影響因子：8.1
魚類與人類具有共同的神經(jīng)遞質(zhì)通路，表現(xiàn)出顯著的保守性和同源性。因此，暴露于氟西汀使魚類可能易受生化和生理變化的影響，這與在人類身上觀察到的情況類似。多年來，多項研究證實了氟西汀對不同魚類和不同水平生物組織的潛在影響。然而，親代暴露于未暴露的后代的影響仍在很大程度上未知。以斑馬魚為模式生物，評估親代暴露于相關(guān)濃度(100和1000 ng/L)的氟西汀15天對后代的影響。親代暴露導(dǎo)致子代早孵化，游泳囊不膨脹，畸形頻率增加，心率和血流量降低，生長發(fā)育減慢。此外，還發(fā)現(xiàn)了顯著的行為損傷(早期階段的驚嚇反應(yīng)減少、基礎(chǔ)運(yùn)動活動和非聯(lián)想學(xué)習(xí)改變，后期階段的負(fù)向地趨和暗趨、趨觸減少和反社會行為)。這些行為改變與焦慮降低、單胺能基因slc6a4a (sert)、slc6a3 (dat)、slc18a2 (vmat2)、mao、tph1a和th2表達(dá)顯著增加以及單胺能神經(jīng)遞質(zhì)水平改變一致。行為、單胺能基因表達(dá)和神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變持續(xù)至子代成年。鑒于魚類和人類之間的神經(jīng)元通路高度保守，數(shù)據(jù)顯示了藥物暴露產(chǎn)生潛在跨代和多代效應(yīng)的可能性。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在現(xiàn)實情況下對魚類進(jìn)行跨代和多代研究的必要性，從而為了解這些藥物的影響提供現(xiàn)實的見解。
由于藥品生產(chǎn)和消費(fèi)造成的日益嚴(yán)重的水生污染一直是一個環(huán)境問題，因為這些生態(tài)系統(tǒng)接收含有這些化學(xué)物質(zhì)和/或其代謝物的廢水，具有未知的生態(tài)影響。選擇性血清素再攝取抑制劑(SSRIs)是處方和消耗最多的抗抑郁藥物，作為新興的環(huán)境污染物而日益受到關(guān)注。這些抗抑郁藥用于治療抑郁癥和其他精神疾病，通過阻斷突觸前神經(jīng)元中的5-羥色胺再攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的5-羥色胺水平(5-羥色胺或5-HT)的細(xì)胞外增加。氟西汀是地表水中最常檢測到的SSRIs之一，估計濃度范圍為0.012 - 1.4 μg/L。此外，氟西汀還能影響生物體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中單胺能系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)的合成、再攝取和代謝。
單胺能系統(tǒng)在包括魚類在內(nèi)的大多數(shù)脊椎動物中進(jìn)化保守，在大腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞增殖、遷移、分化、突觸發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生等不同的生理過程。在硬骨魚中，很少有研究了解在一代人中暴露于氟西汀是否會對后代的健康和行為產(chǎn)生影響。一些研究結(jié)果提示，其他污染物對魚類和其他動物物種(如大型水蚤)的行為、神經(jīng)發(fā)育和生殖結(jié)局有潛在的跨代和多代影響。與未暴露于卡馬西平的斑馬魚相比，暴露于卡馬西平(10 μg/L) 6周的斑馬魚在成年期的11-酮睪酮水平、生殖性能、求偶行為、攻擊性和精子形態(tài)均發(fā)生了改變，成年斑馬魚暴露于10 μg/L的卡馬西平和吉非羅齊6周后，其繁殖成功率和繁殖力降低，在清潔水中飼養(yǎng)的F1代后代的求偶行為、形態(tài)和精子速度發(fā)生改變。親代砷暴露改變斑馬魚的運(yùn)動活動，增加焦慮行為，直至F2代，并誘導(dǎo)表觀遺傳改變。Hao等報道，暴露于1和100 μg/L雙酚S的斑馬魚，從3 hpf到120 dpf, F1睪丸DNA甲基化和F2卵巢DNA甲基化增加，導(dǎo)致類固醇生成酶表達(dá)降低，血漿17β-雌二醇升高，睪酮水平降低。Minguez等人研究了舍曲林和文拉法辛(0.3、30和100 μg/L)對magna Daphnia的跨代效應(yīng)，結(jié)果表明舍曲林暴露增加了F0 Daphnia的繁殖力并減少了后代F1的數(shù)量，而文拉法辛暴露降低了后代F0的數(shù)量并提高了F1代對藥物的耐受性。
多項研究表明，氟西汀可在水生生態(tài)系統(tǒng)中產(chǎn)生生物蓄積，并可引起多種影響，影響多種生物的基因表達(dá)、生化和代謝參數(shù)、組織學(xué)、生殖和行為。然而，目前關(guān)于SSRI的跨代效應(yīng)的研究仍然很少。據(jù)我們所知，只有5項研究探討了氟西汀在魚類中的親代和跨代效應(yīng)。這些研究主要關(guān)注子代的行為變化，忽視了遠(yuǎn)期后果。因此，有必要在更廣泛的終點(diǎn)范圍內(nèi)探索長期效應(yīng)。
目前的研究評估了成年斑馬魚暴露于相關(guān)濃度的氟西汀15天是否會影響后代的健康。研究親代暴露對子代胚胎發(fā)育、行為(受精后8天)、遺傳和神經(jīng)化學(xué)特征的影響，以及對子代行為(1、2和3個月)、成年期基因表達(dá)和神經(jīng)遞質(zhì)特征的持續(xù)影響(8個月比3個月)。
材料與方法
成年野生型斑馬魚(AB株，3.1-3.5 cm)來自CID-CSIC斑馬魚設(shè)施的Pisciber BSF (Terrassa, Barcelona)。所有程序均獲得了機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committees)的批準(zhǔn)，并在獲得當(dāng)?shù)卣S可(協(xié)議編號9027)的情況下按照機(jī)構(gòu)指南實施。
鹽酸氟西汀(CAS編號:56296-78-7，分子量345.79 g/mol，純度:>98%)購自荷蘭ChemCruz公司。測試溶液(100和1000 ng/L鹽酸氟西汀)是在實驗當(dāng)天從4 μg/L的原液新鮮制備的魚水。從CID-CSIC設(shè)施中隨機(jī)選取成年斑馬魚(18雌:15雄)，在半靜態(tài)測試條件下分別暴露于100和1000 ng/L鹽酸氟西汀15天，溫度為28.5℃，光周期為12L:12D。測試的濃度范圍覆蓋了地表水中記錄的自然濃度，而采用的暴露時間是基于以下事實:SSRI的抗焦慮效應(yīng)在暴露兩周后顯現(xiàn)(Martin et al.， 2017)。對照魚在相同條件下維持在魚系水中。每種處理進(jìn)行3次實驗，在每個含1.5 L水的玻璃容器中，雄性和雌性分別在不同的容器中(5只雄性和6只雌性)。每個試驗處理共使用33條魚。實驗溶液每48小時更新一次，根據(jù)之前的工作中討論的氟西汀濃度穩(wěn)定性，在當(dāng)天的第一次喂養(yǎng)后30分鐘。每天檢查動物的死亡率，每天喂食兩次。在暴露期結(jié)束時(第15天)，動物在清潔的培養(yǎng)基中沖洗兩次，并轉(zhuǎn)移到養(yǎng)殖池的魚類系統(tǒng)水。第二天早上收集卵子，用魚水清洗，在體視顯微鏡下檢查(Leica Microsystems - Leica eEZ4 16x, 4.4:1)，其中呈現(xiàn)相似發(fā)育階段的胚胎(階段2:囊胚)被選擇并分為兩組:A組-用于胚胎發(fā)育評估，B組-用于后期生命階段的評估。
將受精后4小時(hpf)的斑馬魚胚胎置于含10 mL清潔魚水的6孔板(每孔10個胚胎)中，直至受精后8天(dpf)。每一種情況總共評估了540個胚胎。每48h進(jìn)行1次完全補(bǔ)水。在此期間每天對動物進(jìn)行檢查，并對死亡率和畸形(192 hpf)、早期孵化(48和72 hpf)、游泳膀胱膨脹(96和120 hpf)、心臟活動分析、總體長和行為進(jìn)行評估。
使用DanioScope軟件(Noldus Wageningen，荷蘭)測量斑馬魚幼魚(n = 15個生物/條件)8 dpf的心率和血流活動。幼魚未被麻醉，被固定，并在幻燈片上放置在4%甲基纖維素的側(cè)視圖或腹視圖中。該操作在27°-28°C的隔離行為室中進(jìn)行。使用GigE攝像機(jī)(AVI格式為30 fps;UI-5240CP-NIR-GL，成像開發(fā)系統(tǒng)，德國)。按照Cunha等人的描述，使用DanioScope軟件分析視頻。
為了評估親代暴露于氟西汀對斑馬魚后代總體長的影響，每隔30天(≈1、2和3個月)測量個體(n = 20個生物/條件)。從鼻前部到尾部最后方測量體長。采用Noldus ethvision?XT 15.0軟件測量8 dpf幼魚量。1個月、2個月和3個月的生物用顯微鏡(Nikon SMZ1500, Nikon Instruments INC.)拍攝。使用GIMP 2.10.12軟件進(jìn)行測量(詳見補(bǔ)充資料(圖S1A))。
所有行為學(xué)測試均在27 ~ 28℃的隔離行為室中進(jìn)行。在測試前1小時，魚被轉(zhuǎn)移到行為室，以適應(yīng)該房間。行為學(xué)測試在10:00 ~ 14:00進(jìn)行。所用斑馬魚的總體長相似。
所有的子代(8 dpf幼魚和1個月大的幼魚)的行為分析均按照之前描述的方法，使用由Noldus ethvision?XT 11軟件控制的DanioVision系統(tǒng)(Noldus, Wageningen, Netherlands)(補(bǔ)充材料，更多細(xì)節(jié))進(jìn)行。評估4種不同的行為:振動驚嚇反應(yīng)(VSR)、適應(yīng)(振動刺激)、基礎(chǔ)運(yùn)動活動(BLA)和視覺運(yùn)動反應(yīng)(VMR)。
對于2月齡斑馬魚，新型水箱試驗(NTT)和淺灘試驗(圖S2A和B)分別使用Faria 等人描述的實驗設(shè)置來評估焦慮和社會行為效應(yīng)，并測試每個實驗組的24-27條斑馬魚。在每次測試中，使用放置在實驗水箱前面的GigE相機(jī)(UI-5240CP-NIR-GL，成像顯影系統(tǒng)，德國)記錄6分鐘的視頻(AVI格式，30 fps)，由uEye座艙軟件(成像顯影系統(tǒng)，德國)控制。錄像后使用Noldus ethvision?XT 15.0 (Noldus, Wageningen, Netherlands)軟件進(jìn)行處理。對于NTT，通過分析地理趨動性來單獨(dú)評估焦慮行為，地理趨動性是魚在新環(huán)境(例如新水箱)中表現(xiàn)出的“潛水”行為(圖S2A)。確定在頂層和底層移動的距離(%)、移動總距離(cm)、到頂層的過渡、在頂層和底層停留的時間(%)和凍結(jié)時間(%)。淺灘試驗可以評估社會凝聚力的變化。每種實驗條件(n = 24-27條斑馬魚)的9條魚被用于分組，并確定了平均魚間距離(cm)和最遠(yuǎn)魚間距離(cm)(圖S2B)。測試結(jié)束后，魚被送回斑馬魚養(yǎng)殖箱繼續(xù)生長30天。
對3月齡斑馬魚進(jìn)行行為學(xué)測試:NTT、淺灘活動、社會偏好(SPT)、明暗活動(LDT)和新物體活動(NOT)。視頻錄制設(shè)置、用于錄制和視頻處理的硬件和軟件與上一節(jié)使用的相同。在生命的這一階段，無法區(qū)分后代生物的性別。
SPT包括使用社會刺激來調(diào)查對一群同種個體的行為反應(yīng)。在28℃下使用一個含有5 L魚水的實驗矩形水箱(20 cm長、20 cm寬和25 cm高)實施SPT。左側(cè)放置10條斑馬魚魚群(體長與被測試的魚相似)，右側(cè)放置一個有水的水箱(里面沒有魚，中性刺激)(圖S2C)。在每組24條斑馬魚中單獨(dú)評估SPT。為了進(jìn)行視頻分析，我們將坦克分為3個相等的虛擬區(qū)域:最接近淺灘的區(qū)域、中間區(qū)域和遠(yuǎn)處區(qū)域，以及所行駛的距離，并測量了在每個區(qū)域所花費(fèi)的時間(圖S7)。
LDT是根據(jù)Faria等人的方法進(jìn)行的，用于評估斑馬魚的焦慮行為，即當(dāng)出現(xiàn)輕度厭惡刺激(新奇)時，斑馬魚對黑暗背景的偏好。每個實驗組的24條斑馬魚的行為被單獨(dú)研究，攝像機(jī)被放置在測試水箱的頂部(圖S2D)。分析在白區(qū)和暗區(qū)停留的時間。
NOT是根據(jù)Hamilton等人的實驗設(shè)計進(jìn)行的，用于評估魚的焦慮和大膽程度，使用樂高?人物作為新對象，用魔術(shù)貼固定在競技場中心(圖S2E)。將攝像機(jī)置于測試箱頂部，分別記錄24條斑馬魚的行為，分析3個虛擬區(qū)域(遠(yuǎn)、中、中)的距離和時間(圖S8)。
行為學(xué)測試后，通過熱休克將魚安樂死，并分別收集大腦，冷凍在液氮中，并保存在- 80℃，用于基因表達(dá)和神經(jīng)遞質(zhì)分析。
按照Agra等人的描述進(jìn)行了適用于斑馬魚的呼吸測定。通過對2個月和3個月的后代(每條件和年齡各10條魚)的水中溶解氧水平的定量測定氧耗量。簡單地說，每條魚都被引入一個氣密的50毫升注射器(漢密爾頓，美國)中，其中裝滿了50毫升氧氣飽和的清潔魚水(氧合24小時)，并使用氧計(Strathkelvin Instruments, Glasgow)測量溶解氧水平，該氧計安裝有氧電極(Strathkelvin Instruments, Glasgow)。對每個處理進(jìn)行3個空白對照測試，以校正環(huán)境氧消耗并用作校正因子。
單胺能基因的表達(dá)水平在兩個不同的時間點(diǎn)進(jìn)行評估:8 dpf (A組)和3月齡(B組)。對于8 dpf幼魚的基因表達(dá)分析，使用8個庫，每個處理10條幼魚，對于3月齡生物，使用8個成年斑馬魚大腦(每個處理)。簡而言之，使用Trizol試劑(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)提取所有樣本的總RNA，所有操作均按照之前的描述進(jìn)行。我們在分析前驗證了所選的6個單胺能系統(tǒng)相關(guān)基因(slc6a4a、slc6a3、slc18a2、mao、th2和tph1a)的引物序列(Sigma-Aldrich, Steinheim，德國)的效率和特異性(補(bǔ)充表S1)。
在兩個不同的時間點(diǎn)：8個月(A組)和3個月(B組)，對后代的單胺能神經(jīng)遞質(zhì)水平進(jìn)行評估。對于8個月幼魚的神經(jīng)遞質(zhì)分析，使用了6個池，每組15條幼魚頭部(來自每個處理)，對于3個月生物，使用了6個成年斑馬魚大腦(來自每個處理)。神經(jīng)遞質(zhì)水平通過之前研究中描述的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析。采用MassLynx v4.1軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS v28 (Statistical Package 2010;芝加哥,IL)。采用Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk檢驗評估正態(tài)性。正態(tài)分布組采用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗。對于不符合正態(tài)性的組，我們使用了Kruskal-Wallis檢驗，隨后使用了Dunn多重比較檢驗。使用Microsoft Excel 2016繪制3個獨(dú)立實驗的數(shù)據(jù)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，p < 0.05的值表示統(tǒng)計學(xué)顯著性。
結(jié)果
親代暴露于氟西汀對子代死亡率沒有顯著影響(圖1D)。但對胚胎發(fā)育有影響。在孵化率方面，觀察到濃度之間的統(tǒng)計學(xué)顯著差異，其中暴露父母的后代在48 hpf的孵化率顯著高于對照組(圖1A)。在96 hpf和120 hpf時，氟西汀子代的魚鰾膨脹顯著延遲(圖1B)。此外，還觀察到了畸形的發(fā)生(頭部、眼睛和尾部畸形以及心包和卵黃囊水腫)，在暴露于100 ng/L氟西汀的后代中觀察到顯著增加(圖1C)。氟西汀對子代的心率和血流活動也有影響，100和1000 ng/L時心率和血流活動均顯著降低(圖1E，F)。
幼魚總體長在8日齡和1月齡時受到影響。8日齡時，在兩種氟西汀濃度下，幼魚的總體長均顯著減少(圖2)，而在兩種濃度下，1個月大的后代顯著大于對照組(圖2)。在2月齡和3月齡的后代中，未觀察到與對照組的差異。
熱圖(圖3)顯示了振動驚嚇反應(yīng)(VSR)、習(xí)慣化、基礎(chǔ)運(yùn)動活動(BLA)和視覺運(yùn)動反應(yīng)(VMR)的結(jié)果。8 dpf幼魚的所有行為反應(yīng)均顯著受損，而1月齡后代僅影響B(tài)LA和VMR。
在8 dpf的幼魚中，當(dāng)振動刺激濃度為1000 ng/L時，VSR顯著降低，而振動刺激的適應(yīng)所需時間顯著增加。幼魚BLA在兩種濃度下均下降，而VMR表現(xiàn)為雙相反應(yīng)，氟西汀濃度為100 ng/L時幼魚由亮轉(zhuǎn)暗誘發(fā)的逃避反應(yīng)減少，濃度為1000 ng/L時幼魚由亮轉(zhuǎn)暗誘發(fā)的逃避反應(yīng)增加。
在1月齡斑馬魚中，當(dāng)VMR濃度為1000 ng/L時，BLA含量顯著增加。
100 ng/L和1000 ng/L的后代NTT顯示魚類具有負(fù)趨地性，在池頂移動的距離顯著增加，底層探索減少(圖4A)。在每一層的時間上，我們觀察到類似的反應(yīng)模式，魚在魚缸頂部的時間更多，在底部的時間更少(圖4A)。在整個罐內(nèi)移動的總距離方面，兩種氟西汀濃度均顯著降低(圖S5A)。此外，在1000 ng/L氟西汀的后代中也觀察到向頂端過渡的數(shù)量有減少的趨勢(圖4B)，以及凍結(jié)行為，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A)。100 ng/L氟西汀暴露組的子代魚群的平均魚間距離和最遠(yuǎn)距離均顯著增加(圖4C)(詳細(xì)圖見補(bǔ)充材料(圖S3))。
3月齡子代的NTT結(jié)果與2月齡子代的NTT結(jié)果相似。1000 ng/L條件下的3個月子代表現(xiàn)出負(fù)趨地性，在水箱頂層移動的距離顯著增加，在底層移動的距離顯著減少(圖4A)。在兩層中所花費(fèi)的時間也可以觀察到這種反應(yīng)模式(圖4A)。在整個水箱中移動的總距離中，觀察到1000 ng/L氟西汀的后代顯著減少(圖S5B)。此外，在1000 ng/L氟西汀的后代中也觀察到向頂端過渡的次數(shù)有減少的趨勢(圖4B)，以及在氟西汀暴露的后代中觀察到凍結(jié)行為有下降的趨勢(圖4A)。
在3個月時，通過第二次LDT檢測，分析親代暴露于氟西汀對子代焦慮樣行為的影響。我們在暴露于兩種劑量氟西汀的親代生物的后代中觀察到陰性的暗趨化，在白色場地的時間顯著增加。
除了向地趨向性和向暗趨向性，膽量還可以提供動物焦慮水平的信息。在NOT的3個月子代中，膽量顯著增加。如圖4A所示，來自暴露的父母的后代增加了在區(qū)域中心移動的距離，也就是新反對點(diǎn)所在的位置。
當(dāng)對3個月大的魚的社會行為進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)魚群的大小發(fā)生了顯著變化。與對照相比，在1000 ng/L濃度下，平均魚間距離顯著降低，而最遠(yuǎn)的魚間距離在兩種濃度下均降低(圖4C)。3月齡子代的SPT表現(xiàn)也存在顯著差異。兩種氟西汀濃度在最接近同種異體的區(qū)域移動的總距離顯著減少(圖4a)。在時間上，1000 ng/L氟西汀組的斑馬魚后代在同種異體附近的時間明顯少于對照組后代(圖4A)(補(bǔ)充資料的其他詳細(xì)圖(圖S4和S6))。
在2月齡和3月齡的子代中，親代暴露于氟西汀顯著影響其氧耗量，兩種濃度的子代在研究的兩個時間點(diǎn)均顯示出氧耗率顯著增加(圖5)。
我們分析了8日齡(A組)和3月齡(B組)斑馬魚子代5 -羥色胺再攝取(slc6a4a或sert)、單胺能神經(jīng)遞質(zhì)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)(scl18a2或vmat2)、多巴胺再攝取(scl6a3或dat)、5 -羥色胺氧化(mao)和5 -羥色胺和多巴胺合成(分別為tph1a和th2)相關(guān)基因的表達(dá)。8日齡時，親代氟西汀對sert和dat的表達(dá)有明顯影響，1000 ng/L氟西汀組子代sert和dat的表達(dá)上調(diào)。1000 ng/L氟西汀組子代mao表達(dá)增加。在5 -羥色胺和多巴胺合成相關(guān)基因中，與對照子代相比，1000 ng/L的子代tph1a和th2的表達(dá)顯著上調(diào)。親代氟西汀對vmat2的表達(dá)無明顯影響。
在3月齡的魚腦(B組)中，氟西汀子代的單胺能基因表達(dá)水平仍然改變。dat表達(dá)顯著改變，兩種濃度均顯著上調(diào)。vmat2和th2的表達(dá)也受到影響，1000 ng/L氟西汀組vmat2和th2的表達(dá)增加。在mao的表達(dá)方面，父母氟西汀暴露，尤其是100 ng/L的氟西汀可上調(diào)子代mao的表達(dá)。對于sert和tph1a的表達(dá)，盡管有上調(diào)的趨勢，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)顯著的影響?？偟膩碚f，100和1000 ng/L氟西汀組的dat表達(dá)分別增加了47.1和2.0倍。當(dāng)氟西汀濃度為1000 ng/L時，vmat2和th2的表達(dá)分別增加了7.1倍和3.3倍。100 ng/L和1000 ng/L后代的mao基因表達(dá)也增加了7.5倍和1.1倍的變化(其他詳細(xì)圖的補(bǔ)充材料(圖S9))。
熱圖顯示了8日齡(A組)和3月齡(B組)的單胺能神經(jīng)遞質(zhì)水平(圖7)。就8日齡幼魚的5-羥色胺能系統(tǒng)而言，親代暴露顯著影響了5-羥色胺(5-HT)和色氨酸的水平。100 ng/L的子代血清素水平降低，而色氨酸水平顯著升高。
在多巴胺能系統(tǒng)方面，兩種濃度的氟西汀均促進(jìn)了后代多巴胺水平的升高，而高香草酸(HVA)水平顯著降低。神經(jīng)遞質(zhì)酪氨酸呈非單調(diào)反應(yīng)，100 ng/L氟西汀組子代的酪氨酸水平顯著高于對照組和1000 ng/L氟西汀組子代。親代暴露也影響了去甲腎上腺素水平，促進(jìn)了1000 ng/L子代去甲腎上腺素水平顯著升高。
在3個月齡的魚腦(B組)中，氟西汀暴露的后代的單胺能神經(jīng)遞質(zhì)水平仍然與對照組不同。多巴胺、酪氨酸、HVA和色氨酸水平發(fā)生明顯改變，在1000 ng/L時顯著降低。5-HT和去甲腎上腺素水平分別呈下降和上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
親代暴露于污染物可顯著損害生物反應(yīng)(例如行為、生長、生殖、激素水平、酶和基因表達(dá))和后代的生存能力。由于氟西汀是一種具有生物蓄積潛力的藥物，這種SSRI可以轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞。對于胚胎發(fā)育至關(guān)重要的母體因子(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本)向后代的儲存和轉(zhuǎn)移發(fā)生改變，可直接影響后代的健康。本研究的結(jié)果證實，成年魚暴露于環(huán)境濃度的氟西汀可將長期效應(yīng)傳遞給下一代，表明DoHAD范式在魚類中具有潛在的代際遺傳和生態(tài)相關(guān)性。
在斑馬魚中，魚鰾起著維持浮力、呼吸、感知壓力波動、減少深層環(huán)境中的能量消耗的作用，在96 hpf時顯得膨脹。暴露于氟西汀的生物的后代表現(xiàn)出早期孵化和延遲的魚鰾膨脹。其他作者在直接暴露于濃度范圍為0.64 ng/L - 276.6 μg/L的氟西汀24小時至8天的斑馬魚胚胎中發(fā)現(xiàn)了與本研究中觀察到的類似的發(fā)育效應(yīng)。對于本研究中觀察到的發(fā)育效應(yīng)，一個可能的假設(shè)可能與代謝活性低(卵黃囊吸收少)和呼吸頻率低間接相關(guān)。代謝活性低也可能與觀察到的這些生物的低心率、較小的體長和高畸形發(fā)生率有關(guān)。胚胎發(fā)育過程中利用氧氣進(jìn)行氧化呼吸的能力是正常發(fā)育所必需的，因此進(jìn)一步的研究應(yīng)探討氟西汀在魚類早期階段誘導(dǎo)代謝變化的潛力。在魚類發(fā)育的早期階段，甲狀腺激素(THs)水平下降和脫碘酶(參與激活或滅活甲狀腺激素的酶)受到抑制也可導(dǎo)致魚鰾膨脹受損。未來的研究應(yīng)探討TH水平對氟西汀療效的影響。
1000 ng/L氟西汀暴露組仔鼠對聲/振動刺激(或驚跳反應(yīng))反應(yīng)減弱。這些結(jié)果與斑馬魚幼魚直接暴露于同一藥物(從4 hpf到8 dpf或24小時暴露)和其他同類藥物的研究數(shù)據(jù)一致。100 ng/L和1000 ng/L氟西汀暴露組仔鼠的血乳酸也明顯降低，這可能與仔鼠的總體長顯著減少有關(guān)。
習(xí)慣化測試是一種簡單的非聯(lián)想學(xué)習(xí)方法，其基礎(chǔ)是減少對無關(guān)和重復(fù)刺激的反應(yīng)。1000 ng/L氟西汀組仔鼠的習(xí)慣化速度明顯慢于對照組，提示仔鼠存在記憶和學(xué)習(xí)問題。在一項將SSRI藥物舍曲林暴露于斑馬魚幼魚8天的研究中，在濃度低于1 μg/L的情況下觀察到類似的效果。在VMR方面，在本研究中，100 ng/L的子代表現(xiàn)出活性反應(yīng)降低。VMR表明，魚類能夠區(qū)分明暗，這與躲避捕食者有關(guān)。這一結(jié)果與Faria等人(2021b)的結(jié)果一致，F(xiàn)aria等人報告，直接暴露于較高濃度的氟西汀(154.65 μg/L) 24小時后，斑馬魚幼魚的VMR在8 dpf時降低。然而，在1000 ng/L的子代中觀察到的VMR增加，表現(xiàn)出整體尺寸的減小，似乎是一個效應(yīng)，具體激活了參與這種反應(yīng)的一些神經(jīng)元環(huán)路。
在生命后期(青少年和成年)，雖然魚鰾充血延遲不再明顯，但代謝改變?nèi)匀淮嬖冢憩F(xiàn)為后代的高耗氧量、行為改變、基因表達(dá)和單胺能系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)水平改變。
在2個月和3個月大的氟西汀子代中觀察到的氧消耗增加可能表明檸檬酸循環(huán)(或Krebs循環(huán))的可能改變，表明親代暴露于氟西汀對大腦能量代謝的調(diào)節(jié)。因此，未來的研究應(yīng)探討氟西汀和其他SSRIs對Krebs循環(huán)的影響。
在幼年期(1月齡)，1000 ng/L氟西汀處理的仔鼠出現(xiàn)BLA和VMR活動增強(qiáng)。盡管運(yùn)動活動增加，這些青少年的多巴胺水平顯著低于相應(yīng)的對照組。因此，對這些結(jié)果最合適的解釋再次是觀察到的總身長的差異，1000 ng/L氟西汀處理的后代總身長的增加最終導(dǎo)致運(yùn)動能力的增加。關(guān)于氟西汀對幼魚的直接作用的研究也很少。其他作者也發(fā)現(xiàn)直接暴露于氟西汀對光照條件變化的反應(yīng)有影響。1000 ng/L氟西汀暴露12 d后，斑馬魚幼魚在黑暗期的游泳時間增加。對結(jié)果的分析清楚地表明，關(guān)于氟西汀對青少年的潛在影響，無論是直接接觸氟西汀還是父母接觸氟西汀的影響，仍然相當(dāng)缺乏信息，這支持對這一主題的進(jìn)一步研究。
在2月齡子代行為學(xué)上，首先進(jìn)行兩種不同的行為:焦慮樣行為(NTT)和社交行為(淺灘試驗)。這些行為在這個年齡已經(jīng)存在并形成，可能對外部干擾(如壓力和藥物)敏感。據(jù)報道，氟西汀對直接暴露的魚有明顯的抗焦慮作用。在2個月大時，氟西汀的后代表現(xiàn)出負(fù)趨地性，游的距離更長，在水箱頂部停留的時間更長，向水箱頂部的過渡次數(shù)更少，凍結(jié)行為明顯減少。所有這些因素表明氟西汀對暴露于氟西汀的斑馬魚后代具有抗焦慮作用。這種效應(yīng)一直持續(xù)到成年期(3個月)，證明了其持續(xù)性。這些結(jié)果與其他作者直接暴露于氟西汀時觀察到的結(jié)果相似。
成年魚避開明亮區(qū)域(或暗驅(qū))的傾向被抗焦慮藥物逆轉(zhuǎn)，增加了它們對捕食者的脆弱性。在本研究中，暴露于氟西汀的子代魚在3月齡時呈陰性的暗趨化。這一結(jié)果支持NTT數(shù)據(jù)，提示氟西汀具有抗焦慮作用。這些結(jié)果與其他直接暴露于0.01 ~ 100 μg/L氟西汀10 ~ 14天的斑馬魚、青鳉和食蚊魚成蟲的研究結(jié)果一致。
NOT旨在評估新恐懼行為，即對未知物體的恐懼(在我們的研究中，是一個樂高圖形)。在斑馬魚中，自然行為是遠(yuǎn)離這個物體(通過靠近墻壁(觸壁))，它被認(rèn)為是潛在的捕食者。在目前的研究中，兩種氟西汀濃度的后代在最接近圖形的區(qū)域的持久性增加，這一行為與焦慮的減少一致。接近圖形的行為也可以被視為大膽的衡量(主動行為)。主動或大膽的魚會更快地探索新環(huán)境，這種行為與血清素水平的變化和低基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平相關(guān)，導(dǎo)致行為表型的可能調(diào)節(jié)。另一方面，這幅圖也暗示了對捕食者逃跑行為的干擾。
斑馬魚的社會行為貫穿其一生，這使得它們能夠識別同種動物(相同的年齡和體型)，及早發(fā)現(xiàn)捕食者，改善喂養(yǎng)和交配。社會凝聚力受到焦慮狀態(tài)的強(qiáng)烈影響，焦慮性化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致魚群縮小，而焦慮性化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致魚群縮小。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)，暴露于100 ng/L氟西汀的父母在2個月大的幼魚中增加了魚群的大小。然而，當(dāng)在3個月大的生物上進(jìn)行評估時，100和1000 ng/L氟西汀的后代表現(xiàn)出更強(qiáng)的魚群凝聚力。有趣的是，SPT對社會親密度的影響與觀察到的對SPT的影響不同，更符合在來自相同父母的成年人中發(fā)現(xiàn)的焦慮抑制效應(yīng)。由于淺灘試驗和SPT提供了關(guān)于社會行為的不同要素的信息，這些試驗往往提供不同的結(jié)果。SPT結(jié)果與Giacomini等在直接暴露于50 μg/L 15分鐘的斑馬魚成蟲中，以及Ansai等人在暴露于100 μg/L氟西汀10天的青鳉成魚中報告的結(jié)果相似。
所有這些行為的改變都會損害它們躲避捕食者、尋找食物和繁殖的能力，從而影響它們在自然棲息地的生存。
為了闡明與觀察到的子代行為變化相關(guān)的潛在機(jī)制，我們評估了子代的單胺能基因表達(dá)水平。直接暴露于氟西汀可影響單胺能系統(tǒng)，這是調(diào)節(jié)魚類各種腦功能的主要機(jī)制之一，如行為和生理變化。
在8日齡子代幼魚(A組)中，親代暴露導(dǎo)致slc6a4 (sert)， tph1a和mao轉(zhuǎn)錄本上調(diào)。slc6a4編碼SERT, SERT是一種跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)將5-HT從突觸間隙再攝取到突觸前5-羥色胺能神經(jīng)元。tph1a編碼色氨酸羥化酶(5-羥色胺合成中的限速酶)，mao(單胺氧化酶)編碼催化單胺氧化的酶。觀察到的tph1a上調(diào)可能是由5-HT水平降低觸發(fā)，導(dǎo)致色氨酸羥化的正反饋回路，從而導(dǎo)致5-羥色胺水平升高。sert表達(dá)水平的增加也可能與觀察到的5-HT水平降低有關(guān)，表明有大量的這種神經(jīng)遞質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)。這些效應(yīng)可能與觀察到的氟西汀子代的非聯(lián)想學(xué)習(xí)(習(xí)慣化)延遲有關(guān)。與毛納細(xì)胞(位于魚后腦的網(wǎng)狀脊髓中間神經(jīng)元)相關(guān)的5 -羥色胺能系統(tǒng)神經(jīng)元在調(diào)節(jié)非關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)過程中發(fā)揮重要作用，可能受到親代氟西汀暴露的影響。
兒茶酚胺在運(yùn)動調(diào)節(jié)和運(yùn)動系統(tǒng)控制中也起著重要作用，多巴胺能系統(tǒng)的損害會導(dǎo)致硬骨魚的運(yùn)動改變。氟西汀子代的多巴胺和去甲腎上腺素水平以及slc6a3和th2的表達(dá)水平均顯著高于對照組。有趣的是，多巴胺代謝的最終產(chǎn)物HVA的水平下降了。由于th2編碼酪氨酸羥化酶(兒茶酚胺合成中的限速酶)，因此觀察到的該轉(zhuǎn)錄物表達(dá)增加可能與觀察到的多巴胺和去甲腎上腺素的增加直接相關(guān)。slc6a3基因編碼DAT(多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體)，這是一種跨膜蛋白，負(fù)責(zé)將多巴胺從突觸轉(zhuǎn)運(yùn)和再攝取到多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中。在氟西汀后代中觀察到的兒茶酚胺水平的增加也可能與slc6a3表達(dá)水平的增加有關(guān)，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)在多巴胺能神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)運(yùn)和重吸收增加。此外，HVA水平的降低強(qiáng)烈提示，參與多巴胺降解為HVA的酶MAO或兒茶酚- o -甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)可能受損，并伴有多巴胺β-羥化酶的增加，從而產(chǎn)生更高水平的去甲腎上腺素。氟西汀子代的BLA水平下降，而多巴胺水平升高，表明這些幼魚的總長度減少是導(dǎo)致其運(yùn)動能力下降的主要因素。然而，親代暴露于氟西汀對后代多巴胺受體的特定影響不能被拋棄。
當(dāng)子代成年后，單胺能基因的表達(dá)仍保持較高水平，在某些情況下，其倍數(shù)顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明上述合成途徑仍然受到影響。
我們觀察到的持續(xù)至成年期的行為效應(yīng)(負(fù)向地趨性和暗趨性、凍結(jié)行為減少、社交和新恐懼行為的變化)、單胺能系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)和神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化可能表明表觀遺傳改變的參與。鑒于這種可能性，需要在這一領(lǐng)域進(jìn)行更多的研究，以了解可能涉及到在后代中觀察到的變化的表觀遺傳機(jī)制，以及這些變化如何影響物種的生存和連續(xù)性。
本研究的結(jié)果表明，斑馬魚暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的氟西汀對其后代的胚胎發(fā)育和行為反應(yīng)有影響。這種暴露，即使在低濃度的氟西汀下，也會引起單胺能系統(tǒng)關(guān)鍵基因表達(dá)水平的增加和神經(jīng)化學(xué)改變。鑒于這一證據(jù)，顯然需要對親代和多代人進(jìn)行與環(huán)境相關(guān)的氟西汀濃度暴露。對不同水生物種進(jìn)行的這一性質(zhì)的進(jìn)一步研究可以提供與跨代長期影響相關(guān)的潛在環(huán)境風(fēng)險的信息，加強(qiáng)監(jiān)測水生環(huán)境中這些精神藥物和其他污染物的重要性，需要重新評估在水生生物野生種群中暴露于SSRI的生態(tài)和進(jìn)化后果。
原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045653524007446?via%3Dihub
蘇州木芮生物科技有限公司
Suzhou Murui Biotech Co.，Ltd.
服務(wù)熱線：0512-8957 3668
地址：江蘇省蘇州市工業(yè)園區(qū)東富路45號聯(lián)創(chuàng)產(chǎn)業(yè)園7幢
手機(jī)：18013764755（微信同號）
郵箱：muruibio@sina.com
