雜志：AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS
影響因子：9.8（2023）
年份：2022
通訊作者：1、蘇珊；2、魯辛
通訊作者單位：
1、內梅亨大學醫(yī)學中心人類遺傳學系，郵編9101,6500 HB奈梅亨，荷蘭；
2、內梅亨大學奈梅亨分子生命科學研究所，郵編9101,6500 HB奈梅亨，荷蘭。
摘要
背景：外顯子組測序顯示，在常染色體隱性錐體營養(yǎng)不良或錐體棒狀營養(yǎng)不良和復合雜合PoCiB突變的三個兄弟姐妹中，POCIB編碼POC1中心粒蛋白B的純合錯義突變(c.317C>G [p.Arg106Pro])、(c.199 201del [p.]Gin67dell和c.810+1G>T)在無親緣關系的錐桿營養(yǎng)不良患者中。當POC1B在人tert永生型視網(wǎng)膜色素上皮細胞1中過表達時，編碼的野生型蛋白定位于初級纖毛的基底，而p.a g106pro和p.Gin67del變體形式的POCiB則失去了這種定位。
方法：在斑馬魚中，嗎啉寡核苷酸誘導的pocib翻譯的敲低導致了劑量依賴性的小眼表型、光動力學反應受損以及光感受器外節(jié)段長度的減少。野生型人POCiBl mRNA可以部分挽救這些眼部表型，而c.199_201del和c.317C>G突變型人POC1B mRNA則不能。酵母雙雜交篩選人類視網(wǎng)膜cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)FAM161A是PoCiB的二元相互作用伙伴。這在共免疫沉淀和共定位實驗中得到證實，兩者都顯示FAM161A與POCiB的p.a g106pro和p.g n67del變體形式的相互作用喪失。
結果：FAM161A先前與常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性有關，并被證明位于連接纖毛的光感受器的底部，在那里它與其他幾種纖毛病相關蛋白相互作用。
結論：總之，本研究表明，POC1B突變導致光感受器感覺纖毛的缺陷，從而影響錐狀和桿狀光感受。
關鍵詞：錐狀；光感受器；斑馬魚
前言
遺傳性錐體疾病是一組異質性疾病，主要影響錐體光感受器，估計全球患病率為1:30 000 -1:40,000。它們可分為進行性錐體營養(yǎng)不良(COD)和更穩(wěn)定的疾病，也稱為錐體功能障礙綜合征。靜止亞型，如色盲(ACHM)，是先天性的，ACHM患兒表現(xiàn)為先天性眼球震顫，視力明顯下降，嚴重的畏光，色覺差或缺失，眼底正常。視網(wǎng)膜電圖(ERG)顯示錐體反應無或殘留，桿狀反應正常。另一方面，COD開始于童年或成年早期，并導致視覺敏銳度和色覺的進行性惡化，表現(xiàn)為ERG的錐體反應減弱。眼底檢查的COD從正常到黃斑病變或黃斑區(qū)完全萎縮不等。相當數(shù)量的COD患者也會出現(xiàn)視桿功能障礙，導致錐桿營養(yǎng)不良(CRD)伴全視網(wǎng)膜變性。在CRD中，視桿功能的喪失也可能伴隨視錐功能的喪失。因此，除了中心視力喪失，患有CRD的人還會經(jīng)歷夜盲癥和周邊視力喪失，導致更早的年齡失明。
分子遺傳學研究已經(jīng)在ACHM患者中發(fā)現(xiàn)了5個突變基因，8個與COD相關的基因，以及17個與CRD相關的基因(RetNet，參見Web Resources)。錐體疾病可以遵循孟德爾遺傳的所有模式，并表現(xiàn)為非綜合征和綜合征形式錐體疾病相關基因編碼的蛋白質在錐體光傳導級聯(lián)、向連接纖毛或通過纖毛的的運輸過程、細胞膜形態(tài)發(fā)生和維持、突觸轉導和類視黃醛循環(huán)中發(fā)揮關鍵作用。
全外顯子組測序(WES)已被證明在發(fā)現(xiàn)遺傳性視網(wǎng)膜疾病的遺傳缺陷方面非常有效。在這里，我們報告了通過WES鑒定POCIB突變(MIM 614784)，編碼一個先前與基礎體穩(wěn)定性相關的蛋白質，潛在的常染色體隱性COD或CRD。此外，我們還提供了一種綜合功能方法來證實所鑒定突變的因果關系。
研究對象和臨床評價
本研究包括一個非近親土耳其家庭(家庭A)，其三個兄弟姐妹患有COD和CRD，以及一個孤立的荷蘭個體(家庭B)，其ACHM演變?yōu)檫M行性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(圖1A)。這些家庭屬于受ACHM (n?21)，COD (n?110)或CRD (n?112)影響的個體的大隊列。大多數(shù)先證者是其家族中唯一的受累者，他們在荷蘭、比利時、英國和加拿大的多個眼科中心進行了確認。被診斷為ACHM的個體有先天性下垂性眼球震顫、視力下降、畏光、嬰幼兒早期色覺差或缺失的病史，ERG上錐體功能缺失(但桿狀反應正常)。在我們的隊列中，當個體表現(xiàn)為兒童期或成年早期開始的視力和色覺進行性惡化，ERG的錐體反應減少，桿狀反應正常時，他們被歸類為COD。6CRD的納入標準是中心視力進行性喪失，色視障礙，ERG的錐體反應(同樣或更嚴重地減少)和桿狀反應的減少。
在明確基因缺陷后，對家系A和B患者的病歷資料進行評估。眼科檢查包括最佳矯正視力(Snellen視力表)、裂隙燈顯微鏡檢查、檢眼鏡檢查、色覺檢查(Hardy-Rand-Rittler色覺測試和Lanthony面板d- 15測試)和視野檢查(目標V-4e和I-4e ~ I-1e)。2例患者均獲得了黃斑區(qū)和周邊4個象限的眼底照片。按照國際臨床視覺電生理 學 會 (International Society for Clinical Electrophysiology ofVision, ivim)標準進行ERG檢查。時域光學相干斷層掃描(OCT);在一個受影響的個體(A-II:4)中獲得Stra-tus OCT 3000，卡爾蔡司Meditec)，以及光譜域OCT (SD-OCT;HeidelbergSpectralis HRAtOCT，海德堡工程;B-II先證者獲得30張單行掃描，每行10幀);由于眼球震顫，SD-OCT的獲取受到限制。本研究獲得了各參與中心的機構審查委員會的批準，并遵循《赫爾辛基宣言》的原則。所有受試者在參與本研究前均提供了書面知情同意。
外顯子組測序和變異鑒定
利用SOLiD4測序平臺(生命技術)對疑似常染色體隱性遺傳家庭的12例CRD或cod影響先證進行WES測序，并根據(jù)制造商的方案使用SureSelect Human All Exon v.2對外顯子組進行富集試劑盒(50 Mb)，包含約21,000個基因的外顯子序列(Agilent技術)。使用LifeScope軟件v.2.1(生命技術)繪制hg19參考基因組組裝的顏色空間reads (UCSC genome Browser)。通過DiBayes算法的高嚴格調用調用單核苷酸變異體。用SOLiD Small Indel Tool(生命技術)檢測微小的插入和缺失。對于個體A-II:1，69,686,646個讀長被唯一映射到基因編碼區(qū);中位覆蓋率為58.23，有44,784個序列變異。先證物B-II: 175,493,298個reads被唯一地映射到基因編碼區(qū);中位覆蓋率為66.73，有47,304個序列變異。為了驗證WES序列變異并排除其他POC1B突變的存在，使用Primer 3軟件設計的引物擴增POC1B的所有編碼外顯子和外顯子-內含子邊界(表S1，可在線獲取)。
RT-PCR分析mRNA
為了評估c.810 ~ 1g >T對POC1B轉錄本的影響，根據(jù)制造商(QIAGEN)的方案，從患者B-II:1和三個對照個體的外周血細胞中分離總RNA。B-II 1和對照按標準程序用植物血凝素培養(yǎng)外周血細胞。在有或沒有放線菌酮的情況下，將受累個體的白細胞培養(yǎng)4 ~ 6小時，以便觀察突變的影響，以及含無義mrna可能通過無義介導的衰變發(fā)生降解。利用低張力滲透性休克和離心法將白細胞與紅細胞分離。用iScript (Biorad)對1 mg總RNA進行逆轉錄。用2.5 ml cDNA進行RT-PCR實驗，引物位于外顯子5和9(表S2)(35個循環(huán))，然后使用3100或3730 DNA分析儀(AppliedBiosystems)進行Sanger測序。
斑馬魚嗎啉諾敲低
Tupfel長鰭斑馬魚在標準條件下繁殖和飼養(yǎng)。18所有實驗均按照歐洲動物實驗指南(2010/63/EU)實施。斑馬魚卵是從自然產(chǎn)卵中獲得的。從GeneTools獲得阻斷poc1b15翻譯(50-GATCCTCCATTACAGACGCCATGAT-30) 或 外 顯 子 2 5-0 剪 接 位 點 (50-AAGTTCTCTGTCTTATTCAGGAGGA-30)的反義morpholino寡核 苷 酸 (MOs)。采 用 針 對 人 b- 珠 蛋 白 內 含 子 突 變 (50-CCTCTTACCTCAGTTACAATT TATA-30)的MO作為標準陰性對照。對于MO敲除，使用氣動PicoPump pv280 (World PrecisionInstruments)將1 nl稀釋的MO(范圍從2到10 ng)注射到1到2細胞期胚胎的蛋黃中。每次注射實驗的最小樣本量為80條幼魚。注射后，在28.5C的E3胚培養(yǎng)基(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mMccl2和0.33 mMMgSO4)中添加0.1% (w/v)亞甲基藍)中培養(yǎng)胚胎。在受精后4天(dpf)，根據(jù)Pearson等人描述的眼部表型的存在將胚胎分為兩組(在立體顯微鏡的眼部標尺上<15任意單位;蔡司)。對兩組胚胎以及注射和未注射的對照組進行視動反應(okr)測量和視網(wǎng)膜的組織學分析。
使用Gateway Technology(生命技術)在pCS2t/DEST中克隆編碼人類中心粒1B (POC1B，先前為Pix1)的野生型和變體(p.Gln67del和p.Arg106Pro)蛋白質組的cdna，進行線性化，并用作體外轉錄的模板。根據(jù)制造商的說明，用mMESSAGEmMACHINE試劑盒(生命技術公司)制備mrna。如上所述，用MOs注射100 pg mRNA。
斑馬魚OKR測定
OKR用前面描述的方法測量。斑馬魚幼蟲在一個小的皮氏培養(yǎng)皿中垂直放置在3%甲基纖維素中。培養(yǎng)皿放置在平臺上，周圍是直徑8厘米的旋轉鼓。在鼓的內部顯示了黑白相間的垂直條紋的圖案(每個條紋都有一個36的角度)。幼蟲(4 dpf)通過放置在鼓上方的立體顯微鏡觀察，并用光纖燈照明。當幼蟲受到旋轉條紋的光刺激時，記錄它們的眼球運動。實驗分為3組:逆時針旋轉30 s、靜止10 s、順時針旋轉30 s。然后，將幼蟲從甲基纖維素中洗出，固定后進行組織學分析。
斑馬魚胚胎感光器外段的染色
檢測OKR的幼蟲(4 dpf)在4%甲醛的PBS中固定24小時，通過從70%到100%的分級乙醇步驟脫水，并通過標準方案包埋在甲基丙烯酸乙二醇酯中。眼睛切片(2mm)，膜用硼-二吡啶(1:10 000PBS)染色，細胞核用DAPI(1:8 000)染色，蔡司Axio Imager Z1熒光顯微鏡成像。
I免疫染色和顯微鏡檢查
用于免疫組織化學的斑馬魚和大鼠樣品(未固定和固定在4%多聚甲醛中)在PBS中30%蔗糖中沖洗，在熔化的異戊烷中直接冷凍在Tissue Tek中。未固定的成年斑馬魚和大鼠眼睛(7 mm)的冷凍切片用抗hspoc1b (1:50;由Chad Pearson和Mary Pinter，科羅拉多大學慷慨提供)，如Pearson等人所描述的培養(yǎng)細胞15切片用GT335反染色(1:100;小鼠抗多谷氨?；⒐艿鞍讍慰寺】贵w，由Carsten Janke，國家中心科學中心生物化學大分子研究中心提供)。用小鼠單克隆抗體(zpr-1，針對Arr3a，1:50 0;ZIRC)和含有抗視紫紅質的視桿細胞(1:500;羅福斯生物制劑)。切片用PBS洗滌，在0.01% (v/v) Tween-20 PBS中滲透20分鐘，然后再次洗滌。接下來，用10%的正常山羊血清和2% BSA在PBS中，一抗在4℃阻斷緩沖液中孵育過夜。PBS洗滌后，二抗在阻斷緩沖液中室溫孵育45分鐘。樣品用DAPI反染，用生命技術公司(extension Gold)貼裝。對于所有切片，山羊抗小鼠或山羊抗兔(Alexa 488或568，分別為1:500;采用生命技術公司的二抗。
互補脫氧核糖核酸的結構
根據(jù)制造商的說明，使用Gateway Technology(生命技術)創(chuàng)建所有表達結構。這些構建體編碼33HA-POC1B野生型和變體(p.garg106pro和p.g gln67del)和33FLAG-FAM161A用于共定位研究，編碼單體紅色熒光蛋白(mRFP)-POC1B野生型和變體和PalmMyr-CFP-FAM161A用于共定位研究。編碼478個氨基酸的POC1B全長的cDNA構建(POC1B;RefSeq登錄號NM_172240.2 [gene]和NP_758440.1[蛋白])或其不同片段通過gateway - adaptive PCR產(chǎn)生并隨后克隆。第一個片段(POC1B-WD40)橫跨氨基酸1-297，包含WD40結構域。第二個片段(POC1B-SR)橫跨298-426個氨基酸，沒有任何已知的結構域。第三個片段(POC1B-CC)跨越427-478個氨基酸，包含一個單一的線圈結構域(圖S1)。編碼POC1B變異體p.g gln67del和p.g arg106pro的構建體通過定點誘變PCR生成。從全長FAM161A克隆中生成編碼全長FAM161A的構建體。所有進入克隆序列經(jīng)桑格測序驗證。
酵母雙雜交試驗
利用基于gal4的酵母雙雜交系統(tǒng)(HybriZAP, Stratagene)鑒定POC1B的二元蛋白-蛋白相互作用部分。將編碼全長POC1B的構建體和編碼POC1B片段的三個構建體融合到DNA結合域(GAL4-BD)上，作為誘餌篩選人寡聚dt引物視網(wǎng)膜cDNA文庫。酵母菌株PJ69-4A攜帶HIS3(組氨酸)、ADE2(腺嘌呤)和LacZ (b-半乳糖苷酶)報告基因，作為寄主。通過在選擇性培養(yǎng)基上生長評估報告基因(HIS3和ADE2)的激活和b-半乳糖苷酶比色過濾提升試驗(LacZ報告基因)來分析相互作用。桑格測序證實了含有推測相互作用部分的克隆的cDNA插入。
在hTERT-RPE1細胞中的定位
人tert永生化視網(wǎng)膜色素上皮1 (hTERT-RPE1)細胞按先前描述培養(yǎng)。細胞播種在蓋片上，培養(yǎng)到80%的融合度，隨后在僅含0.2%胎牛血清的培養(yǎng)基中血清饑餓24小時，以誘導纖毛生長。然后根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000 (生命技術)，用編碼mRFP-POC1B(野生型或變體)和PalmMyr-CFP-FAM161A(野生型)的構建物對細胞進行共轉染。細胞用4%多聚醛固定20分鐘，用1% Triton X-100 PBS處理5分鐘，用2% BSA PBS封閉20分鐘。細胞用一抗GT335(纖毛和基底體標記物，1:500)和a-RPGRIP1L(SNC039 ~ snc040，23過渡區(qū)標記物，1:500)孵育1小時，用2%BSA PBS稀釋。PBS洗滌后，細胞與二抗孵育45 min。二抗體山羊抗小鼠、山羊抗豚鼠、山羊抗兔(alex488、568、647，比例分別為1:500;生命技術公司)用2%BSA PBS稀釋。細胞用PBS和milliQ短暫洗滌，然后裝在含有DAPI (Vector Laboratories)的Vectashield中。采用蔡司Axio Imager Z1型633物鏡熒光顯微鏡分析野生型和變異型POC1B蛋白的細胞定位。在光照路徑中插入apoome滑塊，通過結構化照明生成光學切片，隨后使用AxioVision(蔡司)和Photoshop CS4 (Adobe Systems)軟件進行處理。
免疫共沉淀
33HA-POC1B(野生型和變體)和33FLAG-FAM161A在人胚胎腎293T (HEK293T)細胞中共合成。作為陰性對照，功能不相關的p63與POC1B和FAM161A共同合成。作為陽性對照，我們使用了先前描述的腎囊素-4(由NPHP4 [MIM 607215]編碼)與RPGRIP124以及l(fā)ebercilin(由LCA5 [MIM 611408]編碼)與FAM161A之間的相互作用。這些基因表達48小時后，細胞在冰上裂解緩沖液(50 mMTris-HCL [pH 7.5]， 150 mM NaCl和0.5% Triton X-100)中裂解，并補充完整的蛋白酶抑制劑雞尾酒(羅氏)。裂解液與抗ha親和基質(羅氏)或小鼠抗flag瓊脂糖(Sigma-Aldrich)在4℃下孵育5小時。孵育后，結合蛋白復合物的微球在裂解緩沖液中洗滌，隨后在43 NuPAGE樣品緩沖液中吸收，并在70℃下加熱10分鐘。離心沉 淀 珠 粒 ， 上 清 液 在 NuPAGE Novex 4%-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上運行。33HA-POC1B與33FLAG-FAM161A的相互作用通過免疫印跡法進行評估，然后用單克隆小鼠抗ha或單克隆小鼠 抗 flag 染 色 (1:10 00;Sigma-Aldrich 為 一 抗 ， 山 羊 抗 小 鼠IRDye800 (1:20 000;Li-Cor)作為二抗。在Li-Cor Odyssey 2.1紅外掃描儀上分析熒光。
結果
IPOC1B突變鑒定
POCIB突變的鑒定在一個有三個兄弟姐妹受COD或CRD影響的土耳其家庭中定位遺傳缺陷(家族a;圖1A)，我們在A-II:1中進行了外顯子組測序。當在dbSNP和我們的內部對照(n = 2,604個等位基因)中出現(xiàn)頻率< 0.5%，并且當它們代表無義、移碼、規(guī)范剪接位點或錯義突變且PhyloP評分> 2.7(范圍-14.1-6.4)時，選擇推定的因果突變在常染色體隱性遺傳的假設下，我們在ASTE1、CNTN3 (MIM 601325)和TUBGCP2中發(fā)現(xiàn)了潛在的復合雜合突變(存在于>20%的序列變異reads中);對這些突變的Sanger測序顯示，它們不與疾病分離。我們確定了一個潛在的純合突變(存在于>80%的序列變異reads中;表S3)， c.317C>G（p.Arg106Pro）在POCIB（MIM 614784）和桑格序列分析發(fā)現(xiàn)，它在三個受影響的兄弟姐妹中以純合狀態(tài)存在，在父母和未受影響的兄弟姐妹中以雜合狀態(tài)存在(圖1A)。106位的精氨酸高度保守，直至衣藻(圖1C)。c.317位點的PhyloP評分高達6.1，在189個種族匹配的對照和NHLBI外顯子組測序項目外顯子組變異服務器(EVS，發(fā)布ESP6500)中未發(fā)現(xiàn)c.317C>G突變。
采用與A家族相同嚴格的序列變異篩選，荷蘭B家族外顯子組測序(先證B- ii:1，診斷為非典型ACHM;圖1A)鑒定出三個具有潛在化合物雜合突變的基因(表S4)。序列NUDT14 （MIM 609219） 和 PIKFYVE （MIM609414)未與疾病分離。在POCIB中，我們發(fā)現(xiàn)了一個3 nt缺失，c.199_201del (p.Gln67del)和一個影響典型剪接位點核苷酸的突變，c.810 + 1 g > T。通過對該個體的淋巴母細胞mRNA進行RT-PCR，發(fā)現(xiàn)后一種突變可誘導外顯子6和7的跳變(c.561_810del;次要突變產(chǎn)物)或外顯子7 (c.677_810del;主要突變產(chǎn)物)(圖1B)，從而分別得到預測的截斷蛋白p.p phe188aspfs *73和p.p al226glyfs *30。分離分析證實父母雙方都攜帶這些POC1B突變之一(圖1A)。在149個種族匹配的對照組或NHLBI EVS中均未發(fā)現(xiàn)這兩種突變。第67位的谷氨酰胺在非洲爪蟾中是中等保守的(圖1C)。
通過歐洲視網(wǎng)膜疾病聯(lián)盟(European Retinal Disease Consortium) 評估了400多名不相關常染色體隱性CRD、Leber先天性黑內障和視網(wǎng)膜色素變性(RP [MIM 268000])患者的全基因組SNP純合子定位數(shù)據(jù)，并鑒定出8個具有跨越POC1B的大純合子區(qū)域的先證。。然而，這些先證中POCIB的桑格測序未發(fā)現(xiàn)額外的致病突變。隨后的POCIB桑格序列分析在更特定的隊列中，即在診斷為ACHM (n= 21)， COD (n= 110)或CRD (n=112)的個體中，也沒有發(fā)現(xiàn)其他具有POCIB突變的個體。
圖1 受COD或CRD影響的家庭中的POCIB突變。(A) Sanger測序顯示在A和1家族中分離出純合錯義突變M1 (C . 317g >C [p.Arg106Pro))突變M2 (c.199 201del [p.Gln67del)和M3 (c.810+1G>T)在B家族中分離。(B) mRNA RT-PCR研究顯示正常的421 bp產(chǎn)物和異常的387和271 bp產(chǎn)物缺乏外顯子7和外顯子6和7。分別。387 bp和271 bp的cDNA缺失分別導致預測截斷的POC1B產(chǎn)物p.Val226Glyfs*30 (c.677_810del)和p.Phel88Aspfs*73 (c.561_810del)。(C) PoCiB氨基酸殘基Gin67和Arg106的進化保守性。在所列物種中，位于67位的谷氨酸是中等保守的，而位于106位的精氨酸是完全保守的。所示為相同的氨基酸黑色方框表示，灰色方框表示保守殘基。
A、B家族患者的臨床特征
表1總結了4例POCIB突變個體的臨床特征。眼底和OCT圖像如圖2所示。A家族先證者(A- ii:1)在嬰兒期早期表現(xiàn)為視力下降和輕度眼球震顫。不完全性ACHM的診斷考慮基于9歲時ERG顯示錐體功能缺失但桿狀反應正常。在接下來的幾年里，視力似乎惡化了，幾年后，她的兩個年幼的兄弟姐妹經(jīng)歷了中心視力的快速喪失，提示兩個兄弟姐妹患有COD(圖2A和2B)，一個兄弟姐妹患有CRD。沒有關于這三個人的長期數(shù)據(jù)。相比之下，B-II:1被跟蹤了40多年。他在童年時期也被診斷為ACHM，基于典型的視力下降、畏光、眼球震顫、色覺非常差和匹配的ERG反應。在他的第五個十年中，視力開始緩慢下降，在他的第六個十年中，在他的下象限外圍發(fā)現(xiàn)了包括RPE萎縮和骨針狀色素沉著在內的退行性改變(圖2C和2D)。在OCT上，觀察到內節(jié)橢球區(qū)發(fā)生變化，表明內外節(jié)之間的連接喪失(圖2E)。55歲時的ERG顯示錐體缺失和桿體反應顯著降低?？傊?，診斷從孤立的錐體功能障礙轉變?yōu)檫M行性錐體-桿狀體疾病。系統(tǒng)地治療高血壓，腎功能正常。
表1 4例POC1B突變個體臨床資料匯總。視力以Snellen小數(shù)表示，縮寫如下:CF，數(shù)數(shù)指:COD，錐體營養(yǎng)不良:CRD，錐體桿營養(yǎng)不良:D，屈光度:ERG，視網(wǎng)膜電圖;LE，左眼;NP，未執(zhí)行;OCT，光學相干斷層掃描;RE，右眼;RPE，視網(wǎng)膜色素上皮;和SE，球形當量“59歲白內障摘除前的屈光不正。
圖2 POC1B突變受試者的臨床表現(xiàn)。(A和B) A家庭12歲時個體A- 1和3的右眼眼底攝影。(A)黃斑區(qū)正常的后極。(B)外周野相對色素沉著()，但未見病理性RPE改變。(C、D) B-II個體右眼眼底攝影:B家族60歲1例。(C)后極視神經(jīng)蒼白(*)，血管減弱(箭頭)，黃斑無RPE紊亂。(D)外周下野伴輕度RPE萎縮和骨刺色素沉著(箭頭)。(E)個體B-II左眼OCT:1未見中央凹發(fā)育不全，但可見內節(jié)段橢球帶(箭頭)及附著的后透明體膜(*)改變。
POC1B在人hTERT-RPE1細胞中的定位
為了研究POCIB突變對編碼蛋白亞細胞定位的影響，我們在纖毛hTERT-RPE1細胞中合成了與mRFP融合的野生型和變異型重組POC1B蛋白。通過抗多谷氨酰化微管蛋白抗體GT335染色可以看出，野生型POCIB定位主要集中在纖毛基底體，但也觀察到一些彌漫性細胞質定位(圖3A;圖S2A)。這證實了Venoux等人之前的結果。相反，攜帶p.g n67del的變異POCIB蛋白(圖3B;圖S2B)或p.Arg106Pro(圖3C;圖S2C)氨基酸改變，完全失去了它們的纖毛定位。
圖3 野生型和變體POC1B在hTERT-RPE1細胞中的亞細胞定位。(A)Gin67del (R).和mREP-POC1B-n.;arg106pro (C)(均為紅色)。其他圖片如圖S2所示，纖毛用毛脂和纖毛標記物GT335(綠色)和過渡區(qū)標記物RPGRIPIL(青色)反染。野生型mRFP-POCIB顯示細胞質定位，在基底區(qū)富集，如圖所示。兩種變體均顯示相似的細胞質定位，但在纖毛部位缺乏富集。在所有圖片中，細胞核都用DAPI染色(藍色)。比例尺表示10 μ m。
Poc1b在感光細胞中的定位
對斑馬魚的Poclb視網(wǎng)膜功能進行了評價。用抗人POCIB染色顯示，該蛋白位于成年斑馬魚視網(wǎng)膜內層和外層光感受器層的基底(圖4A)。在與基底體不同的焦平面上，在外核層的外邊界也觀察到一些染色(數(shù)據(jù)未顯示)。在大鼠光感受器細胞基底體也檢測到Poclb免疫染色(圖S3)。
圖4 MO敲除斑馬魚幼蟲poc1b的形態(tài)學和功能影響。(A)成年斑馬魚視網(wǎng)膜中Poclb(綠色)的定位。成年斑馬魚的視網(wǎng)膜通常包含兩個光感受器外段和相關基底(OS lavers 1和2)。這兩個lavers都顯示出Poclb免疫反應性，與GT335染色重疊并鄰近(紅色)，GT335是連接纖毛的標記物?？s寫如下:OS，外層段;CC，連接纖毛;BB，基體;IS，內節(jié);ONL，外核層。比例尺表示15um。(B)變形眼表型分析。注射6 ng翻譯阻斷MO后，小眼數(shù)量明顯高于注射MO對照的幼蟲。共注射野生型POCIB mRNA可部分恢復表型，但不能完全恢復c.199 201del (p.Gln67del)或c.317C>G (p.Arg106Pro)突變POC1B mRNA。(C) OKR分析(影像S1和S2)。在注射2ng的幼蟲池中，已經(jīng)觀察到幼蟲反應下降Mo(用榮譽標記)。在這個劑量下，也有變形蟲對視覺刺激有反應。(D)用對照或poclb MOs注射的眼睛的切片被染色為外段(紅色)和細胞核(藍色)。對視覺刺激沒有反應的變形體的眼睛更小?？潭葪l表示S0 um.l(E)無應答的異型體(OKR-)外節(jié)長度減少或缺失，而應答的異型體(OKR')外節(jié)長度正常，刻度條代表10 um。
Poc1b基因敲低導致斑馬魚的視覺損傷
Poclb突變體表現(xiàn)出Pearson等人先前描述的典型纖毛病表型，包括心包水腫、小眼睛、色素定位錯誤以及體軸縮短和彎曲(圖S4A)。在2 ng MO處理的幼蟲中已經(jīng)觀察到小眼睛，并且隨著劑量的增加而變得更加頻繁(圖4B;圖S4B)。在6 ng MO劑量下，39.8%的變異體出現(xiàn)了較小的眼睛，并且平均明顯小于野生型眼睛(圖4B;圖S4B)， 92.5%的突變體表現(xiàn)出上述一種或多種表型，但死亡率高于對照組。先前用第二個MO靶向poclb外顯子2的5'剪接位點驗證了MO敲除的特異性，從而導致59.1%的變形體具有小眼睛(圖S4B)。
以對照和poclb MOs為對照，測定其OKR。與野生型或對照注射鉬酸鹽的幼蟲相比，小眼突變體的OKR缺失或較低(圖4C;影片S1和S2)。接受相同劑量MO但眼睛大小正常的變形體對OKR刺激的反應正常。這種表型在用剪接位點阻斷MO處理的幼蟲中得到證實(數(shù)據(jù)未顯示)。在對照注射mo的幼蟲和表現(xiàn)出OKR的變形體中，外節(jié)長度不受影響。OKR測量的視網(wǎng)膜組織學分析顯示，光感受器外段縮短或缺失，而層壓顯示正常(圖4D和4E)。我們觀察到小眼表型與OKR減少或缺失之間存在完美的相關性。眼睛的大小似乎與外節(jié)長度相關以及對視覺刺激的反應性相關。因此，我們可以量化眼睛的大小來衡量Poclb功能喪失的影響。事實上，共注射100 pg人類野生型POCIB mRNA，而不注射c.199_201del (p.Gln67del)或c.317C>G (p.Arg106Pro)突變型POCIB mRNA，顯著地挽救了poclb敲除(圖4B;圖S4B)。
具有較小眼睛的變形體的一部分細胞中沒有典型桿狀(視紫紅質)和錐狀(zpr-1)標記物的免疫組織化學染色(圖S4C)。高倍圖像顯示，雖然在變形視網(wǎng)膜的某些區(qū)域沒有免疫染色，但光感受器細胞的細胞核仍然存在。
與POCIB相互作用的視網(wǎng)膜蛋白的鑒定
為了確定視網(wǎng)膜中POCIB的相互作用伙伴，我們在酵母(酵母雙雜交系統(tǒng))中采用了基于gal4的相互作用陷阱篩選。我們篩選了一個表達人視網(wǎng)膜cdna的文庫，尋找潛在的POCIB相互作用物。兩者都是表達全長POCIB的結構表達不同POCIB片段的構建體作為誘餌(圖S1)。含有POCIB羧基末端卷曲結構域的片段被發(fā)現(xiàn)可能與五種不同的蛋白質相互作用，包括FAM161A(圖S5A)。與這種已知的視網(wǎng)膜疾病相關蛋白的相互作用引起了我們的注意，并通過使用兩種全長蛋白的共免疫沉淀試驗得到了證實(圖5A)。在相同的實驗中，我們研究了POCIB中鑒定的錯義和單氨基酸缺失變異對相互作用的影響。事實上，與野生型相比，POCIB的改變量明顯更低蛋白質與FAM161A共沉淀，表明物理相互作用被破壞。不相關的p63不與POCIB或FAM161A共沉淀，這在共免疫沉淀試驗中證實了POC1B和FAM161A相互作用的特異性。通過互反共免疫沉淀證實了野生型POCIB與FAM161A之間的相互作用，以及變異POCIB蛋白與FAM161A之間的相互作用減弱(圖S5B)。未裁剪的免疫印跡圖像如圖S6所示。
為了驗證在哺乳動物細胞中FAM161A和變異體POCIB之間失去相互作用，我們共轉染hTERT-RPE1細胞與PalmMyr-CFPFAM161A一起編碼野生型和變異mRFP-POCIB(圖SB-SD;圖S7A-S7C)。PalmMyr，兩者都能誘導感興趣蛋白的膜結合這隨后可以通過熒光顯微鏡觀察熒光CFP標簽的表達。FAM161A和POCIB的共表達表明編碼蛋白在質膜、基底體完全共定位，并與微管網(wǎng)絡相關。當POCIB結構中存在任何一種突變時，與FAM161A的共定位完全丟失。PalmMyrCFP-FAM161A隨后維持了其膜、基體和微管的結合，但變異型POCIB的定位是胞質性的，不富集于特異亞細胞位點(圖5C和SD;圖S7B和S7C)。
圖5 共免疫沉淀及hTERT-RPE1定位研究POC1B和FAM161A。(A) HEK293T細胞的共免疫沉淀試驗。野生型3xHA-POCIB與3xFLAGFAM161A (lane 1)有效共沉淀，但變異3×HA-POCIBp的共沉淀減少。Gln67del和3xHA-POCIB-p。Arg106Pro(面板4)通過納入不相關的p63來證實特異性，p63不能與野生型和變型POCIB共免疫沉淀。作為陽性對照，采用FAM161A共免疫沉淀lebercilin (LCA5編碼)和腎囊素-4 (NPHP4編碼)共免疫沉淀RPGRIP1。圖1和圖2顯示了輸入的免疫印跡，圖3和圖4顯示了FLAG免疫沉淀的免疫印跡。大小標記物用kDa表示。(B) hTERT-RPE1細胞中的共定位PalmMyr-CFP-FAM161A(綠色)靶向細胞膜和微管，將野生型mRFP POCIB(紅色)從細胞質轉移到細胞膜和微管。(C和D) mRFP-POCIB-p未觀察到PalmMyr CFP-FAM161A(綠色)的這種易位。Gin67del (C，紅色)或mRFP-POCIB-p。Arg106Pro (D，紅色)，兩者都保持了它們的細胞質定位。RPGRIPIL(洋紅色)被用作纖毛的過渡區(qū)標記。細胞核用DAPI染色(藍色)。比例尺表示10 μm。附加圖像如圖S7所示。
我們進一步分析了在四個簇中表達的頂級標記基因，發(fā)現(xiàn)一些基因主要特異性地表達在其中一個簇中，例如，tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和簇7(圖3B, S3)。功能富集分析顯示，上述4個細胞簇中表達的很多基因具有毛細胞相關的生物學功能(圖3C-F)，這表明這些細胞是毛細胞。為了進一步確認毛細胞的聚類和注釋，我們進行了全載原位雜交(WISH)。zpld1a基因主要在嵴毛細胞中表達，根據(jù)我們的分析，嵴毛細胞被認為位于簇12(圖3H)，這與之前的研究一致。至于簇0和7的細胞，雖然都是神經(jīng)肥大毛細胞，但它們之間存在差異。根據(jù)成熟和年輕毛細胞標志物s100s和prox1a在兩個簇中的表達情況，簇0的細胞被歸類為成熟神經(jīng)肥大毛細胞，簇7被歸類為年輕神經(jīng)肥大毛細胞(圖S4)。
另一方面，我們分析了支持細胞的標記基因klf17，發(fā)現(xiàn)它主要表達在簇1的細胞中(圖S5)，這表明這一簇細胞是支持細胞。同樣，我們還分析了據(jù)報道在套細胞中表達的基因，如tnfsf10、ponzr6、pkhd1l1、fat1b、crb3b、cts12、ovgp1和cldne，發(fā)現(xiàn)高水平表達這些基因的細胞聚集在簇9中(圖S6)。然而，它們表達了一些已被證明在毛細胞中特異性表達的基因，如myo6b、myo7aa(圖S7)，這提出了它們是可以分化為毛細胞的支持細胞的可能性。因此，我們得出結論，來自簇1和9的細胞分別是支持細胞和套細胞，來自簇14的細胞可能是毛細胞祖細胞。
討論
在這項研究中，我們確定了三種導致常染色體隱性COD或CRD的POCIB突變。在一個家庭的兩個兄弟姐妹中，兒童時期觀察到中心視力喪失，與進行性錐體疾病一致;然而，在另一個兄弟姐妹和一個孤立的個體中，從嬰兒早期就存在視力差和眼球震顫，提示一種形式的ACHM。后兩個人的視力也隨著時間的推移而惡化，其中一人在60歲時觀察到周圍視網(wǎng)膜變性。盡管由于CNGA3 (MIM) 600053)和CNGB3 (MIM 605080)突變，與ACHM或COD相關的基因存在重疊，但據(jù)我們所知，沒有關于ACHM的自然史與外周變性有關的報道。POCIB是兩個POCI同源物之一，在脊椎動物中作為高度保守的核心中心粒和基礎體成分，無脊椎動物，甚至還有萊茵衣單胞菌和嗜熱四膜蟲另一個由POCIA編碼的POC1同源物(先前的Pix2 [MIM 614783])顯示出與pocib相似的蛋白質結構和細胞內定位。對嗜熱四膜蟲的研究表明，POCI蛋白對基底體的結構和穩(wěn)定性都是必不可少的。耗盡研究表明，與POCIA不同，POCIB是纖毛發(fā)生所必需的，并且在poclb變形斑馬魚中描述了典型的纖毛病相關發(fā)育缺陷(如體軸彎曲、腎囊腫和側邊缺陷)。有趣的是，也有報道稱它們的眼睛更小，但沒有進行更詳細的眼科分析。
鑒于我們在POCIB突變的受影響個體中觀察到的視網(wǎng)膜表型和poclb變形斑馬魚中報道的較小的眼睛，我們使用與Pearson等人使用的相同的翻譯阻斷MO來破壞poclb的表達。對眼睛中Poclb功能的準確評估確實證實了該蛋白是正常視力所必需的，因為poclb缺失的斑馬魚與較小的眼睛一起顯示出嚴重降低的OKR(圖4C)。對變形眼的分析顯示，錐體占主導地位的幼蟲視網(wǎng)膜中的光感受器外段長度減少(圖4D和4E)。Poclb似乎存在于脊椎動物光感受器的所有基體中，表明功能喪失同時影響桿細胞和錐細胞(圖4A;圖S3)。事實上，poclb的敲低降低了桿狀細胞和光轉導級聯(lián)中重要蛋白的免疫反應性(圖S4C)。這與OKR試驗中測量的poc1b變異體的視覺反應降低相對應。用野生型人類POCIB mRNA實現(xiàn)了與這種表型相關的小眼睛的拯救。
本研究中發(fā)現(xiàn)的受影響的氨基酸在進化中是中度或高度保守的(圖1C)，兩者都影響n端WD40結構域(圖S1)。第三個突變改變了外顯子7的剪接位點，導致蛋白質在最后一個WD40重復序列中被截斷。這個WD40結構域，而不是POCI的c端區(qū)域，已經(jīng)被證明足以靶向POC1定位到中心粒事實上，正如之前報道的那樣，野生型POCIB定位于基底體，而p.n gln67del和p.a g106pro變體POCIB顯示與纖毛基底體的關聯(lián)缺失(圖3)。斑馬魚中變異對Poc1b的影響是通過同時注射攜帶任何一個突變的Poc1b MO和人的Poc1b mRNA來解決的。與共注射野生型mRNA相比，共注射突變mRNA不能誘導(部分)恢復眼部表型，證實了變異氨基酸殘基對視網(wǎng)膜的干擾作用(圖4B)。
為了進一步了解POCIB的視網(wǎng)膜功能，我們旨在通過在視網(wǎng)膜cDNA文庫的酵母中使用基于gal4的相互作用陷阱篩選來鑒定與POCIB相互作用的視網(wǎng)膜蛋白。在采用的四個不同的POC1B誘餌片段中，僅發(fā)現(xiàn)線圈-線圈區(qū)域產(chǎn)生一個重要的相互作用:FAM161A。有趣的是，F(xiàn)AM161A的突變導致另一種視網(wǎng)膜纖毛病，常染色體隱性RP (RP28)。通過共免疫沉淀和共定位研究證實了FAM161A的結合(圖5)。盡管最初是用含有POCIB卷曲區(qū)域的片段檢測到這種相互作用，但在全長蛋白的WD40結構域引入兩個POCIB變體，強烈降低了它與FAM161A的相互作用。重申了該結構域在結構上的重要性。由于FAM161A被發(fā)現(xiàn)是一種視網(wǎng)膜-纖毛病相關蛋白，我們觀察到與這種視網(wǎng)膜特異性蛋白相互作用的減少可能會導致CRD患者POCIB突變導致桿狀光感受器變性。
Pearson等人的研究表明，在缺乏Pocib的情況下，斑馬魚呈現(xiàn)出各種表型，這些表型指向綜合征性纖毛病相比之下，本研究中發(fā)現(xiàn)的POC1B突變與兩個家族中更溫和的非綜合征性錐體病表型相關。盡管物種特異性差異可能導致了觀察到的表型異質性，但基于所發(fā)現(xiàn)的突變類型和組合，以及改變的POCIB與視網(wǎng)膜特異性FAM161A之間減少(但并非沒有)的相互作用，我們有理由得出結論，COD個體具有殘留的POCIB活性。因此，更嚴重和/或功能喪失的POCIB突變組合可能與視網(wǎng)膜纖毛病的綜合征形式有關，這與先前在另一種纖毛病相關基因CEP290 (MIM)中觀察到的廣泛疾病譜系一致。
結論
總之，WES在兩個不相關的常染色體隱性非綜合征性COD或CRD家族中發(fā)現(xiàn)了POCIB突變。這些變異被發(fā)現(xiàn)破壞睫狀基底體蛋白POCIB及其與視網(wǎng)膜特異性rp相關蛋白FAM161A的相互作用。鑒于斑馬魚POCIB缺失進一步導致早發(fā)性視網(wǎng)膜功能障礙，本研究強調了一種包含POCIB和FAM161A的基礎體蛋白光感受器模塊，這是光感受器穩(wěn)態(tài)所必需的。
基金：本研究由抗盲基金會資助(授予BR-GE-0510-04890RAD給A.l.d.H, c.c mm -0811-0547- rad03給H.K.和E.v.W, C-CMM-0811-0546RADO2給r.r.,C-GE-0811-0545-RADO1給EP.M.C), A.I.d.H和R . WJ.Collin);荷蘭預防失明協(xié)會;蓋爾德蘭盲人基金會:國家盲人和視障人士基金會;盲人獎章基金會;黃斑變性基金會;鹿特丹斯布林貝朗根(EP.M.C)和C.C.W.K.);荷蘭衛(wèi)生研究與發(fā)展組織(授予Vici016.130.664給r.r.,Veni-91613008給H.H.A, Veni016.136.091給E.v.W);荷蘭衛(wèi)生研究與發(fā)展組織(ZonMW E-rare贈款40-4290)-981006 (E.v.W);歐洲共同體第七框架方案FP7/2009(贈款協(xié)議241955 SYSCILIA給香港和r.r.r.);以及Radboudumc的機構博士資助H.H.A.
本文章原文：The American Journal of Human Genetics 95, 131–142, August 7, 2014
詳細網(wǎng)址：http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2014.06.012
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