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影響因子：4.7

摘要

采用磁場輔助三相分配-凝膠滲透色譜法從金針菇子實體中分離純化了一種新型雜多糖FVPT1。利用單糖組成、甲基化分析、紅外光譜和核磁共振(NMR)對其結構進行了表征。FVPT1 (~1.64 × 10⁴ Da)由L-聚焦物、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖組成，摩爾比為1.0:3.5:1.0:1.4。通過甲基化分析和核磁共振譜分析確定了FVPT1的多糖重復單元。此外，斑馬魚幼魚高脂血癥模型試驗表明，FVPT1具有明顯的降脂作用。此外，FVPT1通過增加巨噬細胞中一氧化氮、白細胞介素(IL)-1β和IL-1的分泌，表現出顯著的免疫調節(jié)活性。因此，這些結果表明FVPT1具有開發(fā)成為一種新的免疫或降血脂保健產品的潛力。

金針菇(Flammulina velutipes)，在食用菌的產量和消費量方面位居世界第四。金針菇富含碳水化合物、蛋白質和維生素，因此受到亞洲消費者的歡迎，尤其是中國和日本。從金針菇中分離得到的多糖、糖蛋白、酚類和倍半萜具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血脂、調節(jié)免疫等促進健康的作用。金針菇多糖作為金針菇最重要的活性成分之一，已被研究多年。不同方法提取的金針菇多糖具有顯著的治療效果和未被發(fā)現的毒性，引起了廣泛的關注。許多研究表明，不同的提取方法會影響提取的產量、結構特征和生物活性。如Guo et al.所述，微波輔助提取多糖比熱水和超聲輔助提取具有更明顯的抗氧化活性。另一項研究表明，微波提取冬蟲夏草菌絲體多糖的產率和抗腫瘤活性最高，大分子多糖比例也最大。目前，金針菇多糖的提取方法有多種，主要包括熱水微波輔助提取法、超聲輔助提取法和酶輔助提取法，已被廣泛應用于研究中。例如，Zhang et al.研究發(fā)現，金針菇多糖在45℃、620 W、20 min條件下的最大提取率達到8.33%。傳統的提取方法雖然相對簡單，但其處理耗時、分離純化步驟復雜等缺點也不容忽視。三相分配法(TPP)作為一種新型的多糖提取方法，因其高效、半純化的特點而得到越來越廣泛的應用。

三相分配技術(TPP)是一種新型的、安全的、綠色的分離純化蛋白質和油脂的方法，它包括用正丁醇和硫酸銨溶液依次鹽析、等電點沉淀和溶劑沉淀，得到界面沉淀的上部有機相、中間蛋白相和下層水相。目前，TPP作為一種更高效、快速的提取技術，也被廣泛應用于提取河蜆多糖、從海洋芽孢桿菌SJ3株分離的木聚糖酶和蘆薈的多糖]。此外，被稱為“綠色分離技術”的磁場增強萃取方法利用其磁場增強化學分離過程。它可以利用磁場產生的特殊能量，通過改變抗磁性物質的微觀結構來改變其性質。在Palyska發(fā)表的一篇關于磁場輔助溶劑萃取的研究論文中，使用D-2EHPA (di-2-乙基己基磷酸)萃取Cu²⁺，萃取劑磁化后銅的分配比提高了160倍。另一篇文章發(fā)現，與傳統的提取方法相比，在50Hz的頻率下，可變磁場輔助提取技術可以從干紅茶和綠茶中提取更多的礦物質成分、咖啡因和多酚。因此，本研究采用磁場輔助三相分配法分離金針菇多糖，以期獲得更高產量和純度的新型金針菇多糖。

本研究利用磁場輔助TPP和凝膠滲透層析法提取金針菇多糖FVPTI，并通過單糖組成和甲基化分析以及NMR分析了其結構。此外，還對FVPT1的降脂和免疫活性進行了討論。本研究將為該多糖的大規(guī)模工業(yè)化生產以及用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)的活性多糖材料提供理論依據。

新鮮金針菇子實體采自江蘇中綠生物科技有限公司(宿遷)。標準單糖購自Sigma-Aldrich化學公司(St. Louis, MO, USA)。使用斑馬魚幼魚AB株(南京YSY生物技術有限公司(中國南京))、蛋黃粉(山東西唐公司(中國濟南))和細胞因子ELISA試劑盒(Becton, Dickinson and Company (New York, NY, USA))。

將金針菇子實體洗滌、干燥、粉碎，100目過篩。將金針菇粉末懸浮于500 mL 95%乙醇中，用SB25-12D超聲儀(寧波科倫茨生物技術有限公司，中國寧波)以40 kHz頻率提取3次，熱水提取3次，每次提取2 h。室溫下在水提液中加入一定量的固體硫酸銨(質量分數10-60%)和叔丁醇(5-30 mL)。將提取管置于磁場下，以100 rpm的轉速攪拌30 min，然后以2500 rpm的轉速攪拌5 min，形成三個清晰的相。對較低的水相進行透析、濃縮、干燥，得到純化的提取金針菇多糖(圖1)。

使用凝膠滲透色譜(GPC)(高分辨率Sephacryl S-300柱)(XK16 × 100 cm) (GE Healthcare (Cardiff, UK))進行進一步純化，并且使用過濾的蒸餾水作為洗脫劑。使用折射率檢測器(RID-10A, Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan))檢測到兩個峰，收集第一個峰并將其命名為FVPT1。

使用2 M TFA(三氟乙酸)在110℃下完全水解樣品(2 mg) 4 h。配備CarboPac Dionex LC30?PA20色譜柱(3 mm × 150 mm) (Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA))的高效陰離子交換層析(HPAEC)，用2 mm NaOH和0.05-0.2 M NaAc (0.45 mL/min)洗脫，以單糖為標準，用脈沖安培檢測器(Dionex)檢測糖的組成。

采用配備折射率檢測器(RI)的高效液相排阻色譜(HPSEC)和TSK PWXL 6000和3000凝膠過濾柱分析樣品的純度和相對分子質量，用PB緩沖液以0.5 mL/min洗脫;并在35℃下使用P5 (6200 Da)、P10 (10,000 Da)、P20 (21,700 Da)、P100 (113,000 Da)和P200 (200,000 Da)的普魯蘭標準進行校準。

將FVPT1與KBr粉末研磨，均勻混合后制成KBr片，用于在Perkin-Elmer 599B FTIR分光光度計(Waltham, MA, USA)中，在4000-400 cm^-1的波數區(qū)域，以4 cm^-1分辨率進行轉換紅外光譜分析，為32個樣本掃描。

FVPT1 (2 mg)的甲基化分析根據之前的研究進行。然后，通過水解、氘化硼鈉還原和乙?；瑢⒓谆嗵寝D化為部分甲基化的乙酸醛糖醇(PMAAs)。采用DB-5 MS色譜柱(30 m × 0.25 mm, 0.25μm, 0.2 mm膜厚)的GC-MS (Thermo Finnigan TRACE 2000/MS) (Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA))進行糖苷連鎖分析。以20℃/min將溫度設定為180℃到270℃并且在270℃下保持25 min。利用2011年NIST GC-MS數據庫中PMAA的質譜和相對保留時間對PMAA和碎片化模式進行鑒定。甲基化糖的百分比估計為峰面積的比值。

將FVPT1用D₂O溶解，在真空冷凍干燥器中凍干，以促進氘交換。將氘交換的FVPT1 (40 mg)溶解于0.5 mL 99.96% D2O中用于NMR。在27℃在Bruker Avance III 600 MHz NMR譜儀(Bruker Corporation (Billerica, MA, USA))上記錄¹H，¹³C，核奧氏效應光譜(NOESY)，異核多量子相干(HMQC)和1H檢測的異核多鍵相關(HMBC) NMR譜。以殘余HDO為參照，δ 4.78 ppm(27℃)為內標。在外部校準的DSS (δ 0.00 ppm)中測定13C化學位移。采用1h-1h相關光譜(COSY)和HMQC對信號進行賦值。HMBC和NOESY用于分配殘基間的鏈接和序列。

取對數生長期的RAW264.7小鼠巨噬細胞，用無色培養(yǎng)基DMEM稀釋成2 × 105個/孔，每孔細胞數盡量相近。在培養(yǎng)箱中放置4 h后，向細胞中加入樣品，顯微鏡下觀察細胞的黏附情況，并丟棄上清液。將5 mg/mL金針菇多糖溶液用RPMI-1640稀釋至100、200、500 μg/mL。然后，將96孔板加入每孔200 μL。陰性對照和陽性對照培養(yǎng)基分別含5% pbs和10 μg/mL lps，每組設6個重復。在5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)環(huán)境下孵育48 h后，取100 μL上清液，采用Griess實驗檢測NO水平，如前所述。

ELISA試劑盒檢測巨噬細胞釋放的IL-1和IL-1β。將巨噬細胞懸液稀釋至2×106個/mL，用每孔濃度為200 μg/mL的FVPT1溶液培養(yǎng)于96孔板中。以含0.5% PBS和10 μg/mL LPS的RPMI-1640培養(yǎng)基分別作為陰性對照組和陽性對照組，設置3個重復。分別于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4、8、10 d，參照試劑盒說明書操作步驟，采用ELISA法測定上清液中IL-1和IL-1β的含量。

FVPT1的降脂活性

AB株斑馬魚胚胎取自南京YSY生物技術有限公司(中國南京)，在含氧的清潔魚水中28℃孵育48 h。以卵黃粉作為高膽固醇飼料(HCD)連續(xù)6 d喂養(yǎng)斑馬魚幼魚，建立高脂血癥模型。將斑馬魚幼魚按每組10條斑馬魚的密度分為對照組、高膽固醇組和樣本組(FVPT1濃度分別為100、200和400 μg/mL)，置于每孔含2 mL魚水的12孔板中處理。高膽固醇組使用蛋黃粉作為斑馬魚幼魚的HCD飼料，終濃度為0.1%，而對照組不喂養(yǎng)。從高膽固醇蛋黃飼料喂養(yǎng)斑馬魚幼魚12 h開始，斑馬魚幼魚體內的脂質開始迅速積累。蛋黃粉浸泡斑馬魚幼魚48 h可誘導幼魚體內大量脂質蓄積，建立高脂血癥模型。高膽固醇多糖組在魚水中加入多糖和蛋黃粉，浸泡斑馬魚幼魚48 h，采用油紅染色觀察幼魚體內脂質蓄積情況。

根據說明書配置油紅o染料溶液并且用定性濾紙緩慢過濾。將斑馬魚幼魚用4%的聚甲醛固定1 h，用PBS洗滌2 ~ 3次，然后用25%、50%、75%、100%梯度的甲醇溶劑脫水。油紅o染色2 h后，分別用100%、75%、50%、25%梯度甲醇溶劑梯度洗脫，PBS洗滌。最后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

經油紅o染色后，在斑馬魚幼魚的血管和胃中可以清晰地觀察到脂質沉積。采用Image-Pro Plus (IPP) 6.0分析軟件測定斑馬魚體內染色脂質的積分光密度(IOD)值，定量評估體內脂質蓄積水平，進而分析多糖樣品對幼魚脂質蓄積的抑制活性。體內脂質標準化蓄積程度(%)=(碘多糖組?碘控制組)/(碘高脂血癥組?碘控制組)。

所有實驗均重復3次，數據以均數±標準差(SDs)表示。組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。對所有變量進行Levene′s正態(tài)性檢驗和齊次方差分析。必要時進行Tamhane 's T2檢驗。P < 0.05和P < 0.01分別為顯著和非常顯著。

結果

磁場輔助三相分配法獲得金針菇多糖的得率、多糖含量和蛋白質含量分別為2.3%、55.53%和12.19%。凝膠滲透層析純化后獲得的FVPT1多糖含量達90.1%，水分含量為2.91%。

FVPT1的總多糖含量為90.1%，總蛋白含量為5.20%。在HPSEC圖譜中，一個對稱的單峰(圖2a)表明FVPT1是一種均質多糖，約1.64 × 104 Da，半乳糖(Gal)，甘露糖(Man)，焦點(Fuc)和葡萄糖(Glc)的摩爾比為3.5:1.4:1:1。在之前的研究中，利用傳統的提取、分離和純化方法從金針菇中獲得了FVPA1、FVPA2和FVPB2。3種多糖的分子量不同，且不含蛋白質。FVPA2的單糖成分中不含葡萄糖。

圖2b顯示FVPT1在3416、1651和1453 cm^-1處有三個主要吸收峰。3416 cm ^-1峰表明多糖的羥基伸縮振動。1615 cm^-1處的強吸收峰和1453 cm^-1處的弱吸收峰說明了多糖的特性。由于1730 cm^-1處無峰，因此不存在糖醛酸。

在表1和圖2c、d中，GC-MS數據表明FVPT1末端具有支鏈結構，包括甘露吡喃糖殘基和葡萄糖吡喃糖殘基，包含1,2-二取代焦點、1,4,6-三取代半乳糖、1,3,6-三取代半乳糖、1,2-二取代焦點、1,4-二取代半乳糖和1,3-二取代葡萄糖的主鏈結構，還有在另一個終端的焦點殘留。

由圖3可知，FVPT1的多糖結構包括6個糖殘基，分別位于δ 5.26(單峰)、δ 5.12(單峰)、δ 5.07(單峰)、δ 5.03(單峰)、5.01(單峰)和δ 4.55(雙峰，J_{H-1，H-2} = 6 Hz)，分別對應于δ 101.55、105.29、100.73、100.81、104.20和105.87處的信號，命名為A-F。在1.24 (J_H-5，H-6= 6.42 Hz)處出現Fuc ¹H信號的CH₃-C基團，對應于Fuc δ 18.81處C-6的信號。

根據FVPT1結構中6個糖殘基的化學位移和異位構型，通過核磁共振來確定單糖殘基A-F的歸屬。

表2顯示了三種具有半乳糖構型的糖殘基的自旋系統，A, B和D，使用H-1/H-2到H-4和H-6/H-5, H-4相關性在¹H-¹H COSY和TOCSY光譜中發(fā)現。C-4的前場位移(δ 79.33)表明A為1,4-α-D-Galp。C-4 (δ 84.70)和C-6 (δ 67.48)表明殘基B為1,4,6-α-D-Galp。C-3 (δ 78.49)和C-6 (δ 69.32)表明殘基D為(1,3,6)-α-D-Galp。

殘基C在1.24 (1H NMR)和δ 18.81 (1C NMR)處有特殊信號，表明其J_H-1，H-2值和GC-MS數據均較小，且與δ 5.07具有α-焦點殘基醚。C-2 (δ 87.43)碳信號與標準值比較，表明殘基C為1,2 -α-L-Fucp。

經J_H-1，H-2和J_H-2，H-3的小值，J_H-4，H-5的大值和J_H-1，H-2的小值鑒定，殘留物E為D-甘露糖基。J_{C-1, H-1}= 170 Hz表明HMBC中存在α-甘露糖構型。除C-1 (δ 104.20)外，在δ 76-88范圍內沒有明顯的碳信號，表明E為末端α-D-甘露吡喃糖。

δ 4.55處出現異位信號，J_{H-1，H-2}值較大，表明F為β連接殘基。從COSY和HMQC光譜確定了H-2到H-6的質子化學位移。J_{H-2，H-3}和J_H-3，H-4 (9 Hz)的較大值以及NOESY光譜中典型的H-1、H-2和H-4內相關關系表明殘留物F為D-葡萄糖吡喃糖[8]。C-3 (δ 81.66)碳表明F為1,3 -link β-D Glcp。

從NOESY研究中確定了糖基殘基的序列，然后用HMBC實驗進行了確認(表3和表4)。根據上述數據，多糖FVPT1有以下重復單元(圖4):

NO作為免疫系統中關鍵的信號分子和重要的轉導因子，由于其與RNI代謝物性質相對穩(wěn)定，可以在樣本RNI水平中評估其含量。如圖5所示，與陰性對照組相比，在50~500 μg/mL的濃度下，FVPT1可以劑量依賴性地刺激NO水平。此外，500 μg/mL FVPT1具有明顯的NO生成激活能力。 

活化的巨噬細胞不僅能產生炎癥介質，還能分泌IL-1、IL-1β等細胞因子，調節(jié)局部微環(huán)境，抵抗不利因素的侵襲。ELISA試劑盒檢測FVPT1促進巨噬細胞產生上述4種細胞因子的效果，結果顯示FVPT1共培養(yǎng)可刺激巨噬細胞分泌IL-1β和IL-1細胞因子。500 μg/mL的FVPT1可以顯著促進IL-1β和IL-1細胞因子的水平(圖6)。結果顯示，FVPT1可以激活巨噬細胞并大量分泌IL-1和IL-1β細胞因子。在之前的研究中，利用傳統的提取、分離和純化方法從金針菇中獲得了FVPA1、FVPA2和FVPB2。與FVPT1的體外免疫效應相似，FVPA1可刺激Raw264.7巨噬細胞分泌NO。然而，FVPA2和FVPB2在體外作用于B細胞或NK細胞，而不是巨噬細胞。 

近年來，斑馬魚常被用作闡明藥理作用機制的模型。既往研究表明，從雙孢蘑菇和刺芹菇中分離的多糖在斑馬魚模型中具有顯著的降血脂活性。顯然，FVPT1在我們的高脂血癥模型中降低了斑馬魚幼魚的脂質含量。100、200、400 μg/mL FVPT1將斑馬魚的脂質含量分別降低到53.89%、73.76%、83.89%，而以蛋黃粉作為高膽固醇飼料喂養(yǎng)的模型組的脂質含量為100%(圖7)。體內實驗結果表明，FVPT1對脂質積累具有良好的抑制作用。