中宇航員負(fù)重部位的BMD特異性降低，更多的局部重塑部位受破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)一致。

雖然有報告顯示，在太空飛行期間，人類淋巴細(xì)胞系的線粒體發(fā)生了改變，但沒有報告表明在體內(nèi)或破骨細(xì)胞中發(fā)生這種影響的結(jié)果。目前，我們在飛行組的頜骨組織中發(fā)現(xiàn)了線粒體異常，包括線粒體基因上調(diào)和破骨細(xì)胞線粒體圓度降低(細(xì)胞器形態(tài)的改變)。最近研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞線粒體中的ATP協(xié)同調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞存活和骨吸收。飛行組的表型一致表明，在微重力條件下，破骨細(xì)胞的活化可能受線粒體反應(yīng)的調(diào)節(jié)。如前所述，航天飛行會導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量和活性的下降。在我們的結(jié)果中，成骨細(xì)胞也輕度失活，盡管成骨細(xì)胞線粒體的圓度沒有顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明破骨細(xì)胞比成骨細(xì)胞受重力變化的影響更大。

在轉(zhuǎn)錄組分析中，我們發(fā)現(xiàn)在糖皮質(zhì)激素受體(GR)下游的fkbp5和ddit4基因表達(dá)上調(diào)。此前有報道稱，剪切應(yīng)力可激活GR及其轉(zhuǎn)錄信號通路。我們的結(jié)果一致地顯示了pFAK水平的增強(qiáng)，而已知剪切力通過整合素信號通路在破骨細(xì)胞中增加了pFAK水平，這表明破骨細(xì)胞受微重力下指定的剪切應(yīng)力的調(diào)節(jié)。雖然遺傳學(xué)研究主要確定了FKBP5在抑郁癥中發(fā)揮作用，并且體外研究表明，破骨細(xì)胞中FKBP5的過表達(dá)誘導(dǎo)骨吸收上調(diào)，并且糖皮質(zhì)激素治療可增加破骨細(xì)胞中FKBP5的基因表達(dá)水平。關(guān)于DDIT4在骨生物學(xué)中的作用，有報道稱包括DDIT4在內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，在破骨細(xì)胞對骨基質(zhì)相關(guān)的骨吸收的研究中，發(fā)現(xiàn)fkbp9和ddit4的基因表達(dá)水平在破骨細(xì)胞中上調(diào)。此外，各種形式的應(yīng)激誘導(dǎo)FKBP5或DDIT4。綜上所述，我們的結(jié)果表明，在太空的微重力環(huán)境下，破骨細(xì)胞靠近的骨周圍微環(huán)境的改變導(dǎo)致了破骨細(xì)胞線粒體的形態(tài)改變，從而激活了控制FKBP5和DDIT4表達(dá)的GR通路，從而增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的多核形成。未來，我們希望再次進(jìn)行空間實(shí)驗(yàn)，以更詳細(xì)地闡明機(jī)制。

為了考慮微重力下的生理變化，對青鳉魚的異常行為進(jìn)行了拍攝。從視頻中可以看出，這種魚通過倒立、垂直、繞圈等獨(dú)特的行為習(xí)慣了微重力下的生活。此外，我們發(fā)現(xiàn)青鳉魚在微重力環(huán)境下33天的交配行為與在地球上沒有什么不同，表明青鳉魚已經(jīng)適應(yīng)了微重力環(huán)境。我們在第47天發(fā)現(xiàn)了靜止的行為，這是微重力下適應(yīng)的一種有趣的表型。事實(shí)上，太空飛行給動物造成了慢性應(yīng)激，損害了生理功能，它減少了機(jī)械使用，導(dǎo)致動力減退和運(yùn)動減退。這種效應(yīng)表明，在微重力環(huán)境下存在一些導(dǎo)致骨質(zhì)流失的主要因素，其情況類似于地面上的廢用性骨質(zhì)疏松癥。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，在微重力條件下，破骨細(xì)胞的生理功能受損，機(jī)械使用減少，以及在微重力條件下的應(yīng)力作用下，破骨細(xì)胞的活化。我們目前的研究結(jié)果提供了更好的理解骨對失重的反應(yīng)，并揭示了微重力下調(diào)節(jié)骨生理的潛在機(jī)制。

原文地址：https://www.nature.com/articles/srep14172#MOESM1