雜志：International Journal of Molecular Sciences

影響因子：5.6（2022-2023）

年份：2023

通訊作者：Dong Liu

通訊作者單位：Nantong Laboratory of Development and Diseases, School of Life Sciences, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong 226001, China

摘要

感覺毛細胞(HCs)損傷是感覺神經(jīng)性聽力損失的主要原因，但由于許多潛在的耳聾基因尚未確定，其病理機制尚未完全了解。N-myc下游調(diào)控基因2 (ndrg2)通常被認為是腫瘤抑制基因和細胞應激反應基因，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡和侵襲，但其在斑馬魚HC形態(tài)發(fā)生和聽力中的作用尚不清楚。本研究通過原位雜交和單細胞RNA測序結(jié)果表明，ndrg2在耳部囊泡和神經(jīng)鞘的HCs中高度表達。Ndrg2功能喪失幼蟲表現(xiàn)為嵴細胞減少、纖毛縮短、神經(jīng)肥大和功能細胞減少，可通過顯微注射Ndrg2 mRNA進行挽救。此外，ndrg2缺乏引起對聲振動刺激的驚嚇反應行為減弱。在機制上，ndrg2突變體沒有檢測到HC凋亡和支持細胞的變化，并且HCs能夠通過阻斷Notch信號通路而恢復，這表明ndrg2參與了Notch介導的HC分化。綜上所述，本研究利用斑馬魚模型證明了ndrg2在HC發(fā)育和聽覺感覺功能中起著至關(guān)重要的作用，這為識別潛在的耳聾基因和HC發(fā)育的調(diào)控機制提供了新的見解。

關(guān)鍵詞:ndrg2;毛細胞;聽力損失;斑馬魚;切口;細胞分化。

介紹

聽力損失會損害患者的身心健康，這可能是由多種因素引起的，包括遺傳缺陷、耳毒性藥物、大聲噪音和衰老。感覺毛細胞(HCs)是一種敏感的機械感受器，存在于聽覺器官中，介導聽覺和平衡感覺，它們的損傷是感覺神經(jīng)性聽力損失的最常見原因。由于哺乳動物內(nèi)耳HC損失的不可逆性和不可重復性，有必要揭示HC發(fā)展的關(guān)鍵基因和途徑，為人類聽力損失提供潛在的治療方法。毛細胞的發(fā)育和存活經(jīng)歷了前感覺細胞退出細胞周期，表達轉(zhuǎn)錄因子，最終分化為感覺毛細胞(HCs)和非感覺支持細胞。這一極其復雜且高度協(xié)調(diào)的過程受到多種關(guān)鍵因子的調(diào)控，如Atoh1和p27Kip1，以及包含Notch/Wnt/Atoh1、MAPK、PI3K/Akt、鈣通道和氧化應激/ROS的細胞信號通路。盡管在闡明HC發(fā)育和再生的分子機制方面已經(jīng)做了很多努力，但仍有許多潛在的耳聾基因有待發(fā)現(xiàn)和鑒定。

在聽覺研究中，鳥類、小雞、斑馬魚、小鼠和大鼠是常用的模式生物。哺乳動物具有與人類相似的典型耳蝸結(jié)構(gòu)，但哺乳動物模型解剖程序復雜，通量低，在應用上存在一定障礙。斑馬魚雖然沒有耳蝸，但內(nèi)耳有聽覺器官，即耳囊和側(cè)線(LL)感覺系統(tǒng)，這使其適合用作經(jīng)濟的非哺乳動物脊椎動物模型。耳小泡由三對半規(guī)管、耳室和耳囊組成，主要負責平衡和聽力功能。此外，魚類獨有的LL系統(tǒng)可以檢測聲音和水流，這些聲音和水流來源于原基在體表固定位置的遷移和沉積，形成成熟的神經(jīng)桿陣列。斑馬魚的感覺細胞被支持細胞緊密包圍，其結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動物的內(nèi)耳相似。斑馬魚具有繁殖力強、易于遺傳操作和體內(nèi)成像等先天特點，在藥物耳毒性評價、耳保護劑篩選、聽力相關(guān)基因功能鑒定、HC發(fā)育再生機制研究等方面得到了廣泛的應用。

N-myc下游調(diào)控基因2 (NDRG2)屬于NDRG基因家族，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡以及細胞遷移和侵襲等細胞生物學過程。大量關(guān)于該基因功能的研究表明，NDRG2作為一種腫瘤抑制基因，在許多腫瘤問題中發(fā)揮著抗增殖和促凋亡的作用，如結(jié)直腸癌、胃癌、肝細胞癌等。同時，NDRG2蛋白水平與腫瘤分期和侵襲行為呈負相關(guān)，可作為腫瘤進展和預后的生物標志物。近年來，NDRG2基因在許多類型的細胞和組織中都有促分化作用的報道。例如，在單核細胞和樹突狀細胞之間的分化中觀察到NDRG2基因的強烈表達。NDRG2還能促進bmp2誘導的成骨細胞分化和鈣化，促進結(jié)直腸癌的分化。此外，NDRG2主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細胞中，被認為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)因子，包括膠質(zhì)瘤、中風、神經(jīng)退行性疾病和精神疾病。同源基因ndrg2在斑馬魚早期胚胎的卵泡中特異性表達。此外，從我們之前對HCs單細胞RNA測序的研究數(shù)據(jù)中，我們知道ndrg2基因在斑馬魚的HCs中高度富集(GSE221471)。這些數(shù)據(jù)幫助我們合理地推斷ndrg2在一定程度上參與了HC的發(fā)育和聽覺系統(tǒng)的形成。不幸的是，ndrg2基因在聽覺器官發(fā)育中的作用程度仍然很大程度上是未知的。

本文探討了ndrg2在斑馬魚HC發(fā)育和聽感覺器官功能中的作用。建立ndrg2功能缺失模型，分析HCs的形態(tài)和功能表型。這項工作不僅加深了對ndrg2功能的認識，而且為HC發(fā)育的調(diào)控機制提供了新的認識。

斑馬魚品系和培養(yǎng)

轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(Brn3c:mGFP)和野生型AB株在28.5°C下繁殖，并按照先前協(xié)議中描述的標準程序維持。產(chǎn)卵胚用E3培養(yǎng)基在28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為避免色素形成，在受精后20 h (hpf)用0.2 mM PTU (1-phenyl-2-thiourea, Sigma, Saint Louis, MO, USA)溶液替換胚胎培養(yǎng)基。胚胎發(fā)育階段按照標準準則進行分割。所有動物實驗均經(jīng)南通大學動物保護與利用委員會批準。許可編號S20210310-007，批準日期:2021年3月10日。

全載原位雜交

按照以下標準程序進行斑馬魚全載原位雜交(WISH)。利用設(shè)計的引物PCR擴增出531 bp的斑馬魚ndrg2基因cDNA片段(表S1)，并將其克隆到pGEM-T-easy載體中。將pGEM-T-easy插入ndrg2片段線性化后，使用DIG RNA標記試劑盒(SP6 & T7) (Roche， #11175025910, Indianapolis, IL, USA)，通過體外轉(zhuǎn)錄制備地高高素標記的ndrg2反義mRNA探針。隨后，經(jīng)過一系列處理，包括4% (w/v)多聚甲醛(PFA)固定、蛋白酶K消化和預雜交混合物孵育，不同發(fā)育階段的胚胎用ndrg2 mRNA探針雜交過夜。最后，采用堿性磷酸酶(AP)-偶聯(lián)抗地高igenin抗體(Roche， #11093274910)和AP-底物NBT/BCIP溶液(Roche， #11681451001)檢測ndrg2的表達。為了特異性識別pLL中的神經(jīng)鞘，eya1 mRNA探針按照上述方法制備，并設(shè)計了引物(表S1)。

Morpholino顯微注射及mRNA合成

為了抑制ndrg2的表達，我們從Gene Tools, Inc.設(shè)計并獲得了ndrg2特異性剪接阻斷morpholinos，其精確序列為(5 ' -ATC ATC TGA GAC TTA CTG TCC ATT C-3 ')。將morpholino粉末溶解并稀釋于無rnase的水中，得到終濃度為0.3 mM的工作液，用于后續(xù)操作。將約2 nL的morpholino工作液微量注射到單細胞期的斑馬魚胚胎中。為了檢驗morpholino的效率，收集注射了morpholino的胚胎提取RNA，然后進行反向轉(zhuǎn)錄cDNA。設(shè)計的引物位于外顯子1和外顯子8上(表S1)，用于擴增位于外顯子4和內(nèi)含子4連接處的含有錯誤剪接靶點的片段。在拯救實驗中，首先通過體外轉(zhuǎn)錄合成外源ndrg2 mRNA。簡單地說，設(shè)計的引物ndrg2- mrna - bamhi - f和ndrg2- mrna - xbai - r(表S1)用于擴增包含整個ndrg2編碼序列的約1400 bp DNA。然后，利用SP6 mMESSAGE mMACHINE試劑盒(Invitrogen， #AM1340, Waltham, MA, USA)將插入擴增片段的pCS2+載體線性化，作為ndrg2 mRNA轉(zhuǎn)錄的模板。使用RNeasy Mini Kit (Qiagen， #74104, Hilden, Germany)純化后，將濃度為50 ng/μL的ndrg2 mRNA與morpholino或sgRNA共注射到單細胞期胚胎中進行拯救實驗。

CRISPR/ cas9介導的突變

通過CRISPR/ cas9介導的基因編輯技術(shù)生成ndrg2突變體斑馬魚。首先合成了靶向ndrg2外顯子2的單導RNA (sgRNA)。用含有ndrg2基因靶向位點(5 ' -GCA GGA GAT CGC CAT CAC GG-3 ')的正向引物和通用反向引物克隆sgDNA(表S1)。然后，以sgDNA為模板，利用MAXIscriptTM T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen， #AM1314)進行體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA。同時，利用線性化pXT7-Cas9質(zhì)粒和mMESSAGE mMACHINETM T7 Kit (Invitrogen， #AM1344)體外合成Cas9 mRNA。隨后，將300 ng/μL Cas9 mRNA和100 ng/μL ndrg2 sgRNA的混合物約2 nL微量注射到單細胞期斑馬魚胚胎中。利用設(shè)計的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2上的測序引物(表S1)，通過PCR檢測G0胚胎的ndrg2基因突變，并對擴增的含有靶向位點的片段進行測序。

FM4-64染色、抑制劑處理和細胞凋亡實驗

為了識別神經(jīng)鞘中的功能性HCs，我們進行了FM4-64染色實驗。將自由游動的幼蟲置于3 μM FM4-64活性染料(ex/em = 558/734 nm, Molecular Probe， #T13320, Eugene, OR, USA)中，室溫下避光孵育45 s。然后，去除染料溶液，用胚胎培養(yǎng)基輕輕沖洗后，直接成像。抑制Notch信號,ndrg2-mutant幼蟲在48個高通濾波器處理50μMγ分泌酶抑制劑LY411575 (# S2714 Selleckchem,休斯頓,德克薩斯州,美國)24 h為后續(xù)成像。細胞凋亡實驗檢測caspase-3活化信號。簡單地說，72 hpf的幼蟲在4℃4% PFA中固定過夜，然后在RT時用1% Triton X-100滲透0.5小時，然后在37℃用10%驢血清封閉1小時。隨后,幼蟲孵化了主要的雞多克隆抗體anti-GFP(1:50 0稀釋、Abcam # ab13970,新加坡)和一只兔子單克隆anti-cleaved caspase-3(1:50 0稀釋,春秋國旅,# 9664,新加坡)一夜之間在4°C,它是通過二次抗體檢測的Alexa FluorTM 488山羊anti-chicken lgG (H + L)(1:1000稀釋,表達載體,# - 11039)和一個Alexa FluorTM 555驢anti-rabbit lgG (H + L)(1:1000稀釋,表達載體,# - 31572),分別。最后,赫斯特33342年(10μg / mL,表達載體,# 62249)染料用于染色細胞的細胞核。

支持細胞增殖實驗

為了表征支持細胞的增殖，BrdU染色和免疫熒光實驗如下。將72 hpf的幼蟲置于10 mM BrdU溶液(Sigma-Aldrich， #B5002-5G, Saint Louis, MO, USA)中，在28.5℃下放置24小時。將96 hpf的幼蟲在4℃4% PFA中固定過夜，rt時用1% Triton X-100滲透0.5 h，然后在37℃2n HCl中浸泡0.5 h，然后在37℃用10%驢血清封閉1 h。用雞抗gfp多克隆抗體(1:500稀釋度，Abcam， #ab13970)、兔抗sox2多克隆抗體(1:500稀釋度，Abcam， #ab97959)和鼠抗brdu單克隆抗體(1:500稀釋度，Santa Cruz Biotechnology， #sc-32323, Dallas, TX, USA)分別標記HCs、支持細胞和增殖細胞。最后，分別用Alexa FluorTM 488羊抗雞igg (H + L)(1:1000稀釋度，Invitrogen， # a -11039)、Alexa FluorTM 555驢抗兔igg (H + L)(1:1000稀釋度，Invitrogen， # a -31572)和Alexa FluorTM 647驢抗小鼠igg (H + L)(1:1000稀釋度，Invitrogen， # a -31571)二抗進行一抗檢測。

前庭眼反射(VOR)測定

從南方科技大學獲得定制的VOR測試系統(tǒng)，用于量化斑馬魚幼蟲頭部運動與地球水平軸的線性VOR。線性VOR測試的詳細程序如下。將斑馬魚幼蟲以背朝上的姿勢輕輕裝入幼蟲形的腔室中，尾部用5%甲基纖維素粘著，并在腔室上覆蓋一塊玻璃蓋片。在頭部區(qū)域添加E3胚培養(yǎng)基后，將室單元安裝在定量線性VOR的設(shè)備上。將幼蟲眼睛對準紅外攝像機中心后，平臺開始繞水平軸以30轉(zhuǎn)/分的速度來回旋轉(zhuǎn)，攝像機記錄VOR。

驚嚇反應實驗

斑馬魚的運動行為通過驚嚇反應實驗進行測試，具體操作如下:在受精后5天，用塑料板連接微型振動器放置20只正常幼蟲，并用紅外數(shù)字視頻跟蹤系統(tǒng)監(jiān)測其游泳行為。180 Hz的兩種不同聲級(6或9 dB re.1 ms?2)的音調(diào)爆發(fā)應用于放大器以驅(qū)動振動器。設(shè)置并施加持續(xù)時間為30 ms、間隔時間為180 s的聲振動刺激。每個聲音振動刺激水平重復20次，記錄c型運動幼蟲在該刺激下的運動行為。最后，通過分析平均距離和峰值速度的運動典型參數(shù)來評價聲振刺激下幼蟲的驚嚇反應。

圖像采集與統(tǒng)計分析

WISH實驗的結(jié)果用立體顯微鏡(Olympus, MVX10, Tokyo, Japan)拍攝，其他實驗的表型讀數(shù)用共聚焦顯微鏡(Nikon, A1-DUT, Tokyo, Japan)掃描。成像時，用三卡因MS-222 (Sigma， #A5040)麻醉幼蟲，并在0.6%低熔點瓊脂糖中放置側(cè)位。使用Imaris X64軟件(9.0.1版本)重建三維圖像并調(diào)整對比度。為了區(qū)分Alexa FluorTM 555和Alexa FluorTM 647, Alexa FluorTM 647被涂成偽藍色，而前者被涂成紅色。GraphPad Prism(版本8.0.2)支持整個統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)重復三次以上，并以均數(shù)±均數(shù)標準誤差(SEM)表示。兩組比較采用未配對雙尾學生t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。p值小于0.05 (p < 0.05)為差異有統(tǒng)計學意義。P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001、P < 0.0001分別用“*”、“**”、“***”、“****”表示，“ns”表示無統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

據(jù)報道，ndrg家族的成員廣泛存在于多個物種的后生動物中。斑馬魚ndrg2基因(基因ID: 494050;Zgc: 101847)包含16個外顯子，編碼368個氨基酸。為了更詳細地描述ndrg2基因的進化特征，我們分析了斑馬魚ndrg2基因及其在人類和其他哺乳動物中的同源基因的氨基酸序列，并采用Neighbor-Joining (NJ)方法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。比對結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，ndrg2基因在哺乳動物低等脊椎動物中高度保守，在不同物種中序列同源性較高(圖1A,B)。

為了確定ndrg2的時空表達模式，我們使用地高辛標記的ndrg2 mRNA反義探針，通過全載原位雜交(WISH)技術(shù)追蹤了斑馬魚的發(fā)育過程。在24hpf時，ndrg2基因在耳小泡中顯著表達(圖1C，紅色虛線框)，側(cè)視圖和背視圖均描繪了放大的細節(jié)(圖1(C′，C”))。在48和72 hpf時，不僅在耳小泡(圖1D,E，紅色虛線框)中檢測到ndrg2 mRNA的陽性信號，而且在后側(cè)線(pLL)的神經(jīng)鞘(圖1D,E，紅色箭頭)中也檢測到ndrg2 mRNA的陽性信號。放大后的圖顯示，ndrg2的高表達僅限于嵴、黃斑和神經(jīng)鞘的HCs區(qū)域(圖1(D′，D”，E′，E”))。此外，在胚胎發(fā)育過程中，還檢測了ndrg2在肌組、前腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有一定程度的表達(圖1C-E)。在前期工作中進一步分析HCs單細胞RNA測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ndrg2基因在嵴HC、黃斑HC和神經(jīng)鞘HC簇以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)元中高度富集，這與WISH的結(jié)果一致(圖S1)。ndrg2在斑馬魚耳小泡和聽覺神經(jīng)鞘中的高表達表明，ndrg2可能參與了斑馬魚聽覺器官的發(fā)育。

圖1 ndrg2基因在多種物種中都是保守的，在后外側(cè)線(pLL)的早期發(fā)育性耳囊泡和神經(jīng)鞘中高表達。(A)斑馬魚ndrg2(用紅星標記)、人類ndrg2和幾種哺乳動物同源基因的氨基酸序列比對。(B)利用Neighbor-Joining法和MEGA 6.0軟件建立了包含斑馬魚ndrg2(標記為紅星)和人類ndrg2及其在其他物種中的同源物的系統(tǒng)進化樹。(C-E)在斑馬魚胚胎24、48和72 hpf的側(cè)位片上，通過整胚原位雜交(WISH)檢測ndrg2 mRNA的表達譜。在早期胚胎發(fā)育過程中，ndrg2 mRNA的陽性信號主要集中在耳囊泡(用紅色虛線框標記)和pLL中的神經(jīng)鞘(用紅色箭頭標記)。斑馬魚內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的示意圖見(D)。UO，橢圓囊耳石;SO，囊狀耳石;UM，橢圓囊黃斑;SM，囊狀黃斑;AC，前嵴;LC，側(cè)嵴;PC，后嵴。(C '，D '，E ')分別在24、48和72 hpf時，斑馬魚側(cè)視耳囊泡陽性信號的放大圖像。(C”)斑馬魚24 hpf時耳囊泡的背側(cè)視圖。(D”，E”)斑馬魚側(cè)位分別在48和72 hpf時pLL神經(jīng)鞘陽性信號的放大圖像(用紅色箭頭標記)。

敲低ndrg2基因可誘導壺腹嵴和pLL系統(tǒng)HC缺陷

為了探索ndrg2在斑馬魚聽覺器官發(fā)育中的作用，我們以轉(zhuǎn)基因系Tg(Brn3c:mGFP)為基礎(chǔ)，通過顯微注射ndrg2特異性剪接阻斷morpholino，建立了ndrg2突變體。通過PCR檢測了morpholino顯微注射的效率，多個電泳條帶的結(jié)果表明，在目標位點成功地發(fā)生了有效的錯接(圖S2)。考慮到ndrg2的限制性表達主要在耳小泡的HC結(jié)構(gòu)域和pLL的神經(jīng)鞘中，我們首先觀察并記錄了耳小泡中三個典型的嵴HC簇(圖2A)。熒光圖像顯示，在72 hpf下，ndrg2突變體的前部、外側(cè)和后部的嵴HCs明顯減少，肌纖毛縮短(圖2D)。在96 hpf的ndrg2突變體中檢測到類似的表型(圖S3A)，這表明嵴HCs的缺陷是由于ndrg2的特異性敲低而不是發(fā)育延遲。同時，統(tǒng)計結(jié)果顯示，在72和96 hpf下，ndrg2突變體的嵴HCs數(shù)量和肌纖毛平均長度均顯著降低，而立纖毛平均長度無顯著差異，這在觀察到的表型中也得到了很好的支持(圖2F-H和圖S3D-F)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在ndrg2敲除過程中，橢圓囊和囊狀耳石以及耳泡內(nèi)的橢圓囊黃斑HCs均未發(fā)生可檢測到的形態(tài)學變化(圖S4)。

為了研究ndrg2對pLL系統(tǒng)的影響，我們選擇eya1 mRNA探針和GFP分別特異性識別神經(jīng)瘤和HC簇。與正常幼蟲相比，不同發(fā)育階段的ndrg2突變體在pLL中顯示出較少的神經(jīng)鞘和HC簇(圖2B,C和圖S3B)。我們還顯示了pLL中神經(jīng)鞘和HC簇數(shù)量的一致統(tǒng)計結(jié)果(圖2I,J和圖S3G)。為了進一步描述ndrg2對神經(jīng)鞘中HCs的影響，我們用FM4-64活性染料標記功能性HCs, FM4-64活性染料可以通過功能性機械轉(zhuǎn)導通道快速進入成熟HCs。表性圖像和統(tǒng)計結(jié)果表明，在不同階段，在ndrg2形態(tài)中，pLL中單個神經(jīng)鞘中的HCs和功能性HCs的數(shù)量均減少(圖2E,I和圖S3C,H)。此外，外源性ndrg2 mRNA的顯微注射可以部分修復ndrg2突變體中出現(xiàn)的缺陷表型(圖2和圖S3)。總之，敲低ndrg2基因可以特異性地誘導耳囊泡和pLL系統(tǒng)的HC形態(tài)發(fā)生異常，包括嵴HCs減少、肌纖毛縮短、神經(jīng)肥大和功能性HCs減少。

圖2 敲低ndrg2基因?qū)е箩彰毎?HCs)顯著減少，肌纖毛縮短，神經(jīng)肥大減少以及功能性HCs減少。(A) 72 hpf時斑馬魚主要聽覺器官結(jié)構(gòu)示意圖，包括耳囊和后側(cè)線(pLL)系統(tǒng)。詳細描述了耳小泡和嵴HCs簇的結(jié)構(gòu)，典型的3個嵴HCs簇包括前嵴毛細胞(ACHC)、側(cè)嵴毛細胞(LCHC)和后嵴毛細胞(PCHC)。本研究分析的pLL神經(jīng)鞘用紅色虛線框標記。(B)對照、ndrg2突變體和ndrg2 mRNA獲救組在72 hpf時pLL中HC簇(用紅色箭頭標記)的代表性熒光圖像。比例尺:500μm。(C)在72 hpf時，通過全載原位雜交(WISH)檢測對照、ndrg2突變體和ndrg2 mRNA獲救組的幼蟲中eya1 mRNA表達的側(cè)面圖。pLL神經(jīng)鞘的陽性信號用紅色箭頭表示。(D)對照組、ndrg2突變體組和ndrg2 mRNA獲救組在72 hpf下三簇嵴細胞的代表性熒光圖像。相應組的LCHC(白色虛線框)細節(jié)放大。比例尺:20μm。(E)對照組、ndrg2突變體組和ndrg2 mRNA獲救組在72 hpf時pLL單個神經(jīng)肥大細胞中HC簇(綠色)和功能性HC簇(紅色)的代表性放大顯微圖。比例尺:10μm。(F - h)對照組、ndrg2突變體組和ndrg2 mRNA獲救組嵴HCs數(shù)、72 hpf時肌纖毛和立纖毛平均長度的統(tǒng)計分析((F,G) n = 16;(H)， n = 10)。(I)統(tǒng)計分析對照組、ndrg2 突變體組和ndrg2 mRNA獲救組在72 hpf時每個神經(jīng)肥大細胞的HCs數(shù)量和功能性HCs數(shù)量(n = 48)。(J,K)對照組、ndrg2突變體組和ndrg2 mRNA獲救組pLL HC簇數(shù)和神經(jīng)鞘數(shù)的統(tǒng)計分析((I)， n = 16;(J)， n = 13)。以上柱狀符號*和****分別代表p < 0.05和p < 0.0001。ns，無統(tǒng)計學意義。

眾所周知，HCs是聽覺器官中至關(guān)重要的機械感受器，可以將外界振動刺激轉(zhuǎn)化為電生理信號，以感知聲音和平衡。HCs的喪失通常會導致聽力損失和前庭功能障礙。敲低ndrg2導致HCs表型缺陷;這種基因敲除是否會影響斑馬魚的聽覺和平衡功能還有待驗證。在這里，進行了定制的前庭-眼反射(VOR)測試，以檢查斑馬魚幼蟲在5 dpf時的線性VOR，由頭部運動到地球水平軸引起(圖S5A)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，ndrg2缺乏的幼蟲眼動幅度無顯著差異(圖S5B)，說明ndrg2敲低不能引起5 dpf時線性VOR的變化。

然后通過驚嚇反應實驗進一步探討ndrg2在斑馬魚聽力中的功能作用。采用兩次180 Hz的聲誘發(fā)刺激，計算并分析每次刺激后出現(xiàn)c形運動的幼蟲(圖3A,B)。結(jié)果表明，幼蟲的反應行為與刺激的大小有關(guān)，而在5 dpf時，與野生型幼蟲相比，ndrg2型幼蟲對聲振動刺激的反應更為不敏感，這體現(xiàn)在平均距離和運動峰值速度的減少上(圖3C,D)。此外，體外注射ndrg2 mRNA在一定程度上可以彌補由于缺乏ndrg2而導致的幼蟲對聲振動刺激反應緩慢的行為(圖3C,D)。這表明ndrg2基因的敲低可能會損害斑馬魚幼體聽覺器官的功能。

圖3 ndrg2基因的敲低導致斑馬魚在5 dpf時對聲音刺激的反應行為減弱。(A)驚嚇反應試驗和聲音振動刺激模式中使用的裝置示意圖。(B)分別提取了對照組、ndrg2 突變體組和ndrg2 mRNA獲救組在9 dB re.1 ms?2聲級180 Hz一次性刺激下幼蟲的c形運動軌跡。(C,D) 5 dpf時對照、ndrg2和ndrg2 mRNA獲救幼蟲在兩種刺激水平下的平均運動距離和峰值運動速度的統(tǒng)計分析(n = 20)。以上柱狀符號*、**、***、****分別代表p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001、p < 0.0001。ns，無統(tǒng)計學意義。

敲除ndrg2基因?qū)е翲C發(fā)育障礙和對聲音振動刺激的感覺功能障礙

為了進一步證明ndrg2的發(fā)育和功能作用，首先，利用CRISPR/Cas9基因組編輯策略，基于Tg(Brn3c:mGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚產(chǎn)生ndrg2敲除突變體。設(shè)計了一種靶向ndrg2基因外顯子2的sgRNA，并將其與Cas9 mRNA共注射到單細胞期胚胎中，用于CRISPR/Cas9介導的ndrg2編輯(圖4A)。ndrg2基因敲除的有效性是通過對含有目標位點的約410 bp基因組DNA片段進行測序來確定的。結(jié)果顯示，與野生型幼蟲相比，ndrg2突變體的靶位點后面出現(xiàn)了多峰曲線，表明靶向外顯子2的突變成功發(fā)生(圖4B)。

圖4 在靶位點成功生成了CRISPR/ cas9介導的ndrg2突變。(A)斑馬魚ndrg2基因組結(jié)構(gòu)示意圖和CRISPR/Cas9系統(tǒng)中ndrg2特異性外顯子2的sgRNA。(B)與野生型斑馬魚相比，ndrg2突變體的靶位點發(fā)生了多個突變。

為了確定ndrg2基因敲除對HCs形態(tài)發(fā)生的影響，我們監(jiān)測和分析了壺腹嵴和pLL神經(jīng)鞘中HCs的發(fā)育過程。結(jié)果顯示，與ndrg2突變體的表型相似，ndrg2突變體在72 hpf時，三個典型的嵴HCs簇減少，并伴有肌纖毛縮短和立纖毛不變(圖5A)。同時，在ndrg2敲除過程中，在72 hpf時的幼蟲中，觀察到pLL中的HC簇明顯減少(圖5B)。pLL中單個神經(jīng)肥大的放大圖表明，與正常幼蟲相比，72 hpf時缺乏ndrg2的幼蟲表現(xiàn)出更少的HCs和功能性HCs(圖5C)。統(tǒng)計結(jié)果也與上述表型相符(圖5e - 1)。在96 hpf下，ndrg2突變體壺腹嵴和pLL系統(tǒng)的HCs也發(fā)生了類似的變化(圖S6)。此外，驚嚇反應實驗表明，ndrg2突變體對外部聲音振動刺激的反應脫敏，平均運動距離和峰值運動速度下降(圖5D,J,K)。此外，通過顯微注射ndrg2 mRNA可以部分恢復ndrg2突變體中出現(xiàn)的HCs的形態(tài)和功能缺陷(圖5和圖S6)。上述結(jié)果表明，ndrg2基因?qū)Π唏R魚HC的形態(tài)發(fā)生和聽覺器官的功能有深刻的影響。

圖5 敲除ndrg2基因破壞了斑馬魚毛細胞(HC)的形態(tài)發(fā)生，導致對聲音振動刺激的感覺能力缺陷。(A)正常、ndrg2突變體和ndrg2 mRNA分別在72 hpf下獲救的幼蟲中典型的三簇嵴HCs的代表性熒光圖。側(cè)嵴毛細胞(LCHC)細節(jié)(白色虛線框標記)在相應的幼蟲中被放大。比例尺:20μm。(B)對照、ndrg2突變體和ndrg2 mRNA獲救組在72 hpf下后側(cè)線(pLL) HC簇(用紅色箭頭標記)的相襯和熒光圖像。比例尺:500μm。(C)分別從正常、ndrg2突變體和ndrg2 mRNA獲救的72 hpf的幼蟲中獲得的pLL中代表性神經(jīng)肥大的重疊熒光圖像。綠色和紅色信號分別代表hcc和功能性hcc。比例尺:10μm。(D)在5 dpf時，對照、ndrg2突變體和ndrg2 mRNA獲救的幼蟲分別在9 dB re.1 ms?2和180 Hz音調(diào)爆發(fā)的聲音刺激下的一次驚嚇反應行為中提取的游動軌跡。(E-I)對照組、ndrg2突變體組和ndrg2 mRNA獲救組在72 hpf時耳泡壺腹嵴和pLL神經(jīng)鞘中出現(xiàn)的HCs形態(tài)學表型統(tǒng)計分析((E-H)， n = 10;(I)， n = 30)。(J,K)對照組、ndrg2突變體組和ndrg2 mRNA獲救組在兩種水平刺激下的平均運動距離和峰值運動速度的統(tǒng)計分析(n = 20)。以上柱狀符號*、**、***、****分別代表p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001、p < 0.0001。ns，無統(tǒng)計學意義)。

ndrg2基因缺失影響Notch信號通路中的HC分化

為了進一步闡明ndrg2缺乏導致HC丟失的細胞生物學機制，我們利用一種抗cleaved caspase-3的抗體和凋亡標記物檢測了ndrg2突變體的細胞凋亡信號。熒光圖像顯示，在正常幼蟲和ndrg2突變體中，沒有檢測到裂解的caspase-3與HCs共定位的信號，這表明細胞凋亡不是HC丟失的原因(圖6A)。眾所周知，HCs天生不能通過有絲分裂和支持細胞的直接轉(zhuǎn)分化來自主增殖和再生。ndrg2基因的缺失是否會破壞作為HCs重要來源的支持細胞的發(fā)育仍有待闡明。本實驗采用抗sox2抗體標記支撐細胞，并進行BrdU細胞增殖實驗。同時具有SOX2陽性和BrdU陽性信號的細胞代表增殖支持細胞。免疫熒光和統(tǒng)計學結(jié)果顯示，敲除ndrg2過程中支持細胞數(shù)量和增殖支持細胞數(shù)量無顯著差異(圖6B、E、F)。說明ndrg2的缺失不影響支持細胞的增殖和發(fā)育。因此，我們推測ndrg2突變體中出現(xiàn)的HC缺失表型是由于HC分化缺陷所致。人們普遍認為Notch介導的側(cè)抑制調(diào)節(jié)HC與支持細胞的分化，而Notch信號的抑制促進HCs與支持細胞的分化。為了驗證ndrg2基因是否通過Notch信號通路影響HC分化，我們使用Notch γ分泌酶抑制劑LY411575來治療ndrg2突變體。代表性圖表和統(tǒng)計結(jié)果顯示，通過阻斷Notch信號通路，ndrg2突變體pLL中單個神經(jīng)肥大中減少的HCs和功能性HCs可以明顯恢復(圖6C,D)。結(jié)果表明，ndrg2缺乏與Notch信號通路介導的HC分化密切相關(guān)。

圖6 在Tg(Brn3c:mGFP)斑馬魚中，ndrg2基因的缺失通過Notch信號通路影響毛細胞(HCs)的分化，但不改變HCs的凋亡和支持細胞。(A) 72 hpf下正常和ndrg2突變體幼蟲HC凋亡檢測結(jié)果。免疫熒光圖像顯示在后側(cè)線(pLL)的單個HC簇中識別核(藍色)，HC(綠色)和裂解的caspase-3信號(紅色)。比例尺:10μm。(B)正常和ndrg2突變體幼蟲支持細胞增殖實驗結(jié)果。在96 hpf下顯示免疫熒光顯微圖，以鑒定單個pLL神經(jīng)肥大中的HC(綠色)、支持細胞(紅色)和增殖細胞(藍色)。用于檢測BrdU的Alexa FluorTM 647被涂成偽假藍色，以區(qū)別于Alexa FluorTM 555標記SOX2的紅色。重疊熒光圖像的最后一列紫紅色信號代表增殖的支持細胞。比例尺:10μm。(C)對照組、ndrg2突變體組和Notch抑制劑LY411575組在72 hpf時pLL單個神經(jīng)肥大HC簇(綠色)和功能性HC簇(紅色)的代表性圖像。比例尺:10μm。(D)對照組、ndrg2突變體組和Notch抑制劑LY411575組在72 hpf時每個神經(jīng)肥大細胞的HCs數(shù)量和功能性HCs數(shù)量的統(tǒng)計分析(n = 30)。(E,F)正常和ndrg2突變體幼蟲在96 hpf下每個神經(jīng)肥大的支持細胞和增殖支持細胞數(shù)量的統(tǒng)計分析(n = 30)。以上柱狀符號****表示p < 0.0001。ns，無統(tǒng)計學意義。

討論

N-myc下游調(diào)節(jié)基因(NDRG)家族由四個成員組成，分別是NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4。NDRG蛋白具有保守的NDR結(jié)構(gòu)域，包括α/β (α/β)水解酶基序，但不具有酶活性，并且具有57-65%相同的氨基酸序列。NDRGs保守地存在于多個物種的后生動物中。這在NJ方法構(gòu)建的NDRG2系統(tǒng)發(fā)育樹中得到了很好的驗證，斑馬魚的NDRG2基因與人類NDRG2的相似性超過80%(圖1A,B)。NDRG2的功能已被廣泛討論，越來越多的研究表明它在多種細胞生物學過程中發(fā)揮重要作用。NDRG2被認為是正常細胞在缺氧、誘導細胞死亡、抑制細胞增殖和蛋白質(zhì)合成等較低代謝過程等細胞應激刺激下激活的應激反應基因。作為腫瘤抑制因子，NDRG2在不同腫瘤的抗增殖、促凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2作為腦星形膠質(zhì)細胞的標記蛋白與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。近年來，不同的研究報道NDRG2在許多類型的細胞和組織中是一個與分化相關(guān)的基因。研究人員指出，NDRG2調(diào)節(jié)樹突狀細胞從單核細胞分化和細胞因子的產(chǎn)生，如IL-10。NDRG2促進GATA-1的表達，誘導巨核細胞向紅細胞分化。此外，NDRG2能夠促進bmp2誘導的成骨細胞分化和抑制破骨細胞分化，并在分化體中控制椎體規(guī)格。與未分化的成肌細胞相比，NDRG2在分化的肌管中的表達更高，這也表明了它在成肌細胞生長和分化中的作用。此外，NDRG2不僅能促進結(jié)直腸癌的分化，還能在腫瘤微環(huán)境中減少巨噬細胞向腫瘤相關(guān)巨噬細胞的分化。

斑馬魚ndrg家族由6個平行成員組成，包含ndrg1a、1b、2、3a、3b和4，表達于斑馬魚胚胎的代謝需要器官，如腦、腎和心臟。研究表明，ndrg2基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期主要局限于耳囊、腦、視網(wǎng)膜和體體中表達。我們的WISH結(jié)果也觀察到類似的ndrg2表達模式(圖1C-E)。然而，區(qū)別在于，在48 hpf和72 hpf時，斑馬魚胚胎pLL的神經(jīng)鞘中檢測到了ndrg2的陽性信號(圖1D,E)。這一發(fā)現(xiàn)在我們之前的工作中被HCs單細胞序列的結(jié)果所證實，該結(jié)果表明ndrg2在簇0和簇7的神經(jīng)鞘HCs中高度富集(圖S1)。為深入了解ndrg2潛在的組織特異性功能提供了更好的整體和系統(tǒng)表達譜。目前，ndrg2在神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜、體細胞等特異表達組織中的功能已被廣泛研究。不幸的是，ndrg2在聽覺器官中的作用仍然知之甚少?？紤]到ndrg2基因在斑馬魚耳小泡和神經(jīng)鞘中特異高表達，我們推測ndrg2基因可能參與了斑馬魚HCs的發(fā)育。為了驗證這一假設(shè)，首先，我們成功構(gòu)建了ndrg2突變體(圖4和圖S2)。壺腹嵴和pLL系統(tǒng)均出現(xiàn)了HCs的缺陷表型，包括嵴HCs減少、肌纖毛縮短、神經(jīng)鞘減少以及功能性HCs，這些缺陷可通過ndrg2 mRNA拯救實驗部分恢復(圖2、圖5和圖S3、圖S6)。然而，并不是所有的HCs在斑馬魚體內(nèi)都會出現(xiàn)形態(tài)上的異常。例如，在沒有ndrg2的情況下，橢圓囊斑HCs和耳石沒有可檢測到的形態(tài)學差異(圖S4)。

我們知道，HCs是一種重要的機械感受器，負責感知聲音、保持平衡和重力，它的喪失可能導致斑馬魚的聽覺和前庭功能障礙。因此，我們在5 dpf時對斑馬魚幼體進行常規(guī)行為測試VOR和驚嚇反應，分別評估ndrg2對前庭和聽覺功能的影響(圖3、圖5和圖S5)。據(jù)報道，線性和角加速度都可以誘發(fā)VOR。斑馬魚感知線性加速度和重力的耳石器官在5 dpf后成熟，而感知旋轉(zhuǎn)角加速度的半規(guī)管在35 dpf后成熟。本研究的VOR測試系統(tǒng)由南方科技大學提供，旨在檢測重力與耳石器官交角變化引起的斑馬魚幼蟲線性VOR。本研究的線性VOR檢測主要反映與耳石器官相關(guān)的前庭功能。在ndrg2突變體中，線性VOR沒有檢測到變化，這與觀察到的耳石和橢圓囊斑HCs的正常表型一致(圖S4和S5)。盡管垂直插入半規(guī)管壺腹的嵴HCs在ndrg2突變體中表現(xiàn)出缺陷表型(圖2和圖S3)，但在5 dpf時的幼蟲線性VOR試驗中，它們的前庭相關(guān)功能無法體現(xiàn)和檢測。驚跳反應是一種與HCs的聽覺功能密切相關(guān)的行為，包含了魚體在受到聲刺激后10 ms內(nèi)彎曲成典型的“C”形，然后是一個小的反向曲線和快速游動的典型過程。驚嚇反應可由5 dpf及整個成年期具有相似強度閾值和頻率范圍的聲音刺激觸發(fā)，這為聽力變化提供了可靠的評估。斑馬魚的側(cè)線可以感知到200赫茲的水流和低頻波，而內(nèi)耳可以探測到100赫茲以上的振動。在本研究中，應用了180 Hz的兩種不同聲級(6或9 dB re.1 ms?2)的音調(diào)爆發(fā)。在ndrg2突變體和突變體中觀察到的驚嚇反應行為減弱(圖3和圖5)，反映了內(nèi)耳和側(cè)線對聲音振動刺激的協(xié)同結(jié)果。這可能與pLL中嵴間質(zhì)細胞減少和神經(jīng)鞘間質(zhì)細胞減少有關(guān)(圖2、圖5、圖S3和圖S6)。然而，由于成像技術(shù)上的困難，本研究沒有對內(nèi)耳另一個重要的聽覺組成部分囊狀黃斑進行研究，這可能是無法充分認識HCs形態(tài)變化與功能變化之間關(guān)系的障礙?？偟膩碚f，驚嚇反應實驗的結(jié)果表明，ndrg2基因調(diào)節(jié)了斑馬魚的聽覺感覺功能。一份出版物報道，當暴露在模擬重力環(huán)境中時，斑馬魚的ndrg2上調(diào)，這意味著ndrg2與感覺行為相關(guān)。

HCs的發(fā)育是一個極其復雜、高度協(xié)調(diào)的過程，受一系列關(guān)鍵因子的調(diào)控，涉及多條信號通路，如Notch/Wnt/Atoh1、MAPK、PI3K/Akt、鈣通道和氧化應激/ROS等。經(jīng)典且保守的Notch信號通路在肝細胞的發(fā)育和再生中發(fā)揮重要作用。研究表明，Notch介導的側(cè)向抑制決定了感覺上皮細胞的命運，并通過激活Notch信號抑制相鄰的感覺上皮細胞向同一類型細胞分化，進而向另一種類型細胞分化，即支持細胞分化，從而調(diào)節(jié)感覺上皮細胞和支持細胞的分化。已知HCs是通過有絲分裂或支持細胞直接轉(zhuǎn)分化而再生的。研究人員發(fā)現(xiàn)，γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號時，支持細胞可被誘導轉(zhuǎn)分化為HCs。在這里，敲除ndrg2基因?qū)е翲Cs缺失，但未檢測到cleaved caspase-3的細胞凋亡信號(圖6A)，這表明HC的凋亡并不是導致其下降的原因。同時，支持細胞作為HCs的重要來源，其有絲分裂不受ndrg2缺失的影響，反映了增殖的支持細胞數(shù)量和形態(tài)的不顯著變化(圖6B,E,F)。此外，用γ-分泌酶抑制劑LY411575阻斷Notch信號通路有助于恢復ndrg2突變體中丟失的HCs(圖6C,D)，表明ndrg2與Notch信號通路有關(guān)。一項研究發(fā)現(xiàn)，ndrg2與Notch信號通路相關(guān)，調(diào)控損傷后損傷邊界的皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生。一項新的研究報道，ndrg2通過Notch信號通路參與神經(jīng)肥大細胞受損HCs的再生?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們推測ndrg2可能是Notch信號通路上游負調(diào)控基因，影響HCs的分化。ndrg2可能是HC分化相關(guān)基因，其缺陷觸發(fā)Notch激活，抑制支持細胞向HCs分化，最終導致HCs丟失。

結(jié)論

在本研究中，我們通過WISH繪制了ndrg2的時空表達模式，并檢測了ndrg2在耳囊泡和pLL神經(jīng)鞘中的特異性表達。ndrg2突變體和ndrg2突變體的嵴毛細胞和神經(jīng)鞘的形態(tài)和功能缺陷，可以通過聯(lián)合注射外源性ndrg2 mRNA來挽救。同時，對缺乏ndrg2的幼體進行驚嚇試驗，對聲音振動刺激脫敏。此外，阻斷Notch信號通路可以挽救ndrg2突變體中未檢測到的HCs凋亡和支持細胞的改變，這表明ndrg2與Notch介導的HCs分化相關(guān)。綜上所述，本研究首次證實了ndrg2調(diào)控斑馬魚發(fā)育過程中參與Notch信號通路的HCs形態(tài)發(fā)生和聽覺感覺功能。斑馬魚作為一種常見的脊椎動物模式生物，在聽力損失研究中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，包括易于在體染色和成像、不需要復雜的解剖操作、易于基因操作、適合快速大規(guī)模表型篩查等。報道的ndrg2在聽覺器官發(fā)育中的功能作用為發(fā)現(xiàn)和識別潛在的耳聾基因提供了一條途徑。這項工作不僅加深了對ndrg2功能的理解，而且為HC發(fā)育的調(diào)控機制提供了新的見解。

原文地址：https://doi.org/10.3390/ijms241210002

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