雜志：ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY
影響因子：11.4（2022）
年份：2022
通訊作者： Ting Xu
通訊作者單位：Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China.
Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, Shanghai 200092, China.
摘要
適當(dāng)?shù)囊曈X功能對于收集環(huán)境信息和支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的決策至關(guān)重要，因此與野生動(dòng)物的生存和人類健康密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，多溴二苯醚（PBDEs）會(huì)損害斑馬魚的視力發(fā)育，而甲狀腺激素（TH）信號通路被懷疑是主要的貢獻(xiàn)者。本研究選擇五溴化PBDE BDE-99，進(jìn)一步探討多溴二苯醚對斑馬魚色覺破壞的作用機(jī)制。結(jié)果表明，BDE- 99在受精后120 h可損害視網(wǎng)膜中的多個(gè)光感受器，干擾斑馬魚幼蟲在色視引導(dǎo)下的行為。雖然由此產(chǎn)生的光感受器模式的改變與3,3’，5-三碘-L-甲狀腺素的作用高度相似，但引入TH受體的拮抗劑并不能完全恢復(fù)這種改變，這表明參與了其他潛在的調(diào)節(jié)因素的參與。通過調(diào)節(jié)中波長視蛋白的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑Six7的表達(dá)，我們證明了Six7在BDE-99的破壞中主導(dǎo)了光感受器模式，而不是THs。我們的工作促進(jìn)了對Six7在光感受器模式形成過程中的調(diào)節(jié)作用的理解，并提出了多溴二苯醚視覺毒性的新機(jī)制。
關(guān)鍵詞：BDE-99，視力障礙，光感受器模式，甲狀腺激素信號傳導(dǎo)，Six7
背景
多溴二苯醚（PBDEs）在其商業(yè)產(chǎn)品被禁止之前，一直是世界上使用最廣泛的溴化阻燃劑。由于多溴二苯醚具有優(yōu)越的化學(xué)穩(wěn)定性，因此仍可在人類生活環(huán)境中廣泛檢測到，包括飲用水、室內(nèi)空氣、和日常食物，通過多種暴露途徑對人類構(gòu)成嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)。其典型的同族物質(zhì)之一，2、2‘、4、4’、5-五溴化二苯醚（BDE- 99）是商業(yè)penta-PBDEs的主要成分（占42?48%），在同族物質(zhì)中具有最強(qiáng)的生物積累能力。盡管BDE- 99在地表水中普遍較低，但在某些特定情況下，如城市污水系統(tǒng)，其濃度可達(dá)到μg/L的水平。PBDE暴露與糖尿病和肥胖等代謝性疾病以及人群中閱讀能力下降、認(rèn)知和記憶能力下降等神經(jīng)發(fā)育缺陷密切相關(guān)。人們普遍認(rèn)為，多溴二苯醚的毒性機(jī)制主要是與甲狀腺激素（THs）類似，不僅因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)相似，而且還因?yàn)樗鼈児蚕淼拇x酶脫碘酶。
視力障礙是多溴二苯醚的一種標(biāo)志性的新興毒理學(xué)效應(yīng)。斑馬魚由于其在幼蟲階段成熟的四色視覺，是此類研究的典型模式生物。BDE-47（四溴化）、BDE-209（脫溴化）、DE-71（商業(yè)混合物）及其代謝物可誘導(dǎo)斑馬魚幼蟲視網(wǎng)膜形態(tài)變化，光感受器細(xì)胞是視網(wǎng)膜細(xì)胞中受影響最大的部分。視網(wǎng)膜（視蛋白）和晶狀體（晶體蛋白）中的核心功能蛋白也可能是BDE-47和BDE-209的靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，BDE-47和DE-71可以改變斑馬魚幼魚的視覺引導(dǎo)行為，包括光動(dòng)力學(xué)反應(yīng)（OKRs）、視動(dòng)反應(yīng)和逃避反應(yīng)。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，BDE-47暴露顯著降低了斑馬魚幼蟲對藍(lán)光刺激的反應(yīng)，這表明幼蟲的色覺也受到了干擾。視覺功能受損往往會(huì)導(dǎo)致無法覓食和逃避野生動(dòng)物的危險(xiǎn)，因此降低個(gè)體的存活率和影響種群的連續(xù)性。對于人類來說，視覺功能障礙和病理除了有不方便的行為外，還與一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)疾病，包括藥物成癮和神經(jīng)退行性變有因果關(guān)系。在阿爾茨海默病患者中，視力退化和色覺障礙的普遍癥狀早于記憶喪失和殘疾。
在顯微鏡下，色覺的建立依賴于不同光感受器的編程模式，其特征通常是視覺視蛋白的不同表達(dá)。巧合的是，THs及其受體（通過TH信號）是眼睛發(fā)育和光感受器模式調(diào)節(jié)器的關(guān)鍵參與者。一般來說，TH信號的作用可以明顯地誘導(dǎo)錐體視蛋白分化為最長波長（LW）敏感的亞型。在TH受體β（THRβ）缺陷的人視網(wǎng)膜類器官中，LW視蛋白幾乎沒有分化；而短波長（SW）和中波長（MW）視蛋白被外源性3、3‘，5-Triiodo-L-甲狀腺素（T3）治療抑制。在T3處理的和甲狀旁腺斑馬魚幼蟲中也觀察到類似的結(jié)果。對于大多數(shù)沒有紅色錐體的哺乳動(dòng)物來說，比如老鼠，T3主導(dǎo)著綠色錐體的發(fā)育。然而，除了TH信號外，光感受器模式還由復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子協(xié)調(diào)。例如，正弦眼同源盒(Six)家族的轉(zhuǎn)錄因子深入?yún)⑴c了視覺系統(tǒng)的發(fā)育，其中一個(gè)成員射線發(fā)現(xiàn)特異性six 7在硬骨魚的MW錐分化中發(fā)揮了重要作用。敲除six 7基因完全消除了MW視蛋白的表達(dá)，但上調(diào)了斑馬魚幼蟲視網(wǎng)膜中LW視蛋白的表達(dá)。Mackin等報(bào)道，外源性T3處理可顯著抑制six 7的表達(dá)，這表明TH信號與six 7之間的潛在關(guān)系。全面了解多溴二苯醚和其他環(huán)境污染物的視力損害也需要考慮這些潛在的因素。
本研究選擇BDE-99研究多溴二苯醚對斑馬魚幼蟲視覺系統(tǒng)的潛在影響，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)視蛋白o(hù)pn1lw1，但抑制所有其他錐體視蛋白。通過干預(yù)相關(guān)調(diào)控因素，我們發(fā)現(xiàn)BDE-99對幼蟲光感受器模式的干擾主要是通過轉(zhuǎn)錄因子six 7而不是TH信號，這為多乙二苯醚誘導(dǎo)的視覺障礙和TH模擬在多乙二苯醚毒性中的作用提供了新的線索。
材料和方法
化學(xué)品BDE-99（99.1%，CAS#60348-60-9）購自Accusparel（美國）。TR拮抗劑1（TRA1,98.89%，CAS#500794-88-7）和T3（≥97%，CAS#5817-39-0）分別來自med化學(xué)快遞公司（瑞典）和Yuanye生物技術(shù)公司（中國）。二甲基亞砜（DMSO，≥99.5%，CAS#67-68-5）購自Sigma-Aldrich（美國）。
斑馬魚（AB菌株）來自上海FishBio有限公司（中國），并保持如前所述。產(chǎn)卵后，將大約50個(gè)正常發(fā)育的胚胎移植出去，并在3小時(shí)內(nèi)暴露在一個(gè)60毫米的玻璃培養(yǎng)皿中。根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測定BDE-99的最終暴露濃度分別為5和50μg/L（含0.01% DMSO和10%無菌Hanks緩沖溶液）。暴露時(shí)間為受精后3h（hpf）至120 hpf，每天記錄胚胎的死亡率和畸形率。T3和TRA1暴露溶液的制備和暴露設(shè)計(jì)與BDE-99相同。T3（4和20 nM）和TRA1（50 nM）的劑量參照之前的研究和我們的初步實(shí)驗(yàn)。所有暴露處理均重復(fù)3次。
BDE-99濃度的定量分析
暴露濃度的量化是基于我們之前的研究進(jìn)行了修改。加入BDE-100（CAS#189084-64-8，美國）作為內(nèi)標(biāo)。采用正己烷進(jìn)行液體?液體萃取，提取BDE-99和BDE-100。然后將提取物在溫和的氮流下濃縮，并用異辛烷進(jìn)行重組。在檢測前將BDE-47（CAS#5436-43-1，Accuspem，US）加入到重組溶液中，以校準(zhǔn)注入引起的誤差。使用安捷倫7890A-HP-5毛細(xì)管柱（安捷倫技術(shù)，美國）分離不同的多溴二苯醚，并使用μECD檢測器進(jìn)行測定。HP-5柱的初始溫度為150°C，持續(xù)1 min，20°C/min上升到200°C，5°C/min上升到250°C，最后保持12 min。注射器和探測器的溫度分別為260°C和290°C。在添加濃度為5 μg/L時(shí)，BDE-99的回收率為88.7%（相對標(biāo)準(zhǔn)差為6.5%）。BDE-99的檢測限（LOD）定義為信噪比的3倍，LOD值為0.2 μg/L。
視覺引導(dǎo)的行為測試
趨光性試驗(yàn)是根據(jù)以往的研究進(jìn)行的。OKR測試和運(yùn)動(dòng)測試分別在VisioBox平臺（法國視點(diǎn)）和Zebrabox平臺（法國視點(diǎn)）上進(jìn)行，如前所述。
RNA提取和qRT-PCR分析
暴露處理后，用TRIzol試劑（Invitrogen，US）提取約30只幼蟲的總RNA，然后按照制造商的說明使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI，US）合成cDNA。使用PowerUp SYBR GreenMix（應(yīng)用生物系統(tǒng)，美國）在7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（應(yīng)用生物系統(tǒng)，美國）上進(jìn)行了定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。目的基因包括視覺感知和TH信號通路相關(guān)基因，管家基因?yàn)棣?actin。采用2?ΔΔCT方法來量化基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。每個(gè)治療組分別進(jìn)行了3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
冷凍切片的制備及H&E染色
暴露結(jié)束時(shí)，用4%多聚甲醛在4°C下固定幼蟲過夜。然后，將幼蟲在分級的蔗糖（10、15和20%）中脫水，最后在20%的蔗糖中浸泡過夜。樣品用O.C.T化合物（服務(wù)生物，中國）包埋，然后使用冷凍星NX50（賽默飛世爾科學(xué)公司，美國）以10 μm的厚度進(jìn)行冷凍和切片。冷凍切片用蘇木精染色8 min，伊紅染色3 min，然后用乙醇洗滌。這些圖像是使用奧林巴斯CX33生物顯微鏡（奧林巴斯，日本）拍攝的。使用ImageJ軟件計(jì)算視網(wǎng)膜不同層的尺寸。
TUNEL染色
簡單地說，使用DeadEnd熒光TUNEL系統(tǒng)（Promega，美國，美國）進(jìn)行TUNEL染色。染色后，冷凍切片用4‘，6-二胺氨基-2-苯乙烯基（Beyotime，中國）覆蓋。使用奧林巴斯IX71熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）捕獲圖像，并使用ImageJ對圖像中的熒光區(qū)域進(jìn)行量化。
對斑馬魚中six7表達(dá)的調(diào)節(jié)
分別通過Crispr/Cas9系統(tǒng)和重建的質(zhì)粒載體建立了six7敲除和過表達(dá)的斑馬魚模型。關(guān)于這些突變斑馬魚所使用的sgRNA和質(zhì)粒的詳細(xì)信息在支持信息附錄，實(shí)驗(yàn)部分中提供。將重建質(zhì)粒載體合成的sgRNA和6個(gè)7mRNA顯微注射到野生型（WT）斑馬魚胚胎中，進(jìn)入單細(xì)胞階段。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)都按照WT模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
分子對接
基于NCBI參考序列（NP_571415.1），利用瑞士在線建模服務(wù)器（http://swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建了THRβ [ Danio rerio]的同源建模，并進(jìn)行了優(yōu)化。然后使用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接，預(yù)測三種成分[BDE-99、T3和全反式維甲酸（RA）]與THRβ的結(jié)合模式和親和力，設(shè)置如前所述。
統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)均以均值的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。采用單因素方差分析，然后采用事后Dunnett的T3多重比較檢驗(yàn)來確定多個(gè)數(shù)據(jù)集之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（SPSS 22.0，IBM，US）。p值<為0.05被認(rèn)為為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
BDE- 99的暴露濃度和急性毒性
暴露5天后，5μg/L（實(shí)際濃度為4.08 ± 0.15 μg/L）組和50μg/L（實(shí)際濃度為43.1414±0.84μg/L）組BDE-99暴露濃度分別下降至標(biāo)稱濃度的14.5%和12.3%。相比之下，在無胚胎的玻璃培養(yǎng)皿中，BDE-99的濃度沒有明顯的變化。結(jié)果顯示，5和50 μg/L BDE-99均未導(dǎo)致斑馬魚幼蟲的明顯死亡或畸形。
BDE-99使斑馬魚幼蟲的視覺功能受損
雖然BDE-99暴露后總游泳距離沒有變化（圖1A，B），但在50 μg/L BDE-99組中，斑馬魚幼蟲的趨光行為受到顯著抑制（p=0.027）（圖1C）。趨光性是斑馬魚幼魚在受到光刺激時(shí)的一種先天行為。綜合結(jié)果表明，斑馬魚具有光感應(yīng)受損的功能和完整的運(yùn)動(dòng)能力。OKR是斑馬魚的注視穩(wěn)定行為，已被廣泛用于模型生物中隱性視覺缺陷的篩選。因此，我們采用經(jīng)典的OKR檢驗(yàn)進(jìn)一步評估了斑馬魚幼蟲的視覺功能。暴露于對照、5和50 μg/L BDE-99的幼蟲平均每分鐘眼跳分別為11 ± 2.5、8.5 ± 1.8和6.8±2.0（圖1D）。BDE-99導(dǎo)致眼跳運(yùn)動(dòng)減少，證實(shí)了斑馬魚幼蟲的視覺功能明顯受損。
圖1 BDE-99對斑馬魚幼蟲視覺引導(dǎo)行為的影響。(A)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)中斑馬魚幼蟲每分鐘游動(dòng)距離。陰影表示SEM。(B)每10 min光/暗期的總游泳距離。(C)去除隔板5或10 min后，斑馬魚幼蟲從黑暗室游到光室的百分比。(D)旋轉(zhuǎn)條紋鼓刺激斑馬魚幼蟲的眼跳運(yùn)動(dòng)。箱形圖顯示了第25、第50和第75個(gè)百分位數(shù)的移動(dòng)。虛線表示平均值。誤差條用SEM表示。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。
BDE-99誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光感受器損傷
視覺引導(dǎo)行為的改變可能暗示了幼蟲視覺系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)損傷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們準(zhǔn)備并觀察了幼蟲視網(wǎng)膜的組織學(xué)切片。在5 μg/L BDE-99處理組的視網(wǎng)膜中沒有觀察到明顯的形態(tài)學(xué)變化，而在暴露在50 μg/L BDE-99組的切片中，發(fā)現(xiàn)光感受器細(xì)胞層的厚度顯著下降（p=0.049）（圖2A，B）。采用TUNEL染色法檢測幼蟲視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。兩種治療組視網(wǎng)膜中均可見TUNEL陽性細(xì)胞，凋亡區(qū)域呈濃度依賴性的顯著升高，而對照組很少發(fā)生凋亡（圖2C，D）。在斑馬魚的視網(wǎng)膜中有幾個(gè)細(xì)胞亞類，包括感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。為了確定BDE-99發(fā)生破壞的位置，我們測試了特定亞類的標(biāo)記。結(jié)果表明，50 μg/L BDE-99顯著降低了gnat2（錐體光感受器標(biāo)記物0.62倍，p < 0.05）和vsx1（雙極細(xì)胞0.77倍，p < 0.05）的相對mRNA表達(dá)。在BDE-99暴露后，錐形光感受器是視網(wǎng)膜中受影響最大的細(xì)胞亞類。
圖2 BDE-99致視網(wǎng)膜損傷。斑馬魚幼魚視網(wǎng)膜的(A) H&E染色（bar = 2 μm）。簡稱：PCL、感光細(xì)胞層；INL、內(nèi)核層、IPL、內(nèi)叢狀層；以及GCL、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。(B)視網(wǎng)膜每層厚度的統(tǒng)計(jì)分析。(C)左圖，視網(wǎng)膜TUNEL染色（bar = 5 μm）。TUNEL陽性細(xì)胞用亮綠色熒光染色。右圖，染色區(qū)域的統(tǒng)計(jì)分析。(D)BDE-99暴露后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物的變化。誤差條用SEM表示。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。
BDE-99改變的光感受器模式類似于T3的作用
斑馬魚具有5種感光細(xì)胞，每種細(xì)胞特異性表達(dá)1 ~ 4種不同的視蛋白。通常，視覺視蛋白的基因表達(dá)譜被用作光感受器模式的反映。在這里，我們測量了6個(gè)錐狀視蛋白，包括opn1sw1、opn1sw2、opn1mw1、opn1mw2、opn1lw1、opn1lw2（極低表達(dá)的opn1mw3和opn1mw4除外）和1個(gè)桿狀視蛋白（視紫質(zhì)，即rho）。BDE-99暴露對除最長波長敏感的視蛋白o(hù)pn1lw1外的所有視蛋白均有顯著的抑制作用（圖3A）。使用我們改進(jìn)的多色OKR測試，我們發(fā)現(xiàn)暴露的幼蟲對綠色和藍(lán)光的眼跳反應(yīng)下降（圖3B）。有趣的是，BDE-99改變的模式類似于TH T3（圖3C，D)。T3對錐體視蛋白表達(dá)的影響表現(xiàn)出與BDE-99完全相同的模式（圖3A），但T3不影響視紫紅質(zhì)的表達(dá)。
THs參與了視覺的發(fā)育和功能。特別是T3強(qiáng)烈引導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為LW錐細(xì)胞，并誘導(dǎo)opn1lw1的表達(dá)。暴露于20 nM的T3使opn1lw1的表達(dá)顯著上調(diào)約12倍，而其他錐體視蛋白的表達(dá)從0.28倍降低到0.56倍。與錐體視蛋白表達(dá)一致，t3處理的斑馬魚幼蟲對短時(shí)間和MW光譜刺激表現(xiàn)出抑制反應(yīng)（圖3B）。同時(shí)，我們還檢測了BDE-99對TH信號通路相關(guān)基因的影響。BDE-99的μg/L顯著上調(diào)了參與T4脫碘到T3的酶dio2的表達(dá)，并輕微下調(diào)了thrb的表達(dá)，證實(shí)了TH信號的穩(wěn)態(tài)被破壞（圖3E）。
圖3 BDE-99暴露影響了幼蟲的光感受器模式、視覺引導(dǎo)行為和TH信號傳導(dǎo)。(A)BDE-99暴露后視蛋白表達(dá)的變化。(B) BDE-99暴露后斑馬魚幼魚的OKR。（C，D）T3的作用與BDE-99非常相似。(E)BDE-99暴露后，TH信號的部分基因發(fā)生了改變。誤差條用SEM表示。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。
TH信號通路不足以解釋BDE-99的作用
為了進(jìn)一步驗(yàn)證BDE-99對光感受器模式的影響是否與T3類似，我們在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中引入了TRA1。TRA1通過競爭性地與THRα和THRβ結(jié)合來拮抗thr介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，它應(yīng)該挽救BDE-99暴露引起的相關(guān)變化。TRA1與BDE-99共處理后，三個(gè)錐體視蛋白和視紫質(zhì)的表達(dá)有恢復(fù)的趨勢，但對opn1mw1、opn1mw2和opn1sw2沒有影響（圖4A；支持信息圖S6）。結(jié)果表明，BDE-99的作用還涉及除THs外的一些潛在因素。例如，它們可能包括轉(zhuǎn)錄因子67，這是斑馬魚中分子量視蛋白的主要誘導(dǎo)劑。31在OKR試驗(yàn)中，在被BDE-99顯著抑制的兩組中，TRA1的引入增加了幼蟲的眼跳反應(yīng)（圖4B）。然而，與最初的BDE-99僅暴露于綠色（MW）光下相比，TRA1增加的反應(yīng)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，分子對接的結(jié)果表明，BDE-99與THRβ的結(jié)合態(tài)度并不類似于T3，但更像是RA，一種被懷疑是SW視蛋白的抑制劑（圖4C）。
考慮到six7在MW視蛋白中的作用，我們也研究了six7表達(dá)的可能變化。雖然BDE-99和T3暴露導(dǎo)致sie7的表達(dá)降低，但BDE-99的作用機(jī)制可能獨(dú)立于TH信號，因?yàn)門RA1幾乎沒有改變BDE-99的影響（圖4D）。
圖4 TRA1未能完全挽救BDE-99引起的光感受模式。(A)TRA1對視蛋白表達(dá)水平的影響。星號表示與BDE-99暴露量相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TRA1對斑馬魚幼蟲OKRs的(B)影響。陰影代表了對照組中幼蟲的眼跳運(yùn)動(dòng)。與T3相比，BDE-99與THRβ的(C)結(jié)合位點(diǎn)更接近于全反式RA。(D)BDE-99、T3和TRA1對轉(zhuǎn)錄因子six7的影響，這是分子量視蛋白的關(guān)鍵調(diào)控因子。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。
six7主導(dǎo)了BDE-99的受干擾的光感受器模式
為了揭示six7和THs在BDE-99誘導(dǎo)的光感受器模式中的作用，我們調(diào)節(jié)了斑馬魚幼魚中six7的表達(dá)，構(gòu)建了敲除（six7 KD）和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因（six7 tg）突變模型，由于注射質(zhì)粒劑量低，six7 tg模型的效果一般較溫和。以T3為陽性對照。在圖5A中，與WT斑馬魚相比，T3處理使six7 KD突變體中opn1lw1的表達(dá)顯著增加了35倍，這強(qiáng)烈表明six7的存在抑制了T3的原始作用。BDE-99與6個(gè)7KD模型暴露后，在LW/MW視蛋白和SW視蛋白之間表現(xiàn)出不同的結(jié)果（圖5B）。BDE-99暴露后，SW視蛋白仍發(fā)生變化，表明SW視蛋白的變化獨(dú)立于six7。此外，在所有模型中，T3均顯著抑制了除opn1lw1外的所有其他錐體視蛋白，而BDE-99則部分抵消了six7 tg模型中six7過表達(dá)的影響。
考慮到Six亞家族（包括six3、6和7）之間的親緣關(guān)系，進(jìn)一步研究了暴露后這些基因的變化。我們的敲除操作是轉(zhuǎn)錄后的；因此，在six KD模型中six的上調(diào)對于某種補(bǔ)償機(jī)制是合理的。過表達(dá)six導(dǎo)致six輕微（但顯著）上調(diào)，這可能是注射質(zhì)粒含量低的原因（圖5C）。簡而言之，BDE-99和T3對six3亞家族的影響存在明顯的差異（圖5C，D）。six7表達(dá)的缺失并沒有改變斑馬魚six6的表達(dá)；然而，BDE-99暴露強(qiáng)烈刺激了six6b的表達(dá)。有趣的是，在WT模型中，T3暴露幾乎抑制了除兩個(gè)six6個(gè)基因外的所有six成員。six6b可能是在MW視蛋白調(diào)控中具有six7功能的輔助因子。six7 tg模型中MW視蛋白水平不變可能與six6b表達(dá)下調(diào)有關(guān)（圖5A，C）。
圖5 six7調(diào)節(jié)對視覺視蛋白和six3亞家族的影響。(A)用T3處理的six7個(gè)突變體的視覺視蛋白的模式。(B)用BDE-99處理的six7個(gè)突變體的視覺視蛋白的模式。(C)用T3處理的six7個(gè)突變體中six3亞家族的模式。(D)用BDE-99處理的six7個(gè)突變體中six3亞家族的模式。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是用用不同的字母標(biāo)記的列來表示的。
圖6 BDE-99致視覺毒性不良結(jié)局途徑的框架示意圖。
討論
該視覺系統(tǒng)已被報(bào)道為環(huán)境污染物的一個(gè)新目標(biāo)，如多環(huán)芳烴，雙酚、多溴二苯醚、和其他替代阻燃劑。在視覺系統(tǒng)的各種組成部分中，具有相應(yīng)視蛋白的光感受器對外來生物暴露最為敏感。在本研究中，5和50 μg/L BDE-99處理組均觀察到視蛋白的破壞，BDE-99對opn1lw1的誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性(圖3A, S2)。視蛋白是一組具有不同光譜敏感性的感光蛋白，視蛋白的遺傳缺陷往往會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的色盲/色弱。有趣的是，我們改進(jìn)的OKR測試顯示，低劑量或高劑量BDE-99處理的幼蟲對藍(lán)綠光刺激的眼跳反應(yīng)下降（圖3B），這與BDE-99誘導(dǎo)的SW和MW視蛋白的下調(diào)相一致。然而，對紅光刺激的眼跳反應(yīng)保持不變（圖3B），我們認(rèn)為原因可能是斑馬魚LW視蛋白的峰值光譜吸光度遠(yuǎn)短于紅光的波長。在現(xiàn)有的研究中，不同的PBDE同系物表現(xiàn)出了以不同方式干擾斑馬魚幼蟲的光感受器模式的潛力。在用BDE-47處理的幼蟲中也發(fā)現(xiàn)了類似的光感受器和色覺的破壞模式。它們的結(jié)果之間的差異在于，BDE-47易受SW視蛋白的影響，而幼蟲OKR對綠光的反應(yīng)相對較溫和。然而，BDE-209對斑馬魚幼蟲視蛋白的作用完全不同，即低劑量刺激了各種視蛋白的表達(dá)，而高劑量則導(dǎo)致了相反的變化趨勢。考慮到BDE-209微妙的微妙生物利用度，我們估計(jì)BDE-209對斑馬魚光感受器模式的影響可能不是主要影響。
核受體經(jīng)常參與污染物引起的視覺損傷。例如，2-乙基己基二苯磷酸通過阻斷RA受體和視黃醛X受體導(dǎo)致日本青鳉的眼睛畸形和視力障礙。芳基烴受體的激活也被懷疑與視力障礙有關(guān)。然而，55多溴二苯醚因其類似于THs的毒理學(xué)作用模式而眾所周知，這已被許多先前的研究證實(shí)。由于通過TH信號的THs和/或THRs在光感受器模式和色覺形成中是必不可少的，BDE-99暴露的后果可能是由于TH信號的中斷，而BDE-99和T3暴露之間的相似性似乎證實(shí)了這一假設(shè)（圖3A，C）。然而，除了TH信號外，其他因素可能參與了BDE-99的視覺毒性，因?yàn)門RA1拮抗并不能完全恢復(fù)光感受器模式的干擾。我們的分子對接分析也表明，BDE-99和THRβ聯(lián)合使用不太可能作為T3對THRβ產(chǎn)生強(qiáng)有力的激動(dòng)作用，USEPA Comptox數(shù)據(jù)庫和之前的一些研究也提供了類似的結(jié)果。
作為斑馬魚分子量視蛋白的主要調(diào)節(jié)因子，six7在本研究中對光感受器模式表現(xiàn)出更深遠(yuǎn)的影響。BDE-99引起的six7的下調(diào)不能被TRA1挽救（圖4D），說明six7可能是TRA1不能恢復(fù)BDE-99誘導(dǎo)的MW視蛋白水平的原因。WT斑馬魚中six7的存在可以將T3暴露后opn1lw1（TH信號標(biāo)記）的表達(dá)量壓縮到six7 KD模型中的1/3（圖5A），過表達(dá)six7可以進(jìn)一步抑制T3對opn1lw1的誘導(dǎo)作用。結(jié)合上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)TH信號（作為LW錐的誘導(dǎo)劑）和six7（作為MW錐的誘導(dǎo)劑）相互作用，以平衡不同種類的光感受器。此外，與BDE-99對WT斑馬魚的明顯影響相比，six7的沉默完全降低了BDE-99對MW和LW視蛋白的影響（圖5B）。因此，BDE-99誘導(dǎo)opn1lw1的關(guān)鍵是six7。BDE-99暴露減輕了被six7抑制的TH信號，而未連接的TH信號最終導(dǎo)致了T3類似物的結(jié)果。
光感受器模式是一個(gè)高度復(fù)雜的、多步驟的過程，其中各種調(diào)節(jié)因子在不同的階段發(fā)揮作用。在其最后階段（錐體分化），脊椎動(dòng)物中最可識別的因子是THs/THRs，它導(dǎo)致了SW錐體和LW/MW錐體之間的LW偏好。對于靈長類動(dòng)物和許多非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物，LW和MW錐的細(xì)分需要額外的調(diào)節(jié)器。到目前為止，只有少數(shù)基因，例如硬骨魚基因six7，被確定為激活MW錐細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)因素，這表明我們對人類和大多數(shù)脊椎動(dòng)物中這種作用的了解相當(dāng)有限。這些因素之間的相互作用在很大程度上也是未知的。有限的證據(jù)表明，補(bǔ)充TH可以抑制WT斑馬魚中six7的表達(dá)，而在甲狀旁腺斑馬魚中six7的表達(dá)沒有變化。通過突變體模型，我們認(rèn)為它們之間的關(guān)系確實(shí)是雙向調(diào)控的。本研究中SW視蛋白的變化，特別是opn1sw2，包含了更多未明確的原因。之前的研究表明，opn1sw2的表達(dá)與six7有關(guān)，與我們的圖4A和5A，B一致。然而，BDE-99對opn1sw2的影響可能是獨(dú)立的，因?yàn)樵趕ix7 KD模型中，BDE-99可以刺激opn1sw2。與LW和MW視蛋白相比，SW視蛋白的隸屬關(guān)系相對較遠(yuǎn)；它們受到不同調(diào)節(jié)因子之間的相互作用的影響。例如，硬骨魚中的生長因子gdf6a與RA的信號通路。據(jù)報(bào)道，DE- 71會(huì)破壞斑馬魚各種組織中RA的穩(wěn)態(tài)，從而對視覺系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響。BDE-99作為DE-71的主要成分，是否能夠同時(shí)影響多個(gè)靶點(diǎn)，第三個(gè)靶點(diǎn)是否是RA信號？為了更好地描述機(jī)制事件和不良結(jié)局之間的聯(lián)系，本文提出了一個(gè)不良結(jié)局途徑的框架，作為BDE-99暴露于視力障礙的毒理學(xué)過程的總結(jié)（圖6）。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)BDE-99暴露于斑馬魚不僅引起視網(wǎng)膜形態(tài)變化和細(xì)胞凋亡，而且還干擾視蛋白表達(dá)和與色覺相關(guān)的異常行為表型。盡管BDE-99對光感受器模式的外部結(jié)果與典型的TH T3高度相似，但THR拮抗劑TRA1未能完全恢復(fù)BDE-99誘導(dǎo)的影響，特別是對MW視蛋白表達(dá)的影響。通過調(diào)節(jié)MW視蛋白誘導(dǎo)劑six7的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)了six7基因在抑制TH信號通路中的新作用。由于BDE-99對six7 KD模型的LW和MW視蛋白影響較小，可以得出BDE-99主要通過six7而不是TH信號破壞斑馬魚幼蟲的光感受器模式。這些結(jié)果可能為揭示多溴二苯醚的毒理學(xué)機(jī)制和光感受器模式中調(diào)節(jié)因子之間的相互作用提供了有用的線索。
基金：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21876135、22036005、92043302）。
詳細(xì)網(wǎng)址：https://doi.org/10.1021/acs.est.1c08914
注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。
蘇州木芮生物科技有限公司
Suzhou Murui Biotech Co.，Ltd.
服務(wù)熱線：0512-8957 3668
地址：江蘇省蘇州市工業(yè)園區(qū)東富路45號聯(lián)創(chuàng)產(chǎn)業(yè)園7幢
手機(jī)：18013764755（微信同號）
郵箱：muruibio@sina.com
