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雜志：CARDIOVASCULAR RESEARCH

影響因子：10.8（2022）

年份：2023

通訊作者：Suphansa Sawamiphak

通訊作者單位：Max Delbrück Center (MDC), Robert-R?ssle-Str. 10, 13125 Berlin, Germany

DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Berlin,Gesch?ftsstellePotsdamer Str. 58, 10785 Berlin, Germany

摘要

目的：失調(diào)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致控制高血壓和降低終末器官損傷風(fēng)險(xiǎn)的治療策略效率低下。揭示從高血壓刺激開始到多器官功能障礙表現(xiàn)的免疫途徑是免疫靶向治療急需的見解。

方法和結(jié)果：為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞事件協(xié)調(diào)多器官發(fā)病機(jī)制的可視化，我們模擬了斑馬魚的心血管高血壓重構(gòu)。暴露于離子缺乏環(huán)境下的斑馬魚幼魚表現(xiàn)出血管緊張素原的快速上調(diào)，隨后出現(xiàn)動脈高血壓和心臟重構(gòu)，這再現(xiàn)了射血分?jǐn)?shù)保持的早期心力衰竭的關(guān)鍵特征。在大腦中，延時(shí)成像顯示，在離子缺乏處理后，通過內(nèi)皮收縮和遷移發(fā)生腦血管衰退。這種現(xiàn)象與巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)內(nèi)皮接觸和內(nèi)皮連接收縮有關(guān)。細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)干擾素-γ和白細(xì)胞介素1β的系統(tǒng)上調(diào)，并揭示了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序的改變，其特征是抑制先天免疫和血管/神經(jīng)保護(hù)基因的表達(dá)。壓力過負(fù)荷誘導(dǎo)的腦損傷的斑馬魚和小鼠模型都表明，腦病理和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型的改變依賴于干擾素-γ信號傳導(dǎo)。在斑馬魚中，干擾素-γ受體1突變可阻止腦血管重構(gòu)和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜的失調(diào)。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法中鑒定出骨形態(tài)發(fā)生蛋白5在離子缺乏處理時(shí)在巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中的下調(diào)可以通過干擾素-γ阻斷挽救，減輕腦微血管丟失。在橫主動脈收縮誘導(dǎo)的壓力過載的小鼠中，通常會發(fā)生腦血管損傷、神經(jīng)炎癥和認(rèn)知功能障礙，干擾素-γ中和保護(hù)它們免受血腦屏障破壞、腦血管稀疏和認(rèn)知功能下降。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；高血壓；舒張期功能障礙；血管衰退；炎癥；巨噬細(xì)胞；IFNγ；腦血管疾病；認(rèn)知損傷

引言

高血壓是最普遍的慢性疾病，也是一個(gè)主要的健康挑戰(zhàn)。雖然血壓升高是高血壓的主要診斷特征，但其死亡率和殘疾是相關(guān)的心血管共病的結(jié)果，如心力衰竭、中風(fēng)、慢性腎臟疾病和認(rèn)知功能障礙。目前的治療策略主要針對控制生理血壓的關(guān)鍵調(diào)控通路、交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素（Ren）血管緊張素（Agt）系統(tǒng)。雖然這些藥物有助于原發(fā)性高血壓患者達(dá)到目標(biāo)血壓水平，但仍難以阻礙靶器官損傷的進(jìn)展。對于腦血管的改變尤其如此。同樣越來越清楚的是，即使在血壓水平可接受的受試者中，心血管事件的殘余風(fēng)險(xiǎn)升高也可能持續(xù)存在，強(qiáng)調(diào)了其他疾病驅(qū)動因素的存在。

系統(tǒng)性炎癥和免疫反應(yīng)性在高血壓和終末器官損傷的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵貢獻(xiàn)是公認(rèn)的。不同類型的先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子，已被證明參與了高血壓的發(fā)病機(jī)制。然而，我們對這些免疫細(xì)胞的激活如何導(dǎo)致高血壓的發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制的理解仍然缺乏。人們普遍認(rèn)為，先天免疫細(xì)胞作為高血壓刺激下炎癥反應(yīng)的啟動因子，在血管損傷中起著關(guān)鍵作用。單核/巨噬細(xì)胞缺乏可減輕血管緊張素II（AngII）、醛固酮、和內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)阻力性動脈和主動脈血管功能障礙和氧化應(yīng)激的作用。同樣，在高血壓小鼠模型中，消融大腦血管周圍巨噬細(xì)胞可以阻止大腦中動脈和腦血管的結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)和腦血管氧化應(yīng)激。免疫細(xì)胞在高血壓中的有害作用并不僅僅依賴于促炎細(xì)胞因子或活性氧的產(chǎn)生。研究表明，醛固酮和鹽誘導(dǎo)高血壓后，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）10可促進(jìn)心臟纖維化和舒張功能障礙。總的來說，大量證據(jù)表明不同免疫細(xì)胞類型與血管、心臟和大腦相互作用，這表明了一個(gè)總體假設(shè)，即失調(diào)的免疫細(xì)胞通過破壞這些器官的血壓調(diào)節(jié)功能來驅(qū)動高血壓的發(fā)展。然而，終末器官功能障礙可引起各種外周組織的炎癥，這表明復(fù)雜的免疫反應(yīng)級聯(lián)反應(yīng)是高血壓的原因和后果。更好地了解不同免疫細(xì)胞亞群的位點(diǎn)特異性效應(yīng)，以及深入了解將高血壓信號傳遞給受影響器官的免疫通路的機(jī)制，是開發(fā)免疫靶向策略來管理臨床高血壓的基礎(chǔ)。在這里，我們解決了三個(gè)主要問題：(i)免疫細(xì)胞驅(qū)動的血壓調(diào)節(jié)器官的不良重構(gòu)背后的細(xì)胞過程；（ii）細(xì)胞事件的分子介質(zhì)；以及（iii）對已確定的免疫通路的操縱是否可以防止高血壓的發(fā)展和終末器官的病理重構(gòu)。通過引入離子差誘導(dǎo)的體液穩(wěn)態(tài)紊亂，我們建立了斑馬魚作為一個(gè)新的模型，重現(xiàn)了人類高血壓的多系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)特征，比目前的嚙齒動物模型需要更簡單的操作和更短的治療時(shí)間。重要的是，該模型不僅允許對高血壓的多系統(tǒng)表型進(jìn)行死后表征，而且還可以通過實(shí)時(shí)成像方法來追蹤致病進(jìn)展過程中的細(xì)胞行為。利用斑馬魚模型，我們能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)胞過程發(fā)生在從接觸離子不平衡刺激大腦病理的表現(xiàn)，即巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞接觸和內(nèi)皮連接中斷之前內(nèi)皮細(xì)胞遷移驅(qū)動腦血管退化和增加大腦細(xì)胞死亡。在機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)干擾素-γ（IFNγ）信號通路是系統(tǒng)性炎癥驅(qū)動的動脈功能障礙和離子失衡驅(qū)動的大腦重構(gòu)的關(guān)鍵中介。在對離子缺乏暴露的反應(yīng)下，IFNγ信號下調(diào)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)、促血管生成和神經(jīng)保護(hù)因子。我們發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）5，參與了IFNγ驅(qū)動的致病途徑。最后，在心臟壓力過載誘導(dǎo)的腦病理的小鼠模型中，我們提供了炎癥靶向治療的概念證明，該治療可以消除腦血管稀疏、血腦屏障（BBB）和內(nèi)皮連接中斷和認(rèn)知功能障礙。

方法

動物飼養(yǎng)和品系

本研究中使用的轉(zhuǎn)基因品系為Tg（myl7：MKATE-CAAX）sd11,1、Tg（myl7：H2BGFP）zf521,2、TgBAC（csf1ra：GAL4-VP16）i186,3、Tg（UAS-E1B：NTR-mCherry）c264,4、Tg（5xUAS：EGFP）zf82,5、Tg (kdrl：Hsa.HRAS-mCherry)s896,6, Tg (kdrl: EGFP)s843,7, ifngr1s986,8, Tg (ubb: NATC)bns98,8, Tg (fli1a:pecam1a-EGFP)ncv27,9, Tg (kdrl: HsHRASmCherry) s916,10, Tg (mpeg1:Gal4-VP16)gl24,11, Tg (UAS: Kaede)rk8,12.除非另有說明，收集胚胎并在丹尼奧溶液（58 mM氯化鈉，0.7 mM氯化鉀，0.4 mM硫酸鎂，0.6 mM Ca（NO3）2,5 mM HEPES在水中）中培養(yǎng)。在活體成像實(shí)驗(yàn)中，將苯硫脲（PTU）應(yīng)用于丹尼奧溶液中，以阻斷皮膚色素沉著。

斑馬魚的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行，符合機(jī)構(gòu)（馬克斯·德爾布魯克分子醫(yī)學(xué)中心）、國家（柏林實(shí)驗(yàn)室）和德國倫理和動物福利指南，并得到柏林LAGeso公司的批準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)均在受精后10天（dpf）的幼魚上進(jìn)行。用0.168 mg/ ml三卡因甲磺酸鹽（MS-222）麻醉對幼魚實(shí)施安樂死，然后浸泡在冰水中誘導(dǎo)低溫治療。

8周齡的C57Bl/6J小鼠從查爾斯里弗斯獲得，飼養(yǎng)在控制溫度和濕度（21±1°C，60±10%），12-12小時(shí)的光-暗循環(huán)。

離子缺乏處理

離子缺乏水是用去離子水將丹尼諾溶液稀釋750倍或1500倍，制備出貧離子水。在Danieau溶液中培養(yǎng)至2 dpf的胚胎暴露于離子濃度逐漸降低，750倍稀釋2天，然后稀釋1500倍，直到功能和表型評估。在對照組中，魚被保存在丹尼奧的溶液中。

RAS的藥理抑制作用

本研究采用血管緊張素受體阻滯劑氯沙坦抑制RAS通路。胚胎/幼魚分別用Danieau溶液作為對照或貧離子溶液處理，直到7dpf。在早期藥物治療中，將2dpf魚用100μM氯沙坦和0.2% DMSO浸泡在貧離子溶液中，直到5 dpf。然后取出藥物，將魚保存在含有0.2% DMSO的貧離子溶液中，直到7 dpf。對于晚期藥物治療，4 dpf魚在0.2% DMSO的離子差溶液中培養(yǎng)2天，用100μM氯沙坦和0.2% DMSO在離子差溶液中浸泡至7 dpf。對照組魚在含有0.2% DMSO的丹尼奧緩沖液中飼養(yǎng)。

心臟收縮力測量

5 dpf或7 dpf幼魚包埋在1%低熔點(diǎn)瓊脂糖中。用配有40X物鏡和高速攝像機(jī)（Ximea）的透射光學(xué)顯微鏡對心室和背主動脈節(jié)段進(jìn)行成像。6-10秒長的電影以每秒300幀的速度獲得。舒張期速度和收縮期速度、縮短分?jǐn)?shù)（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）和流速的計(jì)算方法如前所述8。簡單地說，在斐濟(jì)13測量了舒張和收縮期末期的心室面積，并以面積隨時(shí)間的變化計(jì)算為舒張或收縮期速度。使用斐濟(jì)軟件測量舒張末期（寬度和長度VD）和收縮期（寬度和長度VS）的心室寬度和長度。然后，將舒張末期的心室容積（容積VD）和收縮期（容積VS）分別計(jì)算為[π x長度VDx widthVD2）/6]和[π x長度VSx widthVS2）/6]。EF的計(jì)算方法為[100x（volumeVD-volumeVS）/volumeVD]。FS的計(jì)算方法為[100x（寬度VD-寬度VS）/寬度VD]。為了計(jì)算血液速度，我們使用Fiji (http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Velocity_Measurement_Tool)的速度測量工具生成了背主動脈內(nèi)血細(xì)胞運(yùn)動的波動圖。接下來，使用Matlab代碼從脈波圖中計(jì)算出最大和最小速度.

診斷

小鼠用氯胺酮/噻嗪混合物（90/10 mg/kg）麻醉。如前所述，在左頸動脈和無名干之間進(jìn)行主動脈收縮，以誘導(dǎo)慢性壓力過載，如前所述。假手術(shù)小鼠進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)程序，但沒有進(jìn)行主動脈結(jié)扎。

心臟回波描記術(shù)

采用配備40 MHz和15 MHz換能器的Vevo2100 (Visualsonics, Fujifilm)對小鼠進(jìn)行超聲分析。小鼠用異氟醚麻醉(3.5%誘導(dǎo)，0.5%-1%維持，補(bǔ)充1 L/ min氧氣)，固定在加熱墊上保持體溫恒定并監(jiān)測生理參數(shù)。胸部和頸部被刮平，用40 MHz換能器從胸骨旁短軸投影進(jìn)行心臟成像。m型圖像應(yīng)用Teicholz公式評估左心室心功能。心尖室圖像用于評估舒張功能。主動脈弓成像采用15mhz換能器，通過超聲多普勒評估主動脈橫縮(TAC)結(jié)扎的跨狹窄梯度。

抗ifng抗體和rhBMP-5注射

對于斑馬魚處理，將抗Ifng（Abcam，ab211784）和抗v5（ThermoFisher，R960-25）用去離子水稀釋至150μg/ml（ThermoFisher，R0581）。重組人BMP-5(研發(fā)生物技術(shù)，Cat。編號：615-BMC-020/CF)在去離子水中稀釋至200ng/μl。用三卡因（0.168 mg/ml）麻醉3 dpf或5 dpf幼魚，將1-2 nl抗體溶液注射到心包囊或靜脈竇。注射等量的V5抗體或載體作為對照。注射后，用新鮮的丹尼奧溶液或離子差溶液改變魚的培養(yǎng)基。

小鼠被隨機(jī)分配，并接受抗Ifng（BioCell，BE0055）治療或非相關(guān)IgG（BioCell，BE0088）治療作為對照。從TAC后1周開始，每隔3天腹腔注射200μg抗IFNg或非相關(guān)IgG，體積為75μL的生理溶液.

免疫熒光和TUNEL染色

幼魚麻醉，用4% PFA + 0.3% triton在4°C下固定過夜，然后如前所述處理17。一抗為雞抗GFP（A10262；1：500），大鼠抗m櫻桃（11217,1：500），兔抗zap70（細(xì)胞信號，99F2；1：100）。二抗為Alexa Fluor 488山羊抗雞（福爾，A11039；1：300)，Alexa Fluor 555山羊抗大鼠（細(xì)胞信號，4417S；1：400)，Alexa Fluor 647驢抗兔（福爾，A-31573；1：400)。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用tdt介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)檢測細(xì)胞死亡，使用Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647試劑盒（Invitrogen，C10247）。

小鼠用氯胺酮/噻嗪（混合物90/10mg/kg）麻醉，經(jīng)心臟灌注40 mL生理鹽水，然后用40 mL 4%多聚甲醛麻醉。大腦被移除，在4°C下用4%福爾馬林固定4小時(shí)，然后在4°C的20%蔗糖溶液中冷凍保護(hù)過夜，如前所述18,19。用低溫恒溫器（徠卡CM 1950，徠卡）切割30個(gè)μm的切片，并在防凍液中自由漂浮保存。切片用0.3- 0.5%的Triton X-100（Sigma）在PBS中滲透30 min，然后在用10%的驢血清（載體實(shí)驗(yàn)室）和0.3- 0.5%的Triton X-100在PBS中制備的封閉溶液中孵育120 min。一抗CD31（BD制藥蛋白，550274；1：50)抗PDGFRb（研發(fā)，AF1042；1：50)、抗VE鈣粘蛋白（BD藥物，555289；1：50）和抗克勞丁蛋白5（抗體35-2500；1：100）在4°C的阻斷溶液中孵育過夜。第二天，切片在PBS中洗滌三次，然后與以下二抗孵育：AlexaFluor488（杰克遜免疫搜索，712-545-153；1：200）和Cy3（杰克遜免疫搜索，705-165-147；1：200）用含5%驢血清和0.3% Triton的PBS稀釋。對于RAGE/CD31染色，切片用5%的驢血清（載體實(shí)驗(yàn)室）和0.3%的Triton X-100（Sigma）在PBS中阻斷120 min，然后用抗CD31（BD制藥，550274：1：50）一抗在4°C下孵育過夜，用于觀察微血管。第二天，切片用PBS洗滌3次，用PBS稀釋的二抗Cy3（Jackson免疫搜索，712-165-153；1：200）孵育。隨后，使用M.O.M.基本免疫檢測試劑盒（載體實(shí)驗(yàn)室，BMK-2202）對晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）進(jìn)行染色（Santa Cruz，sc-74473；1：200）。使用鏈霉親和素Alexa Fluor488偶聯(lián)物（Invitrogen，S32354；1：200）作為二抗。最后，切片用DAPI溶液1 mg/mL（62248；1：2000），安裝DABCO（西格瑪）和可視化蔡司780共聚焦激光掃描顯微鏡20×/0.50米27或40×/1.30M27油浸目標(biāo)（卡爾蔡司微成像公司），使用405納米二極管激光激發(fā)DAPI，488納米氬激光激發(fā)AlexaFluor488,543納米HeNe激光激發(fā)Cy3。

毛細(xì)血管密度和直徑的分析通過血管分析插件在斐濟(jì)20。包含血管的圖像通道被轉(zhuǎn)換為灰度、二值化和骨架化。毛細(xì)血管密度計(jì)算為每個(gè)視場CD31標(biāo)記陽性像素的百分比，毛細(xì)血管直徑計(jì)算為來自整個(gè)視場的骨骼化圖像的平均直徑。周細(xì)胞覆蓋率是指每個(gè)視野的周細(xì)胞體或過程覆蓋的毛細(xì)血管的百分比。兩種分析均采用從以Bregma -1.46mm為中心的不同切片中捕獲的5個(gè)視野。

延時(shí)顯微鏡

4 dpf幼魚用三卡因（0.168 mg/ml）麻醉，包埋在1%低熔瓊脂糖中。然后，盤子里裝滿了丹尼奧的緩沖液和三卡因（0.168 mg/ml）。使用20X水浸物鏡，每40 min 16小時(shí)獲得大腦共聚焦z堆。為了評估巨噬細(xì)胞的覆蓋和連接覆蓋，斑馬魚幼魚的大腦使用蔡司LSM880 Airy掃描倒置共聚焦顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，該顯微鏡配備了25倍油（NA = 0.8）物鏡。每20-30 min獲得一幀。

圖像分析

使用Imaris軟件（牛津儀器公司）對心肌細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行定量。使用ImageJ中的Volumest插件計(jì)算心室體積。使用ImageJ中的分割編輯器插件對心肌細(xì)胞體積進(jìn)行定量。為了分離單個(gè)心肌細(xì)胞，使用了膜和核制造器。

用ImageJ對腦血管面積進(jìn)行量化，然后歸一化為腦實(shí)質(zhì)總面積，計(jì)算血管密度。使用Imaris表面繪制法測量軀干和腦血管體積。用ImageJ計(jì)算全身和腦實(shí)質(zhì)中死亡細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)量。

在4.5-5 dpf時(shí)，對中腦和后腦區(qū)域（中央動脈）的微血管系統(tǒng)進(jìn)行巨噬細(xì)胞覆蓋和連接覆蓋的分析。共焦圖像使用斐濟(jì)/ImageJ軟件進(jìn)行分析。使用OMERO軟件（https://www.openmicroscopy.org/omero/）進(jìn)行數(shù)據(jù)存儲和數(shù)據(jù)可視化。對每個(gè)幼魚大腦的巨噬細(xì)胞覆蓋率進(jìn)行3次定量（3次技術(shù)重復(fù)次），并分析并繪制每種條件下的重復(fù)平均值。每個(gè)血管段的連接覆蓋被量化為某一血管段區(qū)域連接面積的一小部分。取每個(gè)幼魚所有血管段的定量平均值，并繪制每種條件下的定量圖。

通過計(jì)數(shù)ImageJ中的收縮血管，從4 dpf斑馬魚大腦16小時(shí)的延時(shí)圖像中量化有和不有巨噬細(xì)胞接觸的回歸事件。利用ImageJ21中的斑馬魚血管定量（ZVQ）工作流程，根據(jù)直徑小于5μm、6-15μm到超過15μm之間進(jìn)行血管分類。該工作流程測量了整個(gè)血管床的直徑。然后對血管直徑進(jìn)行分類，并以所有測量值的百分比計(jì)算每類血管的百分比。

小鼠灌注毛細(xì)血管的分析

將熒光素偶聯(lián)的巨型葡聚糖（200000萬達(dá)a，0.1毫升10 mg/ml）和四甲基羅丹明右旋糖酐（40000萬達(dá)a，0.1毫升10 mg/ml）的混合物經(jīng)左股靜脈灌注20分鐘。小鼠立即被宰殺，大腦在4°C下的4%福爾馬林中固定過夜，然后在20%的蔗糖中冷凍保護(hù)，如前所述18,19。使用低溫恒溫器（徠卡CM 1950，徠卡）收集了30微米的切片，并保持自由漂浮。使用DAPI（Invitrogen，62248；1：2000）觀察細(xì)胞核，用蔡司780共聚焦激光掃描顯微鏡和蔡司EC平面新熒光20×/0.50M27成像，并對cd31染色的毛細(xì)血管進(jìn)行分析。兩項(xiàng)分析均使用了從以Bregma -1.46mm為中心的不同切片中捕獲的5個(gè)視野。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

大約50只幼魚被聚集在一起，在TRIzol（生命技術(shù)公司，15596026）中快速冷凍，并在-80℃下保存直到使用。在離子差處理后1、2、3d的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，用TRIzol從整個(gè)幼魚中分離出總RNA。使用上標(biāo)III第一鏈試劑盒（生命技術(shù)公司，18080051），使用3-4μg的RNA進(jìn)行cDNA合成。qRT-PCR使用Luna通用qPCR主混合物（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，M3003）進(jìn)行，并在StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（應(yīng)用生物系統(tǒng)）上運(yùn)行。樣品采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。用管家基因gapdh進(jìn)行歸一化處理。所使用的引物列表見表S1。

熒光激活細(xì)胞分選（FACS）

來自csf1ra：GAL4；UAS：NTR-m幼魚的細(xì)胞在0.26單位/ml自由酶-TL（默克化學(xué)公司，5401020001）中分離，含有1倍F- 68多元醇（費(fèi)舍爾科學(xué)，11495005）。幼魚在37℃的溶液中保存20-30分鐘，并通過移液間歇混合。用1%的BSA在HBSS溶液中停止解離。然后，樣品用0.05% BSA在HBSS溶液中洗滌并重懸。樣品通過40μm的過濾器進(jìn)行過濾，然后用FACSAriaII機(jī)器（BD生物科學(xué)公司）對細(xì)胞進(jìn)行分類。巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞根據(jù)巨噬細(xì)胞特異性的mCherry信號來區(qū)分巨噬細(xì)胞。收集的細(xì)胞旋轉(zhuǎn)下來，在-80℃下保存在TRIzol（生命技術(shù)，15596026）中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

RNA測序

使用TRIzol（Life技術(shù)公司，15596026）從facs分類的巨噬細(xì)胞中提取總RNA，并進(jìn)行下一代測序（Genewitz）。使用SMART-Seq HT試劑盒（TaKaRa，634455）制備了與illumina兼容的測序文庫。在驗(yàn)證了足夠的濃度和適當(dāng)?shù)钠未笮『?，使用Illumina HiSeq（2x150 bp）配置對文庫進(jìn)行測序，每個(gè)通道的數(shù)據(jù)輸出約為350M的對端讀取。使用Trimmomatic v.0.36對序列讀取序列進(jìn)行裁剪，以去除可能的適配器序列和質(zhì)量較差的核苷酸。使用卡利斯托（v0.46.1）對斑馬魚轉(zhuǎn)錄組（GRCz11，Ensembl）進(jìn)行偽定位和獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)。使用Tximport（v1.22.0）將轉(zhuǎn)錄本水平計(jì)數(shù)匯總為基因計(jì)數(shù)，并保持計(jì)數(shù)超過10個(gè)計(jì)數(shù)的基因。為了從批處理效應(yīng)和其他可能的來源中去除不必要的變化，我們使用ruv校正的計(jì)數(shù)（k=3）進(jìn)行進(jìn)一步分析（RUVseq v1.28.0）。采用DESeq2（v1.34.0）比較對照組和離子差處理組之間的差異基因表達(dá)。使用Wald檢驗(yàn)來生成p值和log2倍的變化。調(diào)整后p值<為0.05和絕對log2倍變化>1的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因。

行為分析

Morris水迷宮測試是在一個(gè)專用的房間里進(jìn)行的，該房間配有一個(gè)直徑120厘米、深度60厘米的樹脂圓形池，里面裝滿了以26±1°C加熱至40厘米高的水。在距離泳池邊緣30厘米的地方，放置一個(gè)直徑為8厘米的塑料透明平臺。整個(gè)過程包括5天：視覺試驗(yàn)（第1天）、采集試驗(yàn)（第2-4天）、探針試驗(yàn)（第5天）。在測試的視覺階段（第1天），水保持透明，以使平臺可視化。然后，在采集（第2天至第4天）和探測（第5天）階段，對水進(jìn)行混濁，以掩蓋平臺的位置。所有實(shí)驗(yàn)均在上午9點(diǎn)到下午3點(diǎn)之間進(jìn)行。每次試驗(yàn)將小鼠的釋放點(diǎn)隨機(jī)分配在4個(gè)對稱位置。視覺試驗(yàn)允許驗(yàn)證每個(gè)動物都能夠識別由視覺線索識別的平臺位置。采集階段包括連續(xù)三天，每天進(jìn)行4次試驗(yàn)，允許小鼠在游泳池中自由游泳，直到找到平臺或最長時(shí)間為一分鐘。當(dāng)老鼠找不到平臺時(shí)，它們會被引導(dǎo)到平臺，并允許在平臺上休息10秒鐘。探針試驗(yàn)包括移除平臺，允許老鼠在游泳池中自由游泳一分鐘，記錄在每個(gè)象限中花費(fèi)的時(shí)間。游泳路徑由視頻跟蹤系統(tǒng)視覺視覺15（Noldus，荷蘭）記錄并自動分析。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用qRT-PCR數(shù)據(jù)的單樣本學(xué)生t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并使用本賈米尼-霍赫伯格程序?qū)Χ嘀乇容^進(jìn)行校正。有或不存在巨噬細(xì)胞接觸和血管類別的回歸事件采用雙向方差分析，并采用Bonferroni方法進(jìn)行校正。采用Tukey校正的雙向方差分析方法分析Morris水迷宮的毛細(xì)血管密度、毛細(xì)血管直徑、血管周細(xì)胞覆蓋率、目視和探針試驗(yàn)。采用重復(fù)測量的雙因素方差分析，并對多個(gè)比較進(jìn)行Tukey校正，以檢驗(yàn)組間在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的差異(Morris水迷宮獲取試驗(yàn)，縱向超聲心動圖分析)。所有其他數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性采用雙尾Student 's t檢驗(yàn)。如果進(jìn)行多重比較，則使用Holm-Bonferroni方法調(diào)整p值。p & lt;0.05為顯著性。除另有說明外，n為實(shí)驗(yàn)用動物數(shù)。

結(jié)果

為了便于檢查協(xié)調(diào)高血壓發(fā)病和相關(guān)心血管并發(fā)癥的細(xì)胞和分子機(jī)制，我們建立了一個(gè)斑馬魚模型，能夠以最小的操作捕獲高血壓和相關(guān)器官損傷的特征。與其他高血壓模型相比，我們的方法有三個(gè)主要優(yōu)勢。首先，它依賴于對環(huán)境線索的系統(tǒng)適應(yīng)，而不像在人類高血壓中發(fā)現(xiàn)的那樣，需要基因或手術(shù)操作。第二，處理時(shí)間很短。第三，在幼魚階段使用斑馬魚允許使用實(shí)時(shí)成像方法來發(fā)現(xiàn)病理背后的細(xì)胞機(jī)制。從2 dpf開始，胚胎在去離子水稀釋的丹尼奧緩沖液中飼養(yǎng)，濃度稀釋至1：750，直到4dpf（圖1A）。2天后，濃度降低到1：1500，幼魚進(jìn)一步處理至7dpf（圖1A）。

為了檢測離子缺乏處理是否會導(dǎo)致動脈壓升高，我們測量了背大動脈的血流速度。在患者研究中，不同動脈血管床的流速降低與血壓升高密切相關(guān)。因此，我們觀察到背主動脈舒張末期收縮期峰值速度（圖1B和C）顯著降低，以及在較小程度上的收縮期峰值速度（圖1B和D），表明動脈壓和/或阻力增加。動脈阻力指數(shù)是高血壓患者中與動脈硬化相關(guān)的血管阻力和順應(yīng)性改變的指示參數(shù)，在離子缺乏治療的幼魚中也升高（圖1E）。

RAS失調(diào)介導(dǎo)離子失衡誘導(dǎo)的動脈功能障礙

RAS是血壓調(diào)節(jié)和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵控制系統(tǒng)，是高血壓發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。因此，我們接下來通過描述明顯癥狀出現(xiàn)前Agt和Ren誘導(dǎo)的時(shí)間線和關(guān)系，來研究RAS失調(diào)是否參與了離子缺乏誘導(dǎo)的血管反應(yīng)。為此，我們通過定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）評估了在致病級聯(lián)（2-5dpf）啟動期間暴露于離子缺乏處理的幼魚中這兩個(gè)基因的時(shí)間過程表達(dá)。在離子缺乏處理2天后，agt信使RNA水平顯著升高，而ren的表達(dá)水平在此階段沒有變化（圖1F）。處理3天agt表達(dá)進(jìn)一步升高，ren也升高（圖1F）。此外，我們還研究了RAS拮抗作用對動脈血流變化的影響。氯沙坦，一種競爭的Ang II受體1型拮抗劑（圖1G），確實(shí)減弱了刺激對舒張期測量的動脈血流速度降低和動脈阻力指數(shù)升高的影響（圖1H-K）。我們還研究了在離子缺乏暴露期間，在4-7dpf的晚期使用氯沙坦的影響（圖1G）。有趣的是，這種晚期干預(yù)并不能減輕離子不良治療引起的動脈壓/抵抗表型（圖1H-K）。

總之，這些數(shù)據(jù)突出了新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诓东@人類高血壓的表型和分子特征方面的有用性。此外，這些發(fā)現(xiàn)表明，離子缺乏誘導(dǎo)的離子穩(wěn)態(tài)破壞最初通過RAS失調(diào)導(dǎo)致動脈高血壓的表型表現(xiàn)。阻斷RAS激活可以阻止發(fā)病途徑的早期發(fā)展。然而，一個(gè)或多個(gè)額外的疾病驅(qū)動因素可能隨后參與致病級聯(lián)反應(yīng)，使RAS拮抗作用在后期無效。

圖1 暴露于離子缺乏處理會導(dǎo)致斑馬魚幼魚動脈高血壓的特征。A，對斑馬魚幼魚的5天低滲處理范式的示意圖。B，線形圖描繪了一個(gè)有代表性的對照組和一個(gè)離子缺乏處理的幼魚隨時(shí)間變化的血液流動速度。C-E，柱狀圖顯示，與對照組相比，離子處理不良的幼魚的舒張末期速度(C)收縮速度峰值(D)和較高的動脈阻力指數(shù)。(E)或11只幼魚。F，通過qRT-PCR檢測離子差處理第1、2和3天的agt和ren mRNA水平，結(jié)果顯示agt表達(dá)的進(jìn)行性誘導(dǎo)。在第3天也可檢測到ren的誘導(dǎo)。G，RAS拮抗劑氯沙坦的早期和晚期治療示意圖。H，線形圖顯示，在具有代表性的對照、離子差處理、離子差處理、早期氯沙坦處理和晚期氯沙坦處理的幼魚中，氯沙坦早期處理減輕了離子差誘導(dǎo)的血流速度降低。I-K，柱狀圖顯示早期而非晚期氯沙坦治療對降低離子不良處理的幼魚舒張期末速度(J)和增加動脈阻力指數(shù)(K)的有效性。峰值收縮期速度似乎不受兩種治療時(shí)間的影響(I)。柱狀圖中的結(jié)果以mean±S.E.M.表示。單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示為點(diǎn)圖。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不具有顯著性，t檢驗(yàn)。對P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。

接下來，我們研究了離子缺乏誘導(dǎo)的高動脈壓是否足以驅(qū)動最常與高血壓相關(guān)的心血管并發(fā)癥。事實(shí)上，在5天的離子缺乏處理后，幼魚表現(xiàn)出心室舒張能力的下降，這可以通過舒張期心室壁的運(yùn)動較慢得到證明（圖2A和B）。相反，這些心臟的收縮期速度沒有改變(圖2C）。未受損的射血分?jǐn)?shù)（圖2D)和縮短分?jǐn)?shù)（圖2E)也顯示了收縮功能的保留。

心臟的功能損傷是心肌形態(tài)學(xué)重構(gòu)適應(yīng)不良的結(jié)果。為了研究離子缺乏誘導(dǎo)動脈高血壓可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的細(xì)胞改變，我們將離子缺乏處理模式應(yīng)用于myl7：H2B-GFP；myl7：mKATE-CAAX轉(zhuǎn)基因幼魚，心肌細(xì)胞核和質(zhì)膜分別用H2B-GFP和mKATE-CAAX熒光標(biāo)記。對心肌細(xì)胞大小的分析顯示，缺乏離子處理的心室細(xì)胞體積增加（圖2F和G），表明肥大生長。心肌細(xì)胞死亡常與心臟病有關(guān)，在一定程度上可發(fā)生在肥厚的心臟。因此，我們研究了心肌細(xì)胞數(shù)量的減少是否可能導(dǎo)致機(jī)械舒張的功能障礙。然而，缺乏離子處理的心室包含的心肌細(xì)胞數(shù)量與對照組相似（圖2H和I）。心室體積也不受影響（圖2J和K），提示同軸肥大的建立。與動脈血流變化不同，在離子缺乏誘導(dǎo)的RAS激活的早期或晚期阻斷RAS（圖1G和F）并不能防止心肌舒張功能障礙（圖2L）。這些結(jié)果表明，獨(dú)立于RAS的離子不良治療導(dǎo)致心室舒張功能障礙，與心肌細(xì)胞的適應(yīng)性肥厚重構(gòu)相關(guān)，而沒有心肌細(xì)胞死亡，類似于保留射血分?jǐn)?shù)（HFpEF）的早期心力衰竭的某些功能和形態(tài)學(xué)特征。

圖2 離子失衡斑馬魚模型中RAS非依賴性心室舒張功能失調(diào)重構(gòu)。A，折形圖，描述對照組和離子缺乏處理幼魚心室面積隨時(shí)間變化的曲線圖。B-E，柱狀圖顯示在斑馬魚幼魚中暴露于5天的離子缺乏處理舒張期心室壁速度降低（B，對照=9幼魚，不良=9幼魚），但收縮功能不受影響。F，在5天的離子缺乏處理后，心室壁致密層的心肌細(xì)胞增大，質(zhì)膜上用mKATE-CAAX標(biāo)記。星號表示單個(gè)心肌細(xì)胞。G，柱狀圖顯示了對照組和離子缺乏處理組心肌細(xì)胞體積。H，Tg（myl7：H2B-GFP）幼魚心臟在對照組條件下和離子缺乏條件下飼養(yǎng)5天。心肌細(xì)胞可通過細(xì)胞核H2B-GFP的存在來檢測到。I，柱狀圖顯示了對照組和離子缺乏處理組心室中心肌細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)。J，Tg（myl：mKATE-CAAX）心室的3D投影在離子不良治療5天后顯示大小不變。K，柱狀圖顯示對照組和離子缺乏處理組的心室體積。L，柱狀圖顯示，在離子缺乏治療的早期或晚期，當(dāng)氯沙坦阻斷RAS活性時(shí)，舒張功能障礙的程度相似。柱狀圖中的結(jié)果以mean±S.E.M.表示。單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示在柱狀圖的頂部。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不具有顯著性，t檢驗(yàn)。對P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。

腦血管衰退，血管相關(guān)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞增加，以及離子失衡導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡

在驗(yàn)證了心血管表型的存在和高血壓關(guān)鍵分子標(biāo)志物的升高后，我們接下來研究了斑馬魚模型中靶器官不良重構(gòu)和免疫細(xì)胞參與的細(xì)胞過程。血管損傷作為浸潤性免疫細(xì)胞的主要接觸部位，常被認(rèn)為是全身炎癥與高血壓的發(fā)展及其相關(guān)靶器官損傷之間的機(jī)制聯(lián)系。因此，我們繼續(xù)研究了內(nèi)皮細(xì)胞對離子失衡的反應(yīng)以及與免疫細(xì)胞的相互作用，特別是在之前被證明在RAS誘導(dǎo)的血管損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們首先評估了包括大動脈和靜脈、背主動脈和主脈組成的主干血管床，它們分支成喂養(yǎng)骨骼肌和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的小血管網(wǎng)絡(luò)。kdrl：HRAS-mCherry（內(nèi)皮細(xì)胞被膜定位的哈維大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物（HRAS）標(biāo)記的mCherry熒光標(biāo)記）轉(zhuǎn)基因幼魚的全貼成像顯示，在離子差處理3天后，血管網(wǎng)絡(luò)沒有明顯的形態(tài)學(xué)改變。血管密度，以總組織體積的百分比來測量，在離子缺乏者和對照組中也具有可比性。相比之下，離子缺乏組的血管密度在大腦中明顯降低（圖3A和B）。血管稀疏發(fā)生在整個(gè)大腦深度（圖3B），通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶2’-脫氧尿苷，5’-三磷酸（dUTP）缺口末端標(biāo)記（TUNEL）檢測，與實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡增加相關(guān)，（圖3A和C）。內(nèi)皮細(xì)胞的死亡沒有明顯增加（圖3D），提示細(xì)胞凋亡可能不是離子失衡驅(qū)動的腦血管稀疏的主要機(jī)制。隨后，在處理5天后，也可以檢測到腦容量的減少（圖3E）。

在不同血管床的發(fā)育重構(gòu)過程中，觀察到涉及內(nèi)皮細(xì)胞遷移和重新融入縮回血管段的血管退化，而不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。以前尚不清楚這一細(xì)胞過程是否參與了高血壓對腦血管的重構(gòu)。kdrl：HRAS-mCherry；csf1ra：GAL4；UAS：EGFP轉(zhuǎn)基因幼魚的延時(shí)成像，其中內(nèi)皮細(xì)胞（kdrl+）和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞（csf1ra+）分別用mCherry和EGFP熒光標(biāo)記，顯示在對照條件下飼養(yǎng)的斑馬魚幼魚主要穩(wěn)定的腦血管網(wǎng)絡(luò)（圖3F)。在4.5-5dpf時(shí)，經(jīng)過2天后的離子差處理，我們捕獲了來自同一血管段的內(nèi)皮細(xì)胞的動態(tài)過程，它們相互收縮和遷移，導(dǎo)致血管段的退化（圖3F)。此外，在離子缺乏處理組中，大量位于血管附近的csf1ra +細(xì)胞僅沿著血管碎片移動（圖3G和H）。相比之下，實(shí)質(zhì)csf1ra +細(xì)胞數(shù)量保持不變（圖3G和I），表明巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與血管之間的相互作用增強(qiáng)，但腦實(shí)質(zhì)中所有髓系細(xì)胞沒有擴(kuò)張。

總之，致病途徑由離子缺乏誘導(dǎo)RAS上調(diào)不僅觸發(fā)重構(gòu)心血管系統(tǒng)，而且大腦通過一系列免疫和非免疫細(xì)胞的細(xì)胞反應(yīng)，即增加巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與腦血管，內(nèi)皮遷移介導(dǎo)的血管退化，和腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡的聯(lián)系。有趣的是，離子缺乏誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞退化主要影響微血管（直徑≤為5μm），而不是較大的微血管(圖3J）。此外，延長離子缺乏處理第8天顯示腦血管稀疏進(jìn)展，血管密度進(jìn)一步降低，但沒有明顯的形態(tài)學(xué)異常，除了原始腎，前腎。因此，由離子失衡引發(fā)的全系統(tǒng)反應(yīng)再現(xiàn)了血管、心臟、大腦和腎臟的損傷，這些都是人類高血壓的主要靶器官。

圖3 離子失衡驅(qū)動的腦血管退化和腦細(xì)胞死亡與巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞接觸增加和內(nèi)皮間連接重構(gòu)相關(guān)。A，高血壓腦的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。對5 dpf Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚暴露于低離子處理3天后的腦血管形態(tài)和細(xì)胞死亡（TUNEL+）進(jìn)行了評估。4’，6-二氨基-2-苯林多爾(DAPI，藍(lán)色）標(biāo)記了組織中的所有細(xì)胞核。B，線形圖描繪了3天離子缺乏誘導(dǎo)的血管密度降低（以總組織面積的百分比表示）。C-E，柱狀圖顯示在離子缺乏處理3天時(shí)腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡增加（C）但腦血管中沒有（D），并隨后在處理第5天，和對照組相比，腦容量減少（E）。F，kdrl：HRAS-mCherry；csf1ra：GAL4；UAS：EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的延時(shí)成像，以追蹤缺乏離子的處理和對照組的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞行為的動態(tài)變化。圓圈標(biāo)記了在時(shí)間序列的過程中內(nèi)皮細(xì)胞收縮的位置。G，Csf1ra +巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞（csf1ra：GAL4；UAS：NTR-mCherry）直接接觸和/或定位在靠近血管系統(tǒng)（kdrl：EGFP），或在2天的動物中遠(yuǎn)離腦實(shí)質(zhì)的血管。H，柱狀圖顯示高血壓反應(yīng)后與血管相關(guān)的Csf1ra +細(xì)胞數(shù)量更多。I，柱狀圖顯示了離子缺乏處理和對照組的實(shí)質(zhì)Csf1ra +細(xì)胞數(shù)量。J-L，柱狀圖顯示微血管采樣頻率的降低(J)導(dǎo)致由內(nèi)皮細(xì)胞退化(K)增加和與離子不良治療后巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞接觸相關(guān)的衰退保護(hù)(L)的損失相關(guān)。M和N，離子缺乏處理后內(nèi)皮連接中斷。通過血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM）-EGFP的表達(dá)(M)可以觀察到，內(nèi)皮連接的完整性降低，表示為每個(gè)血管面積的連接覆蓋率的百分比(N)。O，顯示了內(nèi)皮細(xì)胞和塌陷血管中的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用。轉(zhuǎn)基因株系mpeg：GAL4-VP16；UAS：Kaede；kdrl：HsHRAS-mcherry；fli1a：pecam1a-EGFP可以顯示巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮連接。P，柱狀圖顯示，與對照組相比，離子缺乏處理的幼魚中健康血管的巨噬細(xì)胞覆蓋率較低，而塌陷血管的覆蓋率較高。Q，圖像描繪了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞在重排之前的接觸，通過PECAM-EGFP表達(dá)可視化。數(shù)據(jù)顯示為mean±S.E.M.而單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)被疊加到柱狀圖上。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不顯著，t檢驗(yàn)或雙倍方差分析(B).對P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。

內(nèi)皮-巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用和離子失衡誘導(dǎo)的腦血管收縮中的內(nèi)皮連接中斷

接下來，我們旨在進(jìn)一步了解在離子缺乏處理的動物中觀察到的腦血管退化的細(xì)胞機(jī)制。令人驚訝的是，雖然對巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮相互作用與血管衰退之間的關(guān)系的分析顯示，與對照組相比，離子缺乏處理細(xì)胞的衰退更頻繁（圖3K），在對照條件下，與巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的接觸與較少的衰退事件相關(guān)（圖3L），這暗示了先天免疫細(xì)胞的保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，血管周圍的巨噬細(xì)胞有助于增加血腦屏障的通透性，這與高血壓患者內(nèi)皮緊密連接復(fù)雜性的降低有關(guān)。為了評估低離子的處理是否會影響腦微血管中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，我們測量了連接覆蓋范圍，作為處理過和未處理過的幼魚的細(xì)胞接觸面積的估計(jì)值。使用轉(zhuǎn)基因報(bào)告細(xì)胞系fli1a：pecam1a-EGFP定位血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（Pecam1），觀察細(xì)胞間連接，顯示在離子缺乏處理后，沿腦血管網(wǎng)絡(luò)的連接覆蓋率減少（圖3M和N）。為了闡明巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)皮連接重塑和衰退中的作用，我們通過mpeg：GAL4-VP16；UAS：Kaede；kdr細(xì)胞/m EGFP轉(zhuǎn)基因系，通過Kae細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和EGFP的表達(dá)分別觀察巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮連接（圖3O）。除了捕獲收縮前的內(nèi)皮-巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用和血管節(jié)段的重建(圖3O），我們的分析顯示，離子缺乏處理改變了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞沿血管網(wǎng)絡(luò)的分布。在對照條件下，大多數(shù)與血管相關(guān)的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與灌注/充氣的血管相接觸。只有少數(shù)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與衰退事件相關(guān)，而衰退事件是血管床生理成熟的一部分（圖3P）。離子缺乏處理對灌注血管中巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的覆蓋沒有重大影響，但增強(qiáng)了它們與塌陷血管的相互作用（圖3P）?？偟膩碚f，通過對巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞行為的延時(shí)追蹤，不僅揭示了離子失衡在這些細(xì)胞之間的動態(tài)相互作用中的作用，而且還揭示了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞血管保護(hù)功能的改變可能導(dǎo)致微血管收縮的細(xì)胞機(jī)制。此外，我們對連接動力學(xué)的觀察表明，有一種細(xì)胞機(jī)制，這與之前關(guān)于血管修剪的體內(nèi)研究一致。

離子失衡上調(diào)促炎細(xì)胞因子Ifnγ和IL1β，并通過Ifnγ信號通路扭曲巨噬細(xì)胞組織穩(wěn)態(tài)/神經(jīng)保護(hù)表型

為了解決炎癥作為隨后離子失衡信號驅(qū)動導(dǎo)致RAS失調(diào)的作用，并確定介導(dǎo)其對靶器官損傷作用的免疫途徑，我們首先探討了心血管表型的發(fā)展與通常與高血壓和HFpEF相關(guān)的炎癥標(biāo)志物的表達(dá)水平之間的時(shí)間關(guān)系。在離子缺乏處理的第1天，qRT-PCR顯示，與對照組相比，候選細(xì)胞因子的表達(dá)沒有改變（圖4A）。處理2天后，兩種細(xì)胞因子ifng和il1b的表達(dá)水平有細(xì)微增加（約1.5倍），但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。處理第3天的后續(xù)評估顯示，ifng和il1b mRNA的上調(diào)分別超過2倍和8倍（圖4C）。這兩種促炎細(xì)胞因子的升高表明，可能是由RAS失調(diào)引起的系統(tǒng)性炎癥，有助于離子缺乏誘導(dǎo)的致病途徑。

IFNγ是一個(gè)巨噬細(xì)胞亞群激活的基準(zhǔn)刺激，在促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和殺微生物活性方面作用更強(qiáng)。IL1β是IFNγ引導(dǎo)巨噬細(xì)胞上調(diào)的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一。我們假設(shè)，由于Ifnγ升高導(dǎo)致的表型改變，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞血管保護(hù)功能的紊亂，有助于腦血管退化和腦細(xì)胞死亡。為了解決這一假設(shè)，并了解下游信號傳導(dǎo)，我們把從對照和離子缺乏csf1ra：GAL4；UAS：NTR-mcherry幼魚通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）分離的單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq檢測，經(jīng)過3天離子缺乏暴露和心包內(nèi)注射對照V5或抗Ifnγ抗體以阻斷干擾素受體（Ifngr）1的激活（圖4D）。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，不僅先天免疫功能的破壞，而且在離子不平衡時(shí)維持的幾個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)的表達(dá)減弱（圖4E和F）。具體來說，離子差處理的巨噬細(xì)胞下調(diào)了補(bǔ)體系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子H相關(guān)5（cfhl5）和殺菌和先天免疫效應(yīng)肽自然殺傷（NK）-lysin (nkl3和nkl4)（圖4E和F）。參與抗炎反應(yīng)和炎癥消退的不同酶的表達(dá)，如A分解素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域10b（adam10b）、組氨酸氨解酶（hal）和賴氨酸去甲基化酶5A（kdm5a）的表達(dá)也減少了（圖4E和F）。有趣的是，我們觀察到暴露于分泌因子和細(xì)胞表面受體的離子失衡轉(zhuǎn)錄抑制，包括bmp5、核結(jié)合素2a（nucb2a）和叢狀蛋白D1（plxnd1）（圖4E和F），據(jù)報(bào)道在不同的病理環(huán)境下在神經(jīng)元和血管穩(wěn)態(tài)和損傷預(yù)防中發(fā)揮重要作用。重要的是，抗Ifnγ介導(dǎo)的內(nèi)在細(xì)胞因子信號的抑制抑制了離子缺乏驅(qū)動轉(zhuǎn)錄程序的激活（圖4E和G），表明Ifnγ信號是離子失衡反應(yīng)中巨噬細(xì)胞表型改變的關(guān)鍵中介。從我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，我們還注意到，與其同源受體ifngr1不同，ifnγ在巨噬細(xì)胞中沒有檢測到表達(dá)。IFNγ是T細(xì)胞中與高血壓反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志性細(xì)胞因子。有趣的是，離子缺乏處理的魚，顯示在大腦附近有T細(xì)胞的積累，這在對照組動物中很少觀察到，表明這些細(xì)胞參與了巨噬細(xì)胞的失調(diào)。

圖4 以高血壓刺激下巨噬細(xì)胞中ifng和il1b上調(diào)和Ifnγ信號依賴性的神經(jīng)保護(hù)和穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)下調(diào)為特征的系統(tǒng)性炎癥。A，在離子缺乏治療的第1天，高血壓和HFpEF中細(xì)胞因子的表達(dá)未發(fā)生改變。B和C，離子缺乏處理2天和3天后檢測到促炎/Th1細(xì)胞因子ifng和il1b mRNA水平的進(jìn)行性升高。D，從注射抗v5的對照組（對照），注射抗v5的離子缺乏處理3天幼魚，和注射抗Ifnγ（離子差+抗Ifnγ）離子缺乏處理3天幼魚中通過FACS分離巨噬細(xì)胞，然后進(jìn)行RNA-Seq檢測。E，描述對照組、高血壓組和抗ifng處理的高血壓巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)基因（調(diào)整后的P-value<0.05）的熱圖。F和G，火山圖顯示，與對照巨噬細(xì)胞(F)和離子缺乏處理的巨噬細(xì)胞相比，離子缺乏的+抗Ifnγ基因上調(diào)（正Log2倍變化）和下調(diào)（負(fù)Log2倍變化）?；尹c(diǎn)表示沒有差異表達(dá)的基因。（D-G）中的數(shù)據(jù)來自每組3個(gè)生物副本。

Ifnγ信號傳導(dǎo)是離子失衡驅(qū)動的腦血管退化的基礎(chǔ)

接下來，我們利用遺傳功能缺失模型研究了Ifnγ信號在不平衡腦血管重構(gòu)中可能的因果作用：斑馬魚幼魚在編碼ifngr1的基因中存在無義突變。在沒有離子失衡刺激的情況下，ifngr1^?/?幼魚表現(xiàn)出與對照組（ifngr1^+/+）相當(dāng)?shù)哪X血管形態(tài)和密度（圖5A和B）。相比之下，暴露于缺乏離子的介質(zhì)中會導(dǎo)致處理后3天大腦中測量的血管密度降低（圖5A和B）。Ifngr1缺失保護(hù)腦血管免受離子缺乏介導(dǎo)的退化（圖5A和B），表明Ifnγ信號在腦血管系統(tǒng)對離子失衡的致病反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。因此，我們繼續(xù)探討了該細(xì)胞因子是否可能代表了一種能夠預(yù)防和/或減輕表型表現(xiàn)進(jìn)展后的終末器官損傷的治療靶點(diǎn)。

為此，我們在動脈高血壓和腦血管稀疏化（治療3天）后連續(xù)5天的離子不良暴露期間，給予單劑量心包內(nèi)注射抗Ifnγ抗體?？笽fnγ處理模式能夠減輕腦血管的稀疏性（圖5C和D）。有趣的是，晚期抗Ifnγ抗體治療也減輕了離子不良誘導(dǎo)的收縮期和舒張期動脈血流速度的降低（圖5E-G）。然而，通過舒張期的心室壁速度測量，治療并沒有恢復(fù)舒張功能障礙（圖5H）。

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)揭示了炎癥驅(qū)動的高血壓發(fā)病機(jī)制，其中Ifnγ的異常產(chǎn)生驅(qū)動腦重構(gòu)，以腦血管退化和腦細(xì)胞死亡增加為特征。干擾Ifnγ通路的激活可減輕血管損傷和動脈高血壓，但不足以阻止心臟重構(gòu)的進(jìn)展。

補(bǔ)充BMP5可防止離子失衡驅(qū)動的腦血管稀疏

巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組改變和功能失調(diào)，從離子失衡挑戰(zhàn)下的接觸相關(guān)內(nèi)皮退化可以證明，表明Ifnγ介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞旁分泌信號通路的損傷可能是介導(dǎo)腦血管重構(gòu)的潛在機(jī)制。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中Ifnγ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄下調(diào)的下游靶點(diǎn)，通過轉(zhuǎn)錄組分析確定，BMP5，是離子失衡驅(qū)動的腦血管稀疏的重要調(diào)節(jié)因子。為期兩天的治療斑馬魚幼魚重組人BMP5開始離子暴露的第二天防止腦血管稀疏，如圖所示的保護(hù)整體血管覆蓋腦實(shí)質(zhì)（圖5J）和微血管的血管網(wǎng)絡(luò)（圖5K）。因此，我們的發(fā)現(xiàn)提供了進(jìn)一步的機(jī)制，離子失衡引發(fā)的炎癥途徑驅(qū)動腦損傷，其中巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中bmp5信號下調(diào)，導(dǎo)致這些細(xì)胞血管穩(wěn)態(tài)功能的損害，從而破壞內(nèi)皮細(xì)胞間連接和收縮。

圖5 Ifnγ及其下游信號靶點(diǎn)Bmp5調(diào)節(jié)血管對離子失衡的高血壓刺激的反應(yīng)。A，5dpf ifngr1-/-和對照野生型Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚暴露于或不接受離子缺乏處理3天的腦血管系統(tǒng)的代表性圖像。B，柱狀圖顯示野生型對照、ifngr1-/-、離子處理野生型和離子處理ifngr1-/-魚的血管體積（占總組織體積的百分比）。C，Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚暴露于或不受到低離子處理5天的腦血管系統(tǒng)。在離子缺乏治療的第3天出現(xiàn)腦血管稀疏后，單次劑量的anti-Ifnγ部分恢復(fù)了表型，在治療的第5天測量了表型。D，柱狀圖顯示對照抗體（抗v5）注射（對照）、注射抗Ifnγ、離子缺乏處理注射抗v5（離子缺乏處理）和離子缺乏處理的抗Ifnγ注射樣品的血管體積（以總組織體積的百分比表示）。E，具有代表性的抗v5注射（對照）、抗Ifnγ注射、抗v5注射離子（離子差）處理和抗Ifnγ注射離子差處理的幼魚的血流速度線形圖。F，顯示舒張末期速度改善的柱狀圖。G，抗Ifnγ給藥后的收縮期峰值速度。H，抗Ifnγ治療沒有改變心室舒張功能障礙。I-K，人重組BMP5治療可防止離子不良誘導(dǎo)高血壓的腦血管消退。Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚在第二天開始用BMP5處理2天(I)，與用載體處理的貧離子暴露同胞相比，表現(xiàn)出密度(J)和微血管采樣頻率(K)的增加。圖表示mean±S.E.M.個(gè)別的數(shù)據(jù)點(diǎn)也被顯示出來，并疊加在柱狀圖上。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不顯著性，t檢驗(yàn)，或雙向方差分析(J)。對P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。

抗ifn - γ治療可阻止壓力過載小鼠的皮質(zhì)毛細(xì)血管稀疏和血腦屏障破壞

接下來，我們進(jìn)一步研究了斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的IFNγ信號在哺乳動物大腦高血壓損傷中的作用，并在哺乳動物模型中評估了抗IFNγ治療在緩解人類高血壓相關(guān)的不良腦血管重構(gòu)和認(rèn)知障礙方面的功效。為此，我們使用了橫主動脈收縮（TAC）模型，其中局部收縮期高血壓導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)微血管損傷，學(xué)習(xí)和空間記憶減少。我們對C57Bl/6J小鼠進(jìn)行TAC治療4周，并通過超聲心動圖監(jiān)測高血壓心臟重構(gòu)的進(jìn)展。TAC誘導(dǎo)了進(jìn)行性心臟重構(gòu)，其特征是向心性肥大和舒張功能障礙，但沒有收縮功能的喪失，在離子缺乏處理的斑馬魚中觀察到的鏡像表型，類似于HFpEF的典型條件。在TAC小鼠和對照組小鼠中均未觀察到抗IFNγ治療的影響。

對大腦皮層切片進(jìn)行的體外免疫組化（圖6A）顯示了神經(jīng)血管單位的明顯損傷模式。腦毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)分析顯示，與相對假血壓正常的對照組相比，TAC-IgG高血壓小鼠明顯毛細(xì)血管稀少，分化簇31（CD31）標(biāo)記的血管密度降低（圖6B和C），同時(shí)保持正常直徑（圖6D）。此外，TAC-IgG小鼠顯示周細(xì)胞的毛細(xì)血管覆蓋顯著減少（圖6E和F），這是神經(jīng)血管單位完整性的典型標(biāo)志。有趣的是，抗IFNγ治療挽救了在TAC小鼠中觀察到的腦血管缺陷，顯示出正常的毛細(xì)血管密度（圖6B和C）和周細(xì)胞覆蓋（圖6E和F）。

為了研究高血壓對大腦微循環(huán)功能特性的影響，我們給TAC高血壓小鼠和正常血壓對照組注入不同分子量的右旋糖酐，然后剔除小鼠進(jìn)行腦組織學(xué)分析。通過使用高分子量右旋糖酐（2 000 000 Da）（圖6G），我們分析了灌注毛細(xì)血管的密度，進(jìn)一步證實(shí)了與假對照組相比，TAC誘導(dǎo)了顯著的降低（圖6H）。用抗IFNγ抗體處理的TAC小鼠沒有出現(xiàn)毛細(xì)血管稀疏化（圖6H）。此外，聯(lián)合使用低分子量右旋糖酐（40 000 Da）（圖6G），使我們能夠評估通過血腦屏障的外滲。通常，40 kDa的右旋糖酐被完整的血腦屏障保留，但它能滲透受損和滲漏的血腦屏障。如圖6G-I所示，TAC-IgG小鼠的毛細(xì)血管很少，說明它們不能保留低分子量葡聚糖，說明血腦屏障完整性降低。重要的是，用中和性抗IFNγ抗體處理的TAC小鼠顯示出完整的血腦屏障，與假血壓正常的小鼠相當(dāng)。高血壓患者的血腦屏障功能障礙被歸因于Ang II誘導(dǎo)的緊密連接重構(gòu)和胞吞作用的增加。事實(shí)上，內(nèi)皮連接復(fù)合體的關(guān)鍵成分空洞內(nèi)皮（VE）鈣粘蛋白和Claudin5在TAC小鼠的大腦皮層中均下調(diào)（圖7A-C），表明血管連接重構(gòu)。IFNγ中和有效地挽救了這些蛋白的表達(dá)（圖7A-C）。此外，anti-IFNγ治療減少了上調(diào)的受體晚期糖基化最終產(chǎn)物（憤怒），主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)胞吞循環(huán)淀粉樣蛋白-β（Aβ）在BBB52（圖7d和E），暗示其潛在，除了連接穩(wěn)定，抑制經(jīng)血管運(yùn)輸?shù)碾倪M(jìn)入大腦，高血壓認(rèn)知障礙和癡呆的主要原因。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，IFNγ信號通路介導(dǎo)了壓力過載誘導(dǎo)的血腦屏障破壞、毛細(xì)血管稀疏和周細(xì)胞覆蓋范圍的喪失。中和過度的IFNγ激活可以減輕這些表型，保護(hù)小鼠免受腦血管損傷。

圖 6 IFNγ抑制減輕壓力過載腦損傷小鼠模型中腦血管系統(tǒng)的不良重塑。A，顯示小鼠大腦冠狀面的蘇木精和伊紅染色的圖像。虛線矩形表示用于組織學(xué)分析的皮質(zhì)區(qū)域。B，CD31染色的毛細(xì)血管的代表性圖像，用于進(jìn)行毛細(xì)血管的形態(tài)學(xué)和密度分析。C，毛細(xì)血管密度，以每個(gè)視場內(nèi)染色血管的百分比表示，與Sham對照組相比，TAC和非相關(guān)IgG處理的小鼠的毛細(xì)血管密度顯著降低?？筰fn γ抗體對TAC小鼠腦毛細(xì)血管稀薄有保護(hù)作用。D，TAC誘導(dǎo)的慢性高血壓對毛細(xì)血管直徑無影響。E，CD31/血小板源性生長因子受體（PDGFR）β染色的毛細(xì)血管的代表性圖像，用于分析周細(xì)胞-毛細(xì)血管的覆蓋范圍。F，與Sham對照組相比，用非相關(guān)IgG治療的TAC高血壓小鼠的腦毛細(xì)血管周細(xì)胞覆蓋率顯著降低。抗IFNγ治療保護(hù)小鼠免受壓力過載誘導(dǎo)的腦毛細(xì)血管周細(xì)胞損失。G，用高（2000000道爾頓（Da））和低（40000Da）分子量右旋糖酐混合物灌注小鼠大腦毛細(xì)血管的代表性圖像，用于分析灌注功能毛細(xì)血管的密度。H，與Sham對照組相比，TAC和非相關(guān)IgG處理小鼠灌注血管面積百分比的灌注毛細(xì)血管密度顯著降低?？笽FNγ治療保護(hù)TAC小鼠免受腦血管稀疏。I，用低分子量右旋糖酐標(biāo)記的毛細(xì)血管密度，表示每個(gè)視場中滲漏血管的百分比。與假正常血壓對照組和用抗IFNγ抗體治療的TAC小鼠相比，用非相關(guān)IgG治療的TAC高血壓小鼠的右旋糖酐保留能力明顯受損。數(shù)據(jù)顯示為mean±S.E.M.單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示為點(diǎn)圖。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示組間比較。雙向方差分析。對P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。

抗IFNγ治療可預(yù)防壓力超負(fù)荷小鼠的認(rèn)知功能障礙

TAC 4周后，采用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測小鼠的認(rèn)知功能。正如預(yù)期的那樣，所有實(shí)驗(yàn)組都可以在視覺提示的指示下找到并到達(dá)平臺(圖7F)，這表明所有小鼠都具有相當(dāng)?shù)囊曈X和運(yùn)動能力。有趣的是，在測試的獲取階段，雖然使用非相關(guān)IgG治療的TAC小鼠表現(xiàn)出高時(shí)間延遲到達(dá)平臺，但從第一天到第三天的表現(xiàn)沒有任何改善(圖7G)，抗ifn γ治療顯著改善了TAC小鼠的表現(xiàn)，其表現(xiàn)出與Sham小鼠相當(dāng)?shù)膶W(xué)習(xí)曲線(圖7G)。在探針試驗(yàn)中，TAC-anti-IFNγ高血壓小鼠表現(xiàn)出保留的記憶，具有回憶平臺位置的能力。在TAC-IgG小鼠中，同樣的認(rèn)知功能明顯受損，它們隨機(jī)游過這些象限儀（圖7H和I）。因此，除了腦血管保護(hù)外，IFNγ信號通路的阻斷還能夠防止壓力過載引發(fā)的認(rèn)知功能下降。

圖 7 通過抗IFNγ治療預(yù)防壓力過載引發(fā)的內(nèi)皮連接完整性的破壞和認(rèn)知功能下降。A-C，TAC小鼠顯示出粘附蛋白和緊密連接蛋白血管內(nèi)皮細(xì)胞（VE）-鈣粘蛋白和Claudin5的減少，這種作用被抗IFNγ中和所阻止。A，腦毛細(xì)血管ve-鈣粘蛋白和Claudin5染色的代表性圖像，CD31顯示。ve-鈣粘蛋白(B)和Claudin5 (C)的表達(dá)水平以染色面積的百分比表示。D-E，抗IFNγ治療減輕了TAC毛細(xì)血管中RAGEs受體表達(dá)的升高。D，CD31+腦毛細(xì)血管RAGE染色的代表性圖像。E，RAGE表達(dá)水平以染色區(qū)域的百分比表示。F, Morris水迷宮視覺試驗(yàn)中到達(dá)平臺的平均時(shí)間。所有的老鼠都表現(xiàn)出相似的視覺敏銳度和識別平臺的能力。G、在獲取試驗(yàn)中，與Sham小鼠相比，經(jīng)非相關(guān)抗體處理的TAC小鼠表現(xiàn)出尋找平臺的延遲，表明學(xué)習(xí)曲線明顯受損。抗ifn γ抗體對TAC高血壓小鼠的學(xué)習(xí)缺陷有保護(hù)作用。H，探針試驗(yàn)的熱圖，顯示了每組小鼠的首選游泳位置。通過對同一實(shí)驗(yàn)組小鼠在各點(diǎn)游泳時(shí)間的平均得到熱圖。紅色是老鼠花更多時(shí)間游泳的區(qū)域，藍(lán)色是老鼠花更少時(shí)間游泳的區(qū)域。刻度條表示在視場的每個(gè)點(diǎn)上花費(fèi)的累計(jì)時(shí)間的量化，范圍從未訪問點(diǎn)(低分)到首選點(diǎn)(高分)。I，在探針試驗(yàn)中，用非相關(guān)IgG處理的TAC小鼠無法回憶平臺的空間位置，在所有象限中隨機(jī)花費(fèi)時(shí)間。anti-ifNγ治療保護(hù)了TAC小鼠免于記憶缺陷，在平臺之前的象限的時(shí)間明顯更長。結(jié)果以mean±S.E.M.表示。單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示為柱狀圖頂部的點(diǎn)圖。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示組間比較，（G)中##P<0.001表示同一組不同時(shí)間點(diǎn)間比較。雙向方差分析。對P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。N表示被分析的動物的數(shù)量。

討論

本研究揭示了炎癥信號導(dǎo)致高血壓腦損傷發(fā)展的機(jī)制。利用一種新的斑馬魚離子失衡驅(qū)動的RAS失調(diào)模型，我們進(jìn)行了一系列的基因表達(dá)分析和實(shí)時(shí)成像，以了解炎癥性疾病進(jìn)展的時(shí)間進(jìn)程，并識別參與先天免疫細(xì)胞激活的細(xì)胞事件。我們發(fā)現(xiàn)，離子失衡引發(fā)RAS升高和全身炎癥，以Ifnγ和Il1β上調(diào)為標(biāo)志，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的行為和功能顯著改變。我們觀察到巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮接觸相關(guān)的內(nèi)皮連接重塑和收縮，以及細(xì)胞向血管節(jié)段的相反兩側(cè)的橫向遷移，導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)的退化，而對血管細(xì)胞的死亡沒有影響。對TAC壓力負(fù)荷小鼠模型腦血管系統(tǒng)的評估進(jìn)一步支持血腦屏障功能障礙和內(nèi)皮退化發(fā)生微血管重構(gòu)，證據(jù)是連接復(fù)合蛋白表達(dá)減少，毛細(xì)血管密度降低，直徑?jīng)]有變化。獨(dú)立于細(xì)胞凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞退化被認(rèn)為只在血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育的生理修剪中起作用。它與高血壓之間的關(guān)系有些出乎意料。高血壓患者血管重構(gòu)的機(jī)制目前尚不清楚。大多數(shù)研究集中在闡明動脈壁的主要變化，即大動脈管腔大小和剛度增加，中膜厚度增加，小動脈管腔直徑是否減少。高血壓患者血管壁對機(jī)械擾動的適應(yīng)和不適應(yīng)主要與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞激活和炎癥驅(qū)動的間質(zhì)纖維化有關(guān)。這些早期報(bào)道的機(jī)制不太可能參與我們所觀察到的腦血管退化。我們的發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解在離子失衡和壓力過載誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中血管退化的細(xì)胞和分子途徑，這是抵消隨后發(fā)生的大腦功能缺陷的基礎(chǔ)。

腦小血管疾?。–SVDs）是一種與中風(fēng)，認(rèn)知功能惡化和癡呆密切相關(guān)的亞臨床病理學(xué)。高血壓是CSVD的一個(gè)可改變的危險(xiǎn)因素。高血壓驅(qū)動的CSVD和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能下降的機(jī)制尚未完全闡明。我們從斑馬魚和小鼠模型中獲得的研究結(jié)果不僅證明了炎癥介質(zhì)的誘發(fā)作用，與高血壓反應(yīng)的初始觸發(fā)聯(lián)系起來，而且揭示了潛在的信號機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，在RAS誘導(dǎo)后，IFNγ表達(dá)的升高會引發(fā)一系列致病事件，包括巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中血管/神經(jīng)保護(hù)轉(zhuǎn)錄程序的抑制、內(nèi)皮間連接的中斷以及收縮/遷移介導(dǎo)的腦血管消退。最終，神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加和伴隨而來的微血管密度的降低可能導(dǎo)致了IFNγ驅(qū)動的認(rèn)知缺陷。因此，抗IFNγ治療可預(yù)防高血壓刺激下腦血管稀疏和認(rèn)知能力下降的進(jìn)展，這為開發(fā)新的高血壓CSVD的預(yù)防和治療策略提供了機(jī)會?？笽FNγ治療高血壓相關(guān)器官損傷的療效早前已有報(bào)道。在子宮灌注壓降低的大鼠模型中，給予抗IFNγ已被證明可以降低胎盤氧化應(yīng)激和子宮動脈阻力指數(shù)。然而，在離子失衡和壓力過載模型中，IFNγ信號的阻斷并不足以恢復(fù)舒張功能障礙，這表明從這些高血壓刺激到心臟重構(gòu)的進(jìn)展可能涉及一個(gè)IFNγ獨(dú)立的途徑。此前有報(bào)道稱，慢性醛固酮輸注聯(lián)合非腎切除術(shù)和鹽喂養(yǎng)的IFNγ缺陷小鼠表現(xiàn)出高血壓減弱，但舒張功能障礙和左心室肥厚加重。另一方面，IFNGR缺乏減少了心臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積和誘導(dǎo)性心律失常基質(zhì)，但沒有改變Angii灌注小鼠的血壓。目前的研究，連同這些早期的報(bào)告，暗示了不同的刺激參與了心臟的不同反應(yīng)。

除了IFNγ，我們的工作確定了其他潛在的免疫調(diào)節(jié)候選，特別是巨噬細(xì)胞靶向治療策略。生長因子BMPs家族在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)可塑性和損傷反應(yīng)中具有重要的功能。例如，BMP5/7的神經(jīng)保護(hù)作用已在一個(gè)基于α-突觸核素的帕金森病小鼠模型中被報(bào)道。在血管系統(tǒng)中，BMPs維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并參與氧化應(yīng)激觸發(fā)的新血管生成和結(jié)構(gòu)重構(gòu)。Ifnγ介導(dǎo)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中bmp5下調(diào)離子失衡，通過補(bǔ)充bmp5預(yù)防腦血管稀疏，這突出了bmp5作為IFNγ驅(qū)動的先天免疫紊亂和腦病理的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)的作用。IFNγ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型改變導(dǎo)致BMP5表達(dá)減少，這可能是我們在這里觀察到的內(nèi)皮細(xì)胞連接完整性被破壞和內(nèi)皮細(xì)胞收縮的基礎(chǔ)。根據(jù)我們的觀察，之前曾報(bào)道過血管周圍巨噬細(xì)胞抗炎群對內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)的報(bào)道。此外，BMP與yes相關(guān)蛋白1及其副轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子突觸后密度蛋白（PDZ）結(jié)合基序（TAZ）合作，通過控制VE-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換來調(diào)節(jié)內(nèi)皮連接完整性。除了BMP，NUCB2及其切割產(chǎn)物nesfastin-1也可以通過其抗炎和抗凋亡特性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，這在帕金森病和蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠模型中得到了證實(shí)。因此，一項(xiàng)臨床研究報(bào)道了帕金森病患者血清中nesfastin-1水平較低。也有人認(rèn)為nesfastin-1參與了認(rèn)知功能。從我們的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)分子是PlxnD1。雖然它在內(nèi)皮細(xì)胞中的激活可以發(fā)出抗血管生成作用的信號，巨噬細(xì)胞中的PlxnD1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)了血管內(nèi)皮生長因子受體2介導(dǎo)的促血管生成反應(yīng)，暗示其在巨噬細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的串?dāng)_中的作用。與這些神經(jīng)/血管保護(hù)因子相反，在離子缺乏處理的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種分泌酶，肌肽二肽酶1（cndp1）與神經(jīng)退行性變直接相關(guān)。我們的數(shù)據(jù)揭示了這些關(guān)鍵的穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)/血管保護(hù)因子的差異表達(dá)，以及巨噬細(xì)胞中的神經(jīng)退行性生物標(biāo)志物，這為這些分子與先天免疫細(xì)胞功能和高血壓腦重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制之間的聯(lián)系提供了第一個(gè)證據(jù)。此外，這些因子以及補(bǔ)體系統(tǒng)的組成部分和抗菌防御機(jī)制的改變表明，巨噬細(xì)胞對離子失衡的反應(yīng)并不是急性炎癥中常見的典型促炎激活。在免疫靶向治療的發(fā)展中，應(yīng)考慮巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能的紊亂。為此，這里建立的動脈高血壓和心臟舒張功能障礙的斑馬魚模型也為大規(guī)模篩選其他候選治療方法提供了新的機(jī)會。

基金：這項(xiàng)工作得到了Helmholtz-Gemeinschaft(項(xiàng)目編號VH-NG-1247)， Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG，德國研究基金會)- SFB-1470 - A06的資助。在歐洲研究區(qū)域網(wǎng)絡(luò)-心血管疾病(ra - cvd) -腸-腦-免疫- hhd項(xiàng)目框架內(nèi)，以及在dc . h . g.b.和M.P.K.的" ricerca corrente "項(xiàng)目框架內(nèi)，由瑞士國家科學(xué)基金會(310030_200701和310030B_ 176400)資助Markus Affolter(巴塞爾生物中心)。

原文網(wǎng)址：https://academic.oup.com/cardiovascres/article/119/5/1234/6941103

注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。