雜志：Cells

影響因子：6（2022-2023）

年份：2023

通訊作者：Erwin van Wijk

摘要

在全球范圍內(nèi)，約有40,000人因ADGRV1基因致病性變異引起的視網(wǎng)膜色素變性(RP)而逐漸喪失視力，目前尚無治療方案。模擬人類表型的模式生物對于揭示ADGRV1相關(guān)RP的確切病理生理機制以及評估未來的治療策略至關(guān)重要?；贑RISPR/Cas的基因組編輯技術(shù)的引入，顯著提高了以時間和成本效益的方式生成突變模型的可能性。斑馬魚被認為是研究Usher綜合征相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的合適模型。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，我們在adgrv1外顯子9 (adgrv1^rmc22)上引入了一個4bp的缺失。免疫組化分析顯示，Adgrv1在adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜連接纖毛的光感受器區(qū)域缺失。在這里，Adgrv1的缺失也導(dǎo)致USH2復(fù)合體成員usher和Whrnb的水平降低，這表明Adgrv1與斑馬魚光感受器中的usher和Whrnb相互作用。將adgrv1^rmc22斑馬魚與野生型對照進行比較時，我們進一步觀察到光感受器細胞體中異常定位的視紫紅質(zhì)水平升高，視網(wǎng)膜電圖(ERG) b波振幅下降，這表明缺乏Adgrv1會導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能受損?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們將adgrv1^rmc22斑馬魚作為第一個顯示早期視網(wǎng)膜功能障礙的ADGRV1突變模型。此外，在評估未來ADGRV1相關(guān)RP的新治療策略的療效時，觀察到的表型變化可作為可量化的結(jié)果指標。

關(guān)鍵詞:ADGRV1；Usher綜合征；CRISPR/Cas9；斑馬魚；視網(wǎng)膜功能障礙；色素性視網(wǎng)膜炎。

介紹

Usher綜合征是一種常染色體隱性遺傳疾病，以色素性視網(wǎng)膜炎(RP)引起的聽力損傷和視覺功能進行性喪失為特征。根據(jù)不同的臨床類型，患者也可能因前庭功能障礙而出現(xiàn)平衡問題。目前，Usher綜合征(USH1-4)根據(jù)發(fā)病、嚴重程度和臨床特征的進展情況可分為四種類型。ADGRV1基因的致病變異，以前被稱為MASS1、VLGR1或GPR98，已被確定為Usher綜合征2C型(USH2C)的潛在原因。這類Usher綜合征的特征是先天性聽力障礙和在沒有前庭功能障礙的情況下進行性視力喪失。在全球范圍內(nèi)，約有40,000人患有USH2C，這些患者可能受益于助聽器或人工耳蝸來減輕他們的聽力損失。然而，目前還沒有治療方案可用于補償ADGRV1相關(guān)的視力喪失。

ADGRV1基因編碼人類已知的最大的細胞表面蛋白:粘附G-protein-coupled受體v1 (ADGRV1)。該蛋白由包含信號肽的非常大的細胞外尾部，多個calx-β結(jié)構(gòu)域，癲癇相關(guān)重復(fù)(EAR)結(jié)構(gòu)域，血栓反應(yīng)蛋白/戊氧嘧啶/層粘連蛋白G樣結(jié)構(gòu)域和GPCR蛋白水解位點(GPS)組成。一個7跨膜區(qū)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)固定在細胞膜上，隨后是一個含有C端I類PDZ結(jié)合基序的短細胞質(zhì)區(qū)域。

在視網(wǎng)膜中，ADGRV1與usherin (USH2A)和whirlin (USH2D)共定位，這些蛋白共同形成光感受器細胞睫狀膜上的USH2復(fù)合物。視細胞分為視桿細胞和視錐細胞兩種，它們都是由外段(OS)、內(nèi)段(IS)、細胞體和突觸末端組成的。OS包含負責(zé)光轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)，并通過連接的纖毛與IS分開。睫狀體周圍區(qū)域的膜，即USH2復(fù)合物所在的位置，形成環(huán)繞連接纖毛的IS的項圈狀延伸。研究表明，USH2復(fù)合物在纖毛周膜和連接纖毛的膜之間形成分子連接。此外，有研究表明，USH2復(fù)合物參與了反式高爾基衍生囊泡的運輸和對接，這些囊泡含有從IS到OS的功能和維護所必需的成分。此外，對于ADGRV1，有假設(shè)認為該蛋白參與線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，并通過局灶黏附的機械感應(yīng)參與細胞的擴散和遷移。然而，ADGRV1相關(guān)RP的確切病理生理機制尚不清楚。

為了進一步揭示ADGRV1相關(guān)RP的病理生理機制，并幫助未來治療策略的發(fā)展，模擬人類表型的合適細胞或動物模型是必不可少的?；颊邅碓吹募毎Ｐ?如成纖維細胞或誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)來源的類器官)為我們提供了在患者自身遺傳和分子背景下進行研究的機會。然而，視覺是一個復(fù)雜的過程，它既依賴于光在視網(wǎng)膜上轉(zhuǎn)化為電刺激，也依賴于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對這些信號的整合和解讀。因此，動物模型對于評估視覺功能水平的治療效果仍然是必不可少的。多種Adgrv1小鼠模型，無論是自然發(fā)生的還是轉(zhuǎn)基因的，已經(jīng)被報道。然而，這些模型僅部分類似于人類表型，因為它們確實存在聽力損失，但不能概括在患者中觀察到的視網(wǎng)膜表型。這可能是由于在表達Adgrv1的光感受器睫狀體周圍區(qū)域的種間解剖差異所致。先前有報道稱，與人類相比，嚙齒動物的光感受器睫狀體周圍區(qū)域在很大程度上是不發(fā)達的，這使得嚙齒動物不太適合研究ADGRV1相關(guān)的RP。作為替代方案，斑馬魚已被認為是研究視網(wǎng)膜功能障礙的一個有吸引力的模型。斑馬魚具有與人類相當(dāng)?shù)囊暰W(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，并且光感受器睫狀體周圍區(qū)域高度保守。此外，斑馬魚的繁殖力高、體外受精、發(fā)育快、胚胎透明等優(yōu)點使其易于進行基因操作和實驗。

基于CRISPR/cas的基因組編輯技術(shù)的引入大大提高了以時間和成本效益的方式生成突變斑馬魚模型的可能性。近年來，一些基于CRISPR/cas9的斑馬魚突變體被生成，以研究USH2A基因致病變異引起的視網(wǎng)膜功能障礙。與小鼠模型相比，這些突變斑馬魚模型(ush2armc1、ush2ab1245、ush2ahzu6和ush2au507)在幼蟲期就已經(jīng)觀察到視網(wǎng)膜功能障礙，盡管沒有明顯的聽力學(xué)表型。

由于需要動物模型來研究ADGRV1相關(guān)的RP，并且斑馬魚被認為是研究視網(wǎng)膜功能障礙的一個有吸引力的模型，我們在這里生成并表征了adgrv1^rmc22斑馬魚模型。在斑馬魚的基因組中，adgrv1基因以單一拷貝的形式存在，與人類ADGRV1基因一樣，由90個外顯子組成。我們利用基于CRISPR/cas9的基因組編輯技術(shù)，在adgrv1中引入蛋白截斷病變，導(dǎo)致Adgrv1缺失，adgrv1^rmc22光感受器睫狀體周圍區(qū)域USH2復(fù)合物成員表達減少。功能分析顯示，敲除adgrv1會導(dǎo)致早發(fā)性視網(wǎng)膜表型。因此，我們提出adgrv1^rmc22突變體作為第一個動物模型，可用于進一步揭示ADGRV1在視網(wǎng)膜中的分子功能，并評估ADGRV1相關(guān)RP的未來治療策略。

材料和方法

野生型AB系斑馬魚和adgrv1^rmc22突變型斑馬魚在奈梅亨Radboud斑馬魚設(shè)施按標準方法繁殖和養(yǎng)護。從野生型和突變型斑馬魚的成對交配中獲得斑馬魚卵。實驗程序按照國際和機構(gòu)指南進行(協(xié)議#RU-DEC, AVD10300202215892)。

CRISPR/Cas9基因組編輯設(shè)計與顯微注射

為了生成adgrv1^rmc22突變型斑馬魚，我們鑒定了CRISPR靶點，并使用網(wǎng)絡(luò)工具CRISPRscan設(shè)計了帶有Cas9設(shè)置的引導(dǎo)rna。對于潛在的脫靶區(qū)，使用至少4個錯配的臨界值來選擇sgRNA?；贑RISPRscan的預(yù)測，我們從Integrated DNA Technologies (IDT)訂購了一個Alt-RTM CRISPR/Cas9 sgRNA，用于adgrv1外顯子9:5’-GGGTATTCAGAGTCAGCCAG-3’上的20bp基因組靶序列。

sgRNA和商業(yè)化的Alt-R?S.p Cas9核酸酶V3 (IDT, Coralville, IA, USA， #1081059)在單細胞期的野生型斑馬魚胚胎中共同注射。為此，制備了100 ng/μL sgRNA、800 ng/μL Cas9核酸酶、300 mM KCl和20% (v/v)酚紅溶液(#P0290, Sigma Aldrich, Amsterdam, The Netherlands)的注射混合物，并在37[數(shù)學(xué)處理誤差]下孵育5分鐘，以使sgRNA-Cas9核糖核蛋白復(fù)合物形成。使用氣動PicoPump pv280 (World Precision Instruments, Friedberg, Germany)將1nl的混合物注射到單細胞期的斑馬魚胚胎中。注射后，胚胎在由5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4和0.1% (v/v)亞甲基藍組成的E3胚培養(yǎng)基中于28.5°C培養(yǎng)。在受精后1天(dpf)，使用高分辨率熔化分析(HRM)分析200個注射胚胎中的16個是否存在基因組編輯事件。在檢測到基因組編輯的HRM特征后，將其余的注射胚胎飼養(yǎng)到成年(F0條魚)。傳播種系突變的創(chuàng)始魚與野生型斑馬魚進行了兩次異種雜交，以進一步減少可能存在的不可預(yù)見的CRISPR/cas9誘導(dǎo)的脫靶修飾。在第二輪異交后，將雜合子魚內(nèi)交產(chǎn)生后代，將純合子魚及其野生型兄弟姐妹用于后續(xù)育種和表型分析。

高分辨率熔融分析

在1 dpf下，注射和未注射的斑馬魚胚胎分別在25 μL熱裂解緩沖液(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA)中取樣，在95°C下孵育20分鐘。裂解物用2.5 μL 1 M Tris pH8中和，稀釋5 - 10倍，作為高分辨率熔融(HRM) PCR分析的輸入，在QuantStudio?3 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)使用Q5?高保真DNA聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)進行分析。#M0491L)和1x evgreen Dye (Biotium, Fremont, CA, USA， #31000)。用于PCR擴增的引物列于表S1。PCR擴增后，通過快速冷卻(4°C/s)至10°C和熔化曲線程序(0.1°C/s)啟動HRM程序，在此過程中收集數(shù)據(jù)。當(dāng)超過25%的注射胚胎(n = 16)出現(xiàn)典型的HRM異工峰時，其余的注射胚胎將被飼養(yǎng)至成年。我們使用Sanger測序在顯示異源雙鏈HRM峰的樣本中驗證基因組編輯事件。

基因分型

用25 μL(胚胎)或75 μL(成年尾鰭)裂解緩沖液(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA)裂解斑馬魚標本，95°C孵育20 min，裂解液分別用2.5 μL或7.5 μL 1 M Tris pH 8中和，稀釋5 - 10倍，作為PCR輸入。采用標準PCR循環(huán)條件擴增引入病變周圍adgrv1外顯子9的基因組區(qū)域。用于PCR擴增的引物列于表S1。擴增子和基因型用Sanger測序確認。

記錄分析

從3個相同基因型的幼魚頭部(液氮速凍)中分離到總RNA。裂解前將幼魚頭部均質(zhì)，根據(jù)制造商的說明(Qiagen, Hilden, Germany)，使用RNeasy Micro試劑盒進行RNA分離。隨后，使用SuperscriptTM IV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA， #18090200)，以100 μg的總RNA為模板進行cDNA合成。使用Q5?高保真DNA聚合酶試劑盒(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA， #M0491L)擴增adgrv1片段，片段長度為外顯子7至外顯子11 (1500 bp)。rpl13擴增子作為參考。循環(huán)條件為:98°C 1 min，循環(huán)35次，98°C 10 s, 68°C 20 s, 72°C 2 min，最后72°C 5 min。隨后，擴增子在2%瓊脂糖凝膠上分離，使用Sanger測序進行分析。表S1列出了用于轉(zhuǎn)錄分析的所有引物。

基因表達分析

按照“記錄分析”所述的相同程序，從每個基因型的5條幼魚(5 dpf)和2條幼魚視網(wǎng)膜(受精后3個月(3 mpf))中分離總RNA并生成cDNA。采用GoTaq qPCR Master Mix (Promega)進行定量PCR。轉(zhuǎn)錄特異性引物針對adgrv1從外顯子84到外顯子85,ush2a外顯子55到外顯子56,whrnb外顯子2到外顯子4。還包括一個針對內(nèi)參基因rpl13的靶標。擴增使用QuantStudioTM 3 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)。采用雙鏈PCR反應(yīng)，用2??Ct法測定與參比基因rpl13相比的相對基因表達量。所使用的引物列于表S1。

抗體，免疫組織化學(xué)和組織學(xué)

斑馬魚幼魚(5dpf)和斑馬魚幼魚的眼睛(3mpf) (adgrv1^rmc22突變體和品系匹配的野生型)在PBS中用10%蔗糖冷凍保護5分鐘，然后嵌入到OCT化合物中(Sakura, Alphen aan den Rijn，荷蘭，Tissue-Tek， #4583)。包埋后，使用液氮冷卻異戊烷緩慢冷凍樣品，并按照標準程序制備7 μm的冷凍切片。未固定的冷凍切片用0.01% Tween-20在PBS中滲透20分鐘，并用封閉緩沖液(10%正常山羊血清和2%牛血清白蛋白在PBS中)封閉30分鐘。在封閉緩沖液中稀釋一抗和二抗，切片與一抗在4℃孵育過夜，隨后用PBS沖洗3次10 min，二抗與DAPI (1:800;D1306;Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)。第二輪沖洗后(用PBS沖洗3次，10 min)，用4%多聚甲醛后固定冷凍切片10 min，然后用PBS沖洗3次，5 min。最后，用延長黃金抗褪色劑(P36930;Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)。使用以下一抗及其稀釋度:兔抗引產(chǎn)(1:1000;#DZ01481, Boster Bio, Pleasanton, CA, USA)，兔抗adgrv1抗體(1:100;# DZ41032;Boster Bio)，兔anti-Whrnb (1:750;# 42690002, Cip98a;Novus Biologicals, Centennial, CO, USA)和小鼠抗中心蛋白(1:500;# 04 - 1624;密理博，達姆施塔特，德國)。以1∶800稀釋度使用二抗(Alexa Fluor 568山羊抗兔(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA， # a -11011)和Alexa Fluor 488山羊抗小鼠(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA， # a -11029))。使用配備AxioCam MCR5相機(蔡司，耶拿，德國)的Zeiss Axio Imager熒光顯微鏡對載玻片進行成像。使用Fiji (v.1.51n)檢測引導(dǎo)強度和Whrnb免疫熒光?；赾entrin免疫染色，分離外節(jié)層。接下來，使用“Find Maxima”選項(噪聲= 25)根據(jù)中心染色生成一個掩膜，并擴張5次。然后，將中心罩和引導(dǎo)層/Whrnb層組合，確定引導(dǎo)層或Whrnb染色的確切位置。隨后，使用“Find Maxima”(噪聲= 10)識別中心區(qū)面具內(nèi)的引導(dǎo)符/Whrnb染色，并使用分水嶺選項分離觸摸物體。將得到的面罩擴張6次，測量引導(dǎo)周圍面積和Whrnb免疫熒光信號。隨后，當(dāng)識別區(qū)域的最大和最小灰度值在引入器/Whrnb免疫熒光的原始圖像上測量時，這可以校正背景噪聲(Analyze Particles選項:大小= 0-180，像素圓度= 0.00-1.00)。

為了進行視紫紅質(zhì)標記，在正常光照條件下(300 lux白光，14/10 h晝夜節(jié)律)，將adgrv1^rmc22斑馬魚和品系匹配的野生型幼魚飼養(yǎng)在透明的10 cm培養(yǎng)皿中，并在6 dpf早上光照后100分鐘采樣。按照先前發(fā)表的方法對4% PFA固定的幼蟲冷凍切片(7 μm)進行染色和成像。作為小鼠抗視紫紅質(zhì)一抗(1:4000，克隆4D2;NBP2-59690, Novus biicals, Centennial, CO, USA)與次級Alexa Fluor 488山羊抗鼠劑(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA， #A-11029)聯(lián)合DAPI (1:800;D1306;賽默飛世爾，馬薩諸塞州沃爾瑟姆，美國)。使用配有AxioCam MCR5相機(蔡司，耶拿，德國)的Zeiss Axio Imager熒光顯微鏡對載玻片進行成像。隨后，對圖像進行盲法和隨機化處理，由兩名研究人員獨立量化視紫紅質(zhì)錯位，方法是手動對每個視網(wǎng)膜切片中視紫紅質(zhì)胞體中具有清晰視紫紅質(zhì)信號的感光細胞數(shù)量進行評分。

為了評估斑馬魚幼魚(3 mpf)和成魚(6 mpf)視網(wǎng)膜的形態(tài)，我們對adgrv1^rmc22突變體和品系匹配的野生型斑馬魚眼睛進行了解剖。在PBS中加入4%多聚甲醛(PFA)，在4°C下固定眼睛過夜，在上升的甲醇系列中脫水，在100%甲醇中孵育過夜。然后用甲醇系列降水至0.1% PBS-Tween-20，再用0.1% PBS-Tween-20中10%的蔗糖冷凍15分鐘，在室溫下用0.1% PBS-Tween-20中30%的蔗糖冷凍1小時。接下來，將眼睛包埋在OCT復(fù)合物(Sakura, Alphen aan den Rijn, the Netherlands, Tissue-Tek， #4583)中，用液氮冷卻的異丁烷緩慢冷凍，并制備冷凍切片(7 μm)，用蘇木精和伊紅染色，使用蔡司Axioscope光學(xué)顯微鏡(蔡司，Oberkochen，德國)進行分析。

視網(wǎng)膜電圖(ERG)記錄

對adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚(受精后6-8周(wpf))和野生型斑馬魚進行ERG記錄。在進行ERG測量前，先將魚暗適應(yīng)至少30 min。用0.016%三卡因甲烷磺酸溶液麻醉魚并切斷脊髓停止心跳。培養(yǎng)皿中充滿瓊脂糖凝膠，并將參比電極放入凝膠中。接下來，將斑馬魚放在這個培養(yǎng)皿中，右眼面向光源。使用25號注射器針頭，在右眼角膜邊緣做一個小切口，置入充滿E3介質(zhì)(5 mM NaCL, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)的記錄電極。連續(xù)兩次100ms白光刺激，強度約為550勒克斯，間隔8 s。隨后，響應(yīng)以700-0.1 Hz的帶通放大10,000倍，并用Signal6.03軟件(劍橋電子設(shè)計有限公司，劍橋，英國)記錄。對記錄進行基線校正，在50毫秒的時間范圍內(nèi)確定基線信號，作為給予刺激前的平均信號。取對兩種光刺激的平均反應(yīng)后計算最大B波振幅。所有的步驟都在昏暗的紅燈下進行。

統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均使用PRISM軟件(v9.0.0)進行。該軟件用于檢查正態(tài)性，計算平均分，并進行雙尾非配對Student 's t檢驗(用于usher和Whrnb定量，視紫紅質(zhì)定位和ERG記錄)。

結(jié)果

分析人類和斑馬魚Adgrv1蛋白結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)的保守性，以確定適合生成adgrv1突變斑馬魚的CRISPR靶區(qū)。人類和斑馬魚Adgrv1具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1A)，多序列比對顯示氨基酸高度保守(52.6%的一致性)。隨后，我們制作了人類ADGRV1中所有蛋白質(zhì)截短的致病性變異體的清單(GPR98 LOVD突變數(shù)據(jù)庫，https://databases.lovd.nl/shared/genes/GPR98;2021年1月4日)?；诖嬖诙喾N蛋白質(zhì)截短變異體(4種獨特的功能缺失變異體)，外顯子9被選擇為目標區(qū)域。利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，我們在adgrv1第9外顯子中引入了一個4bp的缺失(c.1571-1574delCAGA;p.Pro524fsTer (ENSDART00000008043.9))。預(yù)測該移碼突變會導(dǎo)致翻譯提前終止，由此產(chǎn)生的斑馬魚系命名為adgrv1^rmc22。純合的adgrv1^rmc22突變體是可行的，其發(fā)育、形態(tài)和游泳行為均未觀察到異常。此外，沒有觀察到明顯的行為差異表明聽覺功能減弱。對純合幼魚進行轉(zhuǎn)錄分析，以觀察4bp缺失對adgrv1 pre-mRNA剪接的影響。對幼蟲mRNA上從adgrv1外顯子7到外顯子11的擴增子進行擴增，沒有發(fā)現(xiàn)任何可選的剪接事件(圖1B)，而對adgrv1^rmc22擴增子進行Sanger測序證實了轉(zhuǎn)錄水平上的4bp缺失(圖1C)。adgrv1^rmc22樣品的PCR產(chǎn)物強度較低，可能表明突變adgrv1轉(zhuǎn)錄本的無義介導(dǎo)衰變。隨后的qRT-PCR分析證實，在突變樣本中，adgrv1的相對表達量顯著降低(p = 0.0001，雙尾非配對Student 's t檢驗)(圖1D)。

圖1 人類和斑馬魚ADGRV1結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建及純合adgrv1rmc22突變斑馬魚的轉(zhuǎn)錄分析。(A):人和斑馬魚ADGRV1蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)示意圖。這兩種蛋白質(zhì)具有相似的重復(fù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。Calx-β: Ca2+結(jié)合鈣交換器β結(jié)構(gòu)域;Lam G-like:凝血反應(yīng)蛋白/戊氧嘧啶/層粘連蛋白G-like結(jié)構(gòu)域;EAR:癲癇相關(guān)重復(fù)序列;GPCR: G蛋白偶聯(lián)受體;PDZ:突觸后密度95，椎間盤大，封閉帶-1結(jié)合基序。(B):對純合adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)和野生型斑馬魚的adgrv1轉(zhuǎn)錄本進行RT-PCR分析顯示，與野生型adgrv1轉(zhuǎn)錄本相比，突變adgrv1轉(zhuǎn)錄本減少。(C): Sanger測序證實純合adgrv1rmc22幼魚擴增子中存在4個堿基對缺失。(D):野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)中adgrv1轉(zhuǎn)錄本的qRT-PCR分析。采用qRT-PCR技術(shù)對每個基因型5只幼魚進行分析。***表示p = 0.0001(雙尾非配對Student 's t檢驗)。

adgrv1^rmc22光感受器睫狀體周圍區(qū)域缺乏Adgrv1

為了評估在adgrv1外顯子9中引入的基因組損傷對adgrv1表達和亞細胞定位的影響，我們使用針對adgrv1蛋白N末端區(qū)域的抗體，對5 dpf adgrv1^rmc22斑馬魚和野生型幼魚的視網(wǎng)膜冷凍切片進行了免疫組織化學(xué)分析。由于Adgrv1先前被證明定位于連接纖毛附近的睫狀體周圍區(qū)域，anti-centrin被用作連接纖毛的標記物。在野生型幼魚中，Adgrv1確實定位于連接纖毛的光感受器附近，然而，在adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚的視網(wǎng)膜切片中，未能在該位置檢測到Adgrv1蛋白(圖2)。對adgrv1^rmc22和野生型幼魚視網(wǎng)膜(3 mpf)進行的免疫組織化學(xué)分析證實了這些結(jié)果(圖S1A)。

圖2 Adgrv1在野生型和adgrv1rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜冷凍切片中的定位。野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)的視網(wǎng)膜冷凍切片，標記有針對Adgrv1(紅色)和centrin(綠色)的抗體(如圖所示)。細胞核用DAPI反染(藍色)。在野生型斑馬魚中，Adgrv1在連接纖毛標記中心附近檢測到，而在adgrv1rmc22斑馬魚中，該位置未檢測到Adgrv1信號。比例尺:10[數(shù)學(xué)處理誤差]。操作系統(tǒng):外段;CC:連接纖毛;IS:內(nèi)段;ONL:外核層。

Adgrv1的缺失影響USH2復(fù)合物成員usher和Whrnb的定位

由于有人提出Adgrv1與斑馬魚視網(wǎng)膜中的其他USH2復(fù)合物成員相互作用，因此通過免疫組織化學(xué)分析來評估Adgrv1缺失對USH2復(fù)合物成員組成和定位的影響。先前的研究假設(shè)Adgrv1的細胞外區(qū)與usher的細胞外區(qū)相關(guān)，而Adgrv1的細胞內(nèi)區(qū)主要與Whrnb相互作用。免疫組織化學(xué)分析了5dpf adgrv1^rmc22斑馬魚和野生型斑馬魚的視網(wǎng)膜冷凍切片，使用了針對usherin和Whrnb的抗體(圖3)。這兩種蛋白在野生型幼蟲視網(wǎng)膜的光感受器睫周區(qū)域檢測到，靠近連接的纖毛標記中心。然而，在5 dpf adgrv1^rmc22斑馬魚的視網(wǎng)膜中，觀察到usher和Whrnb的熒光信號強烈減弱。信號強度的量化證實了這一點(p < 0.0001，雙尾非配對Student 's t檢驗)。對adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚視網(wǎng)膜(3mpf)的免疫組織化學(xué)分析證實，在較晚的年齡階段，usher和Whrnb的定位也有所減少(圖S1B,C)。在幼蟲和幼體中，光感受器的其他部位沒有明顯的usherin和Whrnb免疫反應(yīng)。這就提出了一個問題，即免疫反應(yīng)性降低是USH2復(fù)合物分解的結(jié)果，還是由基因表達水平改變引起的。因此，我們通過qRT-PCR分析研究了幼蟲和幼體中ush2a和whrnb基因的相對表達水平(圖S2)。與野生型相比，突變體adgrv1^rmc22幼蟲的ush2a轉(zhuǎn)錄本減少了34%，whrnb轉(zhuǎn)錄本減少了26%，而在adgrv1^rmc22幼體中，ush2a和whrnb的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量分別減少了9%和39%。

圖3 adgrv1rmc22斑馬魚幼魚光感受器睫周區(qū)usher和Whrnb的表達降低。野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)的視網(wǎng)膜冷凍切片，染色的抗體針對促素(紅色)(A)或Whrnb(紅色)(B)和中心化蛋白(綠色)。細胞核用DAPI反染(藍色)。(A):在野生型幼蟲中，usherin存在于靠近連接纖毛標記中心的光感受器睫狀體周圍區(qū)域。與野生型(n = 7 adgrv1rmc22突變體幼魚和n = 4野生型幼魚)相比，adgrv1rmc22視網(wǎng)膜切片的引導(dǎo)信號強度顯著降低。(B):在野生型幼魚中，Whrnb存在于靠近連接纖毛標記中心的光感受器睫狀體周圍區(qū)域。與野生型(n = 7 adgrv1rmc22突變體幼魚和n = 6野生型幼魚)相比，adgrv1rmc22視網(wǎng)膜切片中Whrnb信號的強度顯著降低。對熒光信號的強度進行量化(mean [Math Processing Error] SD)，并在相應(yīng)圖片旁邊繪制散點圖。****表示p < 0.0001(雙尾非配對Student 's t檢驗)。比例尺:10[數(shù)學(xué)處理誤差]。

adgrv1^rmc22感光細胞中的視紫紅質(zhì)運輸缺陷

在不同的動物模型中，USH2復(fù)合物蛋白的缺失與視紫紅質(zhì)在光感受器中的運輸受損有關(guān)。因此，我們開始研究視紫紅質(zhì)在野生型(n = 21只眼)和adgrv1^rmc22 (n = 29只眼)幼魚(6 dpf)的光感受器細胞中的定位。使用抗視紫紅質(zhì)抗體進行的免疫組化分析顯示，視紫紅質(zhì)位于野生型幼魚視網(wǎng)膜的光感受器外段。偶爾在野生型光感受器細胞的胞體中也可以觀察到視紫紅質(zhì)，這與之前的研究一致。然而，與野生型相比，adgrv1^rmc22幼魚視網(wǎng)膜部分視紫紅質(zhì)異常定位的光感受器數(shù)量顯著增加(p < 0.0001，雙尾非配對Student 's t檢驗)(圖4)。這一結(jié)果表明，Adgrv1的缺失導(dǎo)致視紫紅質(zhì)的異常纖毛運輸。

圖4 adgrv1rmc22斑馬魚光感受器細胞體中視紫紅質(zhì)的異常定位。(A):在adgrv1rmc22突變體中觀察到的光感受器外段(OS)的視紫紅質(zhì)定位與光感受器細胞體中視紫紅質(zhì)異常定位的示意圖。(B):野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(6 dpf)的視網(wǎng)膜冷凍切片，標記有針對視紫紅質(zhì)的抗體(綠色)。細胞核用DAPI反染(藍色)。與野生型相比，adgrv1rmc22幼魚(用白色箭頭表示)的視紫紅質(zhì)定位異常的光感受器數(shù)量明顯增加。(C):繪制每張視網(wǎng)膜切片中視紫紅質(zhì)定位異常的細胞總數(shù)，用平均SD (n = 29 adgrv1rmc22突變體幼魚和n = 21野生型幼魚)。雙尾非配對Student 's t檢驗顯示adgrv1rmc22突變型與野生型之間存在顯著差異。****表示p < 0.0001，比例尺:10[數(shù)學(xué)處理錯誤]。CC:連接纖毛;IS:內(nèi)段;ONL:外核層;INL:內(nèi)核層。

adgrv1^rmc22斑馬魚顯示視覺功能下降

最后，我們記錄了adgrv1^rmc22幼魚(6-8 wpf, n = 35)和年齡和品系匹配的野生型幼魚(n = 31)的視網(wǎng)膜電圖(ERG)痕跡，以評估光感受器包膜區(qū)Adgrv1的缺失是否對視覺功能有影響。與野生型相比，adgrv1^rmc22突變體的最大B波振幅顯著降低(16%)(p = 0.011，雙尾非配對Student 's t檢驗)(圖5)，這表明adgrv1^rmc22幼魚的視覺功能受損。

圖5 視網(wǎng)膜電圖記錄顯示adgrv1rmc22幼魚視網(wǎng)膜功能受損。(A): adgrv1rmc22和野生型斑馬魚的代表性ERG痕跡。(B): adgrv1rmc22與野生型斑馬魚相比，最大B波振幅顯著降低(* p < 0.01，雙尾非配對Student 's t檢驗)。在受精后6-8周的幼魚(n = 35 adgrv1rmc22突變型和n = 31野生型)的眼睛上記錄了ERG的痕跡。野生型B波平均振幅歸一化為1。平均B波振幅[數(shù)學(xué)處理誤差]SD在柱狀圖中繪制。

討論

由于ADGRV1基因突變，Usher綜合征2C型患者表現(xiàn)為先天性聽力障礙和RP導(dǎo)致的進行性視力喪失。在缺乏預(yù)防ADGRV1相關(guān)RP的治療策略的情況下，一個類似于人類視網(wǎng)膜表型的合適模型對于揭示確切的病理生理機制和評估未來的治療策略至關(guān)重要。在這項研究中，我們生成并鑒定了adgrv1^rmc22斑馬魚作為ADGRV1相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的模型。利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，我們在斑馬魚adgrv1外顯子9中引入了一個4bp的缺失。我們已經(jīng)證明，adgrv1^rmc22等位基因?qū)е鹿飧惺芷鹘逘铙w周圍區(qū)域Adgrv1缺失，其缺失導(dǎo)致USH2蛋白復(fù)合物解體。此外，在adgrv1^rmc22突變體的幼魚中觀察到視紫紅質(zhì)異常定位的增加，ERG記錄表明adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚的視網(wǎng)膜功能下降?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們提出adgrv1^rmc22斑馬魚作為研究adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的合適模型。

到目前為止，僅報道了Adgrv1突變小鼠模型，與本文報道的adgrv1^rmc22突變斑馬魚不同，該模型在視網(wǎng)膜表型不明確的情況下表現(xiàn)出了聽覺表型。然而，近年來斑馬魚被認為是研究ush2a相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的合適模型。由于在體外受精，斑馬魚很容易受到基因操作，與基于ZFN和TALEN的基因組編輯相比，CRISPR/Cas9技術(shù)的引入從根本上減少了生成靶向敲除模型的工作量。為了填補動物模型研究adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的空白，我們制作了CRISPR/cas9誘導(dǎo)的adgrv1^rmc22突變斑馬魚。

免疫組化分析證實野生型斑馬魚視網(wǎng)膜連接纖毛區(qū)域存在USH2蛋白Adgrv1、usherin和Whrnb，這與前人研究一致。我們發(fā)現(xiàn)，在adgrv1的N端區(qū)域引入蛋白質(zhì)截斷突變導(dǎo)致光感受器細胞的睫狀體周圍區(qū)域缺乏蛋白質(zhì)。迄今為止，只研究了morpholino反義寡核苷酸誘導(dǎo)的敲除后Adgrv1缺失對斑馬魚視網(wǎng)膜的影響。然而，Ebermann等在他們的研究中并沒有報道adgrv1被敲除后出現(xiàn)視網(wǎng)膜缺陷。當(dāng)我們將adgrv1^rmc22斑馬魚與adgrv1敲除幼魚進行比較時，觀察到的視網(wǎng)膜表型差異可能歸因于morpholino反義寡核苷酸誘導(dǎo)的短暫和部分敲除，而不是CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的永久性蛋白質(zhì)截斷突變。另外，免疫組織化學(xué)分析顯示，Adgrv1在adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜中的缺失也導(dǎo)致了usherin和Whrnb熒光信號的強烈減少。這些結(jié)果證實了我們之前基于在ush2armc1和ush2ab1245斑馬魚中的類似結(jié)果而提出的這些蛋白在正確形成睫狀周USH2蛋白復(fù)合體中的相互依賴性。因此，我們的研究結(jié)果證實了Adgrv1在斑馬魚光感受器睫狀體周圍區(qū)域與其他USH2蛋白介導(dǎo)蛋白和Whrnb蛋白復(fù)合物相互作用的模型。為了揭示該區(qū)域的usherin和Whrnb的免疫反應(yīng)性降低是由于USH2復(fù)合物的分解，還是由于基因表達水平的改變，我們分析了ush2a和Whrnb的基因表達水平。在adgrv1^rmc22突變體幼魚中，ush2a和whrnb的相對基因表達量分別下降了34%和26%，具有統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)報道，僅20%的功能性ush2a轉(zhuǎn)錄本就足以導(dǎo)致斑馬魚光感受器睫狀體周圍區(qū)域的引導(dǎo)定位。因此，adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜中usherin和Whrnb定位減少可能是Adgrv1缺失導(dǎo)致USH2復(fù)合物解體的結(jié)果。

據(jù)推測，USH2蛋白網(wǎng)絡(luò)有助于向光感受器外段運送諸如視紫紅質(zhì)的纖毛。人們也普遍認為，由于纖毛運輸功能障礙而導(dǎo)致的內(nèi)節(jié)蛋白質(zhì)的積累可能是通過激活細胞應(yīng)激途徑導(dǎo)致光感受器變性的基礎(chǔ)。此外，有報道視紫紅質(zhì)定位錯誤導(dǎo)致異位光轉(zhuǎn)導(dǎo)，這一過程已被發(fā)現(xiàn)加速光感受器細胞死亡。adgrv1^rmc22幼魚視網(wǎng)膜部分中視紫紅質(zhì)異常定位的光感受器數(shù)量的顯著增加確實支持了纖毛蛋白運輸缺陷可能是adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜變性起源的觀點。有趣的是，對幼年(3 mpf)和成年(6 mpf) adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜進行的組織學(xué)檢查未顯示進行性視網(wǎng)膜變性的任何跡象(圖S3)，因為adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜各層在形態(tài)學(xué)上與野生型視網(wǎng)膜難以區(qū)分。然而，與之前發(fā)表的ush2a突變型斑馬魚模型相一致，在ush2a突變型斑馬魚模型中，與野生型相比，也沒有觀察到形態(tài)學(xué)差異。光感受器細胞無進行性變性的一個合理解釋是斑馬魚視網(wǎng)膜的再生能力，因為與人類視網(wǎng)膜不同，斑馬魚視網(wǎng)膜能夠替代失去的視網(wǎng)膜神經(jīng)元。錯誤定位的視紫紅質(zhì)導(dǎo)致光感受器細胞死亡的光毒性作用可能因此被持續(xù)的光感受器再生所掩蓋。在adgrv1^rmc22斑馬魚中，缺乏進展型表型，纖毛周圍區(qū)域USH2蛋白復(fù)合體的恢復(fù)和正常的視紫紅質(zhì)運輸提供了有價值的生物標志物，可用于評估adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜變性的未來治療策略。

在本研究中，我們評估了定位于光感受器睫狀體周圍膜的Adgrv1的功能。有趣的是，最近的一篇論文在來自Vlgr1缺陷小鼠模型的細胞中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(MAMs)上的ADGRV1，這表明ADGRV1具有一種新的功能。這些細胞膜上缺乏ADGRV1會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的距離增加，并減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放，從而破壞細胞的生物能量學(xué)。由于光感受器細胞的高能量需求，很容易推測這些機制也可能是光感受器細胞功能障礙的基礎(chǔ)。然而，根據(jù)我們的免疫組織化學(xué)分析，我們沒有發(fā)現(xiàn)Adgrv1存在于光感受器細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和MAMs上的跡象，因為這需要高分辨率顯微鏡技術(shù)。

最后，我們對adgrv1^rmc22 (6-8 wpf)突變體幼魚和野生型幼魚的眼部進行了ERGs記錄。在這個年齡，斑馬魚的桿狀和錐狀光感受器被認為是成熟的，兩者都有助于視覺功能。當(dāng)檢查ERG痕跡時，首先觀察到一個小的初始A波，代表光感受器細胞的超極化。A波在很大程度上被隨后的代表ON雙極細胞去極化的B波所掩蓋。ERG記錄顯示，與野生型相比，adgrv1^rmc22斑馬魚的B波振幅顯著下降。B波振幅的下降可能是光導(dǎo)或向ON雙極細胞的信號傳導(dǎo)缺陷的結(jié)果。無論如何，adgrv1^rmc22斑馬魚B波振幅的顯著下降可以被認為是視網(wǎng)膜功能受損的一個指示。這些結(jié)果與之前發(fā)表的關(guān)于ush2a突變斑馬魚幼魚眼睛的ERGs記錄一致，其中記錄了類似的B波振幅降低。

結(jié)論

綜上所述，我們建立了一個adgrv1^rmc22突變斑馬魚模型，值得注意的是，這是第一個表現(xiàn)出早期視網(wǎng)膜功能障礙的ADGRV1突變動物模型。先前的研究已經(jīng)證明了斑馬魚作為研究視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的模型的轉(zhuǎn)化價值。此外，Schellens等人和Dulla等人的研究已經(jīng)證明斑馬魚在評估治療策略時的相關(guān)性，如USH2A相關(guān)性RP的單外顯子或雙外顯子跳躍治療。具體來說，我們在adgrv1^rmc22幼魚的光感受器細胞中觀察到的早期分子表型為評估和優(yōu)化adgrv1相關(guān)RP的潛在治療策略提供了一個絕佳的機會。因此，本研究的斑馬魚模型使我們朝著adgrv1相關(guān)RP的未來治療又邁進了一步。

原文：Stemerdink M, Broekman S, Peters T, et al. Generation and Characterization of a Zebrafish Model for ADGRV1-Associated Retinal Dysfunction Using CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology[J]. Cells, 2023, 12(12): 1598.

原文地址：https://doi.org/10.3390/cells12121598

注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻，以及補充圖、表可以點擊至原文查閱。