雜志：Journal of Genetics and Genomics
影響因子：5.9（2022）
年份：2023
通訊作者：Dong Liu, Cheng Wang
通訊作者單位：Nantong Laboratory of Development and Diseases, School of Life Sciences, Co-innovation Center of Neuroregeneration, MOE Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong, Jiangsu 226019, China.
摘要
感覺毛細(xì)胞(HCs)損傷是感覺神經(jīng)性聽力損失的主要原因，但由于許多潛在的耳聾基因尚未確定，其病理機(jī)制尚未完全了解。Ftr82是魚類中主要的TRIMs家族成員，已被發(fā)現(xiàn)在耳小泡中特異性表達(dá)，但其功能尚不清楚。在這里，我們利用斑馬魚模型研究了ftr82在HC發(fā)育和聽力功能中的作用。原位雜交結(jié)果表明，ftr82在不同階段總是局限于耳小泡內(nèi)。在ftr82突變體和突變體中均觀察到HCs的缺陷，包括嵴HCs明顯減少，纖毛縮短，神經(jīng)鞘功能hcc明顯減少，通過外源ftr82 mRNA共注射可成功挽救。驚嚇反應(yīng)行為實(shí)驗(yàn)表明，缺乏ftr82基因的幼蟲對外部聲音刺激的敏感性較低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hcc的丟失主要是由caspase-3激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡引起的。我們的研究表明，ftr82是調(diào)控HC形態(tài)發(fā)生和聽覺功能表現(xiàn)的重要聽力相關(guān)基因，為快速鑒定耳聾基因提供了新的思路。
關(guān)鍵詞：ftr82，TRIM蛋白，毛細(xì)胞發(fā)育，聽力損失，斑馬魚
前言
感覺毛細(xì)胞(HC)損傷通常是引起感音神經(jīng)性聽力損失的原因，這一過程可由多種因素引起，包括遺傳改變、噪音、耳毒性藥物、衰老等。聽力損失正在成為一個(gè)全球性的健康問題，由耳聾基因突變引起的遺傳性聽力損失占80%。因此，尋找新的耳聾關(guān)鍵基因并闡明聽覺器官發(fā)育的調(diào)控機(jī)制是至關(guān)重要的。到目前為止，已經(jīng)確定了120多個(gè)耳聾基因(https://hereditaryhearingloss.org)，近年來還有許多其他基因被證明與聽力損失有關(guān)。探索耳聾基因的功能依賴于動物模型的構(gòu)建。已建立的模型生物，如小雞、斑馬魚、小鼠和大鼠，已被廣泛應(yīng)用于聽覺研究。哺乳動物通常被認(rèn)為優(yōu)于非哺乳脊椎動物，因?yàn)樗鼈兊亩伣Y(jié)構(gòu)和與人類的關(guān)系更密切。然而，它們的局限性也很明顯，包括復(fù)雜的耳蝸解剖分離、耗時(shí)表型讀數(shù)、高成本和低通量等。斑馬魚具有高繁殖力、透明度、易于可視化和基因操作等特點(diǎn)，使其成為快速耳聾基因鑒定和聽覺研究的經(jīng)濟(jì)和有吸引力的模式生物。
斑馬魚HCs是分布在檢測聲音和運(yùn)動的機(jī)械感覺器官，包括位于頭部和側(cè)線(LL)系統(tǒng)的耳泡。耳囊泡主要由三個(gè)正交排列的半規(guī)管、小囊和球囊組成。垂直插入壺腹的三個(gè)典型的HC簇，被稱為嵴HCs，它們可以將外部振動刺激轉(zhuǎn)化為由神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的電生理信號。此外，LL系統(tǒng)，另一個(gè)重要的感覺器官，由系列有規(guī)則排列的神經(jīng)瘤組成，其中HCs被支持細(xì)胞和套膜細(xì)胞包圍。神經(jīng)肥大系統(tǒng)是LL的基本功能單位，其特征是位于人工表面體，易于染色和成像。許多研究人員已經(jīng)致力于探索HC的發(fā)育和再生的分子機(jī)制。據(jù)報(bào)道，Wnt、Notch和Fgf信號通路，部分轉(zhuǎn)錄因子(Atoh1, Sox2, Math1, Gata3)，以及新發(fā)現(xiàn)的microRNA廣泛參與了這些過程。目前已鑒定出120多個(gè)非綜合征性聽力損失基因，但仍有許多耳聾基因有待發(fā)現(xiàn)。
三元基序(TRIM)蛋白，也稱為RBCC蛋白，由一個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或兩個(gè)b -盒和一個(gè)預(yù)測的線圈區(qū)域組成，該區(qū)域通常后面是高度可變的c端結(jié)構(gòu)域，如B30.2結(jié)構(gòu)域(PRY-SPRY)。作為E3泛素連接酶的一種，廣泛參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、抗病毒先天免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。ftr82屬于TRIM基因的一個(gè)大的新子集，稱為魚類新TRIM (finTRIM, ftr)，僅在硬骨魚中存在，與之最接近的哺乳動物親戚是TRIM16和TRIM25，但不是真正的同源基因。有限的研究表明，finTRIM基因主要與抗病毒感染的先天免疫有關(guān)。研究表明，ftr36可觸發(fā)IFN通路，介導(dǎo)病毒復(fù)制抑制。FTR83的過表達(dá)誘導(dǎo)IFN上調(diào)并抑制RNA病毒感染，如IHNV、VHSV和SVCV。對ftr82的有限研究表明，在斑馬魚中，過表達(dá)ftr82不會誘導(dǎo)IFN的上調(diào)，也不會表現(xiàn)出抗病毒活性。而在橙斑石斑魚中，ftr82負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)，增強(qiáng)SGIV和RGNNV的病毒顆粒復(fù)制。此外，一篇論文發(fā)現(xiàn)ftr82是一個(gè)血管基因，在斑馬魚的血管發(fā)育中起著重要作用。此外，ftr82在早期斑馬魚胚胎的卵泡中特異性表達(dá)(Kudoh et al.， 2001)。由此可見，ftr82基因的功能在很大程度上仍然未知，在聽覺研究中也沒有對TRIM蛋白的相關(guān)描述。
在這里，我們利用斑馬魚模型研究了ftr82在HC發(fā)育和聽力功能中的作用。采用全載原位雜交(WISH)技術(shù)詳細(xì)表征了ftr82的表達(dá)譜，并觀察了ftr82在耳小泡hc中的特異性表達(dá)。morpholino注射或CRISPR-Cas9的功能缺失實(shí)驗(yàn)均可誘導(dǎo)crisa hc和神經(jīng)鞘在形態(tài)和功能上的缺陷。ftr82基因敲低或敲除均會導(dǎo)致驚恐反應(yīng)缺陷。同時(shí)注射外源ftr82 mRNA可恢復(fù)相關(guān)表型變化。此外，在ftr82缺失中檢測到毛細(xì)胞凋亡信號，這在很大程度上解釋了HC丟失的表型。綜上所述，我們的研究揭示了ftr82在斑馬魚HC發(fā)育和聽覺功能中起重要作用。這項(xiàng)工作不僅有助于我們?nèi)媪私鈌tr82的基因功能，也為潛在耳聾基因的鑒定提供了新的見解。
結(jié)果
為了描述ftr82基因的進(jìn)化特征，我們分析了斑馬魚ftr82在幾種魚類中的同源關(guān)系，也分析了人中最相似的同源關(guān)系。對來自不同物種的ftr82氨基酸序列進(jìn)行了比對，并利用鄰域連接（NJ）方法構(gòu)建了ftr82的系統(tǒng)發(fā)育樹。NJ樹和比對結(jié)果顯示，ftr82基因在硬骨魚中具有高度同源性，與人類TRIM蛋白的同源性較低性（圖1A和1C）。進(jìn)一步分析表明，斑馬魚ftr82 包含典型的finTRIMs的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)RING/B-Box/卷曲線圈TRIM和一個(gè)特定的B30.2結(jié)構(gòu)域（圖1B和1C）。結(jié)果表明，ftr82基因在硬骨魚中具有進(jìn)化保守性，具有典型的TRIMs特征。為了探討ftr82基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的潛在作用，我們利用地高辛標(biāo)記的ftr82反義探針WISH對ftr82的空間表達(dá)譜進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示，ftr82在斑馬魚胚胎24hpf~96hpf的耳泡中高表達(dá)（圖1D-1I）。耳囊泡的放大圖顯示ftr82 mRNA定位于嵴HCs（圖1D‘-1I’）。此外，ftr82 mRNA在頭部間充質(zhì)、干血管、尾靜脈神經(jīng)叢（CVP）、心臟和腸道中也檢測到的mRNA（圖1D-1I）。ftr82在耳小泡發(fā)育過程中的特異性表達(dá)表明，ftr82可能在斑馬魚的聽覺器官發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖1 Ftr82基因在硬骨魚中保守，并在發(fā)育中的卵囊中特異性表達(dá)。(A)利用MEGA 6.0版軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，包括斑馬魚ftr82(用紅星標(biāo)記)及其在幾種魚類中的同源物，以及與人類最相似的同源物。(B) ftr82基因典型結(jié)構(gòu)域示意圖。(C)斑馬魚ftr82(用紅星標(biāo)記)與魚類和人類相似同源物的氨基酸序列比對。ftr82的保守結(jié)構(gòu)域包括RING(橙色)、B-Box(藍(lán)色)和coil - coil(綠色)。(D- I)斑馬魚胚胎在24、36、48、60、72和96 hpf時(shí)ftr82 mRNA的橫向表達(dá)譜。在胚胎發(fā)育過程中觀察到Ftr82 mRNA定位于耳小泡(用紅色橫線矩形標(biāo)記)。(D ' i ')放大后的耳囊內(nèi)陽性信號。
ftr82基因的敲除導(dǎo)致HCs降低、神經(jīng)瘤減少和纖毛縮短
為了研究ftr82在斑馬魚聽覺器官發(fā)育中的功能，我們通過向轉(zhuǎn)基因系Tg(Brn3c:mGFP)中注射剪接阻斷型morpholino來敲低ftr82基因。首先通過PCR驗(yàn)證了morpholino的有效性，結(jié)果表明，ftr82特異性的morpholino可以成功地在目標(biāo)位點(diǎn)引起有效的錯(cuò)誤剪接(圖S1)。隨后，記錄并分析了耳小泡中典型的三簇嵴HCs的發(fā)育情況(圖2)。圖像顯示，與72 hpf時(shí)正常幼蟲的三簇嵴HCs相比，微注射ftr82特異性morpholino的幼蟲的嵴HCs較少，纖毛較短(圖2B)。為了排除發(fā)育遲緩的因素，我們觀察了96 hpf時(shí)幼蟲的嵴HCs，表型一致(圖S2)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果還顯示，敲除ftr82基因后，嵴 HCs的數(shù)量和纖毛的長度均顯著減少(圖2C-2F)。
圖2 ftr82基因的敲低導(dǎo)致耳小泡中典型的三簇crissta hcc顯著減少和纖毛縮短。(A)含有典型三簇冠狀細(xì)胞的耳囊結(jié)構(gòu)示意圖。ACHC，前嵴毛細(xì)胞;LCHC，側(cè)嵴毛細(xì)胞;后嵴毛細(xì)胞。(B)分別在對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組獲得72 hpf時(shí)耳小泡內(nèi)典型三簇crissta hc的代表性熒光圖像。比例尺:20μm。(C, D)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf和96 hpf時(shí)不同crissta HC簇中HC數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析。(E, F)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA搶救組在72 hpf和96 hpf時(shí)crissta HC簇纖毛平均長度的統(tǒng)計(jì)分析。
眾所周知，側(cè)線（LL）系統(tǒng)是斑馬魚的另一個(gè)重要的感覺器官，可以感知流體流動和聲音振動。為了確定ftr82是否參與了LL的發(fā)展，我們在72 hpf和96 hpf下觀察和分析了后側(cè)線(pLL)的HC簇和神經(jīng)突(圖3A, 3B, 3D, 3E)。用GFP和eya1標(biāo)記基因分別識別HC簇和神經(jīng)突。圖像顯示，與對照幼蟲相比，ftr82變異體在不同階段的HC簇和神經(jīng)突都顯著減少(圖3A和3B)。這與pLL中HC簇?cái)?shù)和神經(jīng)突數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致(圖3D和3E)。為了更詳細(xì)地描述LL中hc的變化，我們對單個(gè)神經(jīng)突進(jìn)行放大和成像，并用FM4-64染料標(biāo)記功能性hc。有代表性的圖表顯示，ftr82基因的敲低導(dǎo)致單個(gè)神經(jīng)肥大細(xì)胞的hcc顯著減少，并伴有不同階段功能性hcc的減少(圖3C和S3)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致(圖3F和3G)。上述結(jié)果表明，ftr82的缺乏影響了耳小泡和耳小泡感覺器官的發(fā)育，表現(xiàn)為耳小泡神經(jīng)突的嵴HCs減少、纖毛縮短以及耳小泡神經(jīng)突的功能性HCs減少。
圖3 ftr82基因的敲低導(dǎo)致pLL中HC簇和神經(jīng)突的減少，以及pLL單個(gè)神經(jīng)突中HC和功能性HC的減少。(A)對照、ftr82突變體和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf和96 hpf時(shí)pLL中HC簇(用紅色箭頭標(biāo)記)的相對比和熒光顯微圖。比例尺:500μm。(B) 72 hpf時(shí)正常、ftr82變形體和獲救幼蟲中eya1 mRNA的表達(dá)譜。紅色箭頭指向pLL的神經(jīng)突。(C) 72 hpf時(shí)，對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA拯救組pLL單個(gè)神經(jīng)肥大HC簇(綠色)和功能HC簇(紅色)的代表性熒光顯微圖。比例尺:10μm。(D, E)對照組、ftr82突變體和ftr82 mRNA搶救組pLL中HC簇和神經(jīng)突數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析。(F, G)對照組、ftr82突變體和ftr82 mRNA拯救組在72 hpf和96 hpf時(shí)每個(gè)神經(jīng)肥大細(xì)胞的hc和功能性hc數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析。
ftr82基因的敲除會導(dǎo)致斑馬魚的聽力缺陷
眾所周知，斑馬魚的機(jī)械感覺HCs可以將外部振動轉(zhuǎn)換為由神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的電生理信號，以感知聲音和周圍環(huán)境中的流體流動。ftr82基因的敲低導(dǎo)致耳泡和pLL的HC降低，斑馬魚的聽力功能是否也受到影響尚不清楚。本文采用聲驚嚇反射行為實(shí)驗(yàn)來評價(jià)斑馬魚幼體對外界聲音刺激的反應(yīng)。施加不同大小的聲刺激，記錄并提取聲刺激下的運(yùn)動軌跡(圖4A和4B)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在不同聲刺激強(qiáng)度下，ftr82 morphants的平均運(yùn)動距離和運(yùn)動峰值速度均顯著降低(圖4C和4D)。結(jié)果表明，ftr82基因敲低會損害幼蟲的聽覺功能，這反映在幼蟲對外部聲音刺激的敏感性低于對照組。
圖4 ftr82基因的敲除會導(dǎo)致斑馬魚幼蟲的聽力功能障礙。(A)驚嚇響應(yīng)測試設(shè)備示意圖。(B)對照、ftr82突變體和ftr82 mRNA 541在9 dB的一次性刺激下以5dpf拯救幼蟲。1 ms-2 。（C，D）在不同強(qiáng)度的聲音刺激下，5dpf幼蟲與對照組、ftr82突變體和ftr82 mRNA拯救組的平均距離和峰值運(yùn)動速度的統(tǒng)計(jì)分析。
敲除ftr82基因會破壞HC的發(fā)育和聽覺功能
為了進(jìn)一步鑒定ftr82基因在HC發(fā)育中的作用，我們首先利用CRISPR/Cas9對轉(zhuǎn)基因158斑馬魚的基因編輯技術(shù)構(gòu)建了ftr82突變體。我們合成了一個(gè)針對ftr82基因外顯子2的編碼序列的sgRNA，并將Cas9 mRNA共注射到單細(xì)胞階段的胚胎中（圖5A）。通過PCR和從生長中的胚胎中提取的基因組DNA測序來驗(yàn)證該基因型。結(jié)果顯示，突變成功地發(fā)生在ftr82基因的靶位點(diǎn)（圖5B）。
為了描述ftr82敲除對HC形態(tài)發(fā)生的影響，我們觀察了HCs 163在耳囊泡和pLL系統(tǒng)中的發(fā)育過程，以確定ftr82突變體的表型。與ftr82嗎啡啉突變體的表型相似，在72 hpf時(shí)，ftr82突變體的前、側(cè)、后嵴hc隨著纖毛的縮短而明顯減少（圖5D、5G、5H）。在72 hpf時(shí)，ftr82 基因敲除的幼蟲中，pLL中的HC簇顯著減少，單個(gè)神經(jīng)肥大中的功能HC顯著減少（圖5C、5E、5I、5J）。在ftr82突變體中，在96 hpf時(shí)也觀察到了一致的現(xiàn)象(圖。S4).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在驚嚇反應(yīng)行為實(shí)驗(yàn)中，ftr82突變體中運(yùn)動的平均距離和峰值速度明顯降低（圖5F、5K、170 5L）。以上結(jié)果表明，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ftr82突變深刻影響了斑馬魚 HC的發(fā)育和聽力功能。
圖5 在靶位點(diǎn)成功實(shí)現(xiàn)了CRISPR/cas9介導(dǎo)的ftr82突變，敲除ftr82基因破壞了斑馬魚HC的形態(tài)發(fā)生，導(dǎo)致聽力喪失。(A)靶向外顯子2產(chǎn)生ftr82突變的ftr82特異性sgRNA示意圖。(B)與野生型魚相比，ftr82突變體的靶位點(diǎn)出現(xiàn)了多個(gè)突變。(C)對照、ftr82突變體和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時(shí)pLL中HC簇(用紅色箭頭標(biāo)記)的相襯和熒光顯微圖。比例尺:500μm。(D)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時(shí)的代表性囊泡熒光圖像，分別為ACHC、LCHC(用白色虛線圈標(biāo)記)和PCHC。相應(yīng)組LCHC放大圖。比例尺:20μm。(E)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時(shí)pLL單個(gè)神經(jīng)肥大HC簇(綠色)和功能HC簇(紅色)的重疊熒光圖像。比例尺:20μm。(F)在9 dB re.1 ms-2的一次性刺激下，在5dpf條件下，對照、ftr82突變體和ftr82 mRNA獲救的幼蟲在驚嚇反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的游動軌跡。 (G-H)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組不同crissta HC簇中HC數(shù)量和72 hpf時(shí)纖毛平均長度的統(tǒng)計(jì)分析。(I-J)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時(shí)每個(gè)神經(jīng)肥大中功能性HC數(shù)量和pLL中HC簇?cái)?shù)量的統(tǒng)計(jì)分析。(K-L)不同聲刺激強(qiáng)度下，對照組、ftr82突變組和ftr82 mRNA搶救組5dpf幼蟲的平均運(yùn)動距離和峰值運(yùn)動速度的統(tǒng)計(jì)分析。
ftr82突變體和突變體的缺陷表型可以通過微量注射ftr82 mRNA來挽救
為了證實(shí)在ftr82突變體和突變體中觀察到的表型是由ftr82缺失特異性誘導(dǎo)的，我們進(jìn)行了經(jīng)典的mRNA拯救實(shí)驗(yàn)。將外源性ftr82 mRNA與morpholino或sgRNA共注射到單細(xì)胞期胚胎中進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在ftr82變異體中，共注射ftr82 mRNA可以部分修復(fù)pLL中嵴hc減少、纖毛縮短、神經(jīng)肥大和功能hc減少等異常表型(圖2、3、S2、S3)。同時(shí)，共注射ftr82 mRNA也可以部分恢復(fù)聽力損失(圖4)。同樣，微量注射ftr82 mRNA也可以挽救ftr82突變體中出現(xiàn)的HC缺陷和聽力功能障礙(圖5C-5L, S4)。上述結(jié)果表明，HC形態(tài)發(fā)生異常和聽力功能障礙是由ftr82缺失特異性引起的。
ftr82基因功能缺失誘導(dǎo)斑馬魚HC凋亡
為了進(jìn)一步研究ftr82 186突變體中HC表型的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，我們用抗凋亡標(biāo)記物caspase-3的抗體進(jìn)行了細(xì)胞凋亡檢測。免疫熒光結(jié)果顯示，在正常幼蟲中沒有檢測到caspase-3的切割信號，而在ftr82突變體中，近一半的幼蟲中caspase-3的切割信號與HC共定位（圖6）。此外，我們發(fā)現(xiàn)ftr82的功能缺失并不影響支持細(xì)胞的發(fā)育(圖。S5)。這是ftr82在缺失時(shí)導(dǎo)致HC減少的主要機(jī)制。
圖6 敲除ftr82基因可誘導(dǎo)HC細(xì)胞凋亡。(A)免疫熒光圖像識別565只對照和ftr82突變體的pLL中單個(gè)核（藍(lán)色）、HC（綠色）和切割的caspase-3信號（紅色）。比例尺：20μm。(B)對對照組和ftr82突變組凋亡信號進(jìn)行定量分析（n=20）。
討論
我們都知道，TRIM蛋白具有共同的特征，它們包含相同的RBCC基序排列，包括RING、B-box和螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域?？勺僣端結(jié)構(gòu)域的多樣性決定了TRIM蛋白在不同的細(xì)胞過程中的作用，如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、腫瘤發(fā)生、和凋亡。TRIM蛋白的保守結(jié)構(gòu)跨越了從低等脊椎動物魚類到哺乳動物的多個(gè)物種。哺乳動物中的TRIM蛋白被廣泛報(bào)道，主要有200種通過直接的病毒限制或調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答參與抗病毒免疫。TRIM5α是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的TRIM蛋白，作為一種抗病毒藥物，可直接與人類免疫缺陷病毒（HIV）衣殼蛋白結(jié)合。與此同時(shí)，許多TRIM蛋白正向調(diào)控抗病毒先天免疫信號通路（TRIM4、TRIM21、TRIM25和TRIM56）或負(fù)向調(diào)控（TRIM11、TRIM27、TRIM28、TRIM38和TRIM59）。此外，TRIM蛋白在魚類的抗病毒免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。魚類具有幾個(gè)大的特異性基因擴(kuò)增，包括finTRIMs (ftr)， TRIM39/嗜血相關(guān)TRIM (btr)和trim35樣基因/hls5 (hltr)。其中，finTRIM（ftr）是一個(gè)新的亞群，只存在于硬骨魚中，但在高等脊椎動物中沒有明顯的同源性。有限的報(bào)道表明，在病毒感染或IFN誘導(dǎo)后，F(xiàn)TR36和FTR83的表達(dá)可能會上調(diào)，而ftr01通過TBK1的自噬-溶酶體降解負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)?？梢钥闯?，TRIM基因中的絕大多數(shù)與從魚類到人類的多物種的先天免疫過程有關(guān)。
Ftr82可能是一個(gè)基礎(chǔ)的和祖先的finTRIM基因，在主要魚類分支中具有同源性。對用NJ方法構(gòu)建的ftr82的系統(tǒng)發(fā)育樹也進(jìn)行了驗(yàn)證（圖1）。斑馬魚中的大多數(shù)功能ftr基因通常在非?；A(chǔ)的低水平表達(dá)，并通過病毒感染或 IFN治療顯著上調(diào)。與ftr基因的典型特性不同，ftr82具有相對較高的組成水平表達(dá)，允許ISH信號檢測。研究表明，ftr82在24 hpf之前僅局限于外側(cè)中胚層和前腎中胚層，在48 hpf時(shí)到達(dá)耳泡、腸道、心臟、肝臟、咽和靜脈，而在72-96 hpf時(shí)，專注于腦鰓、腸道、表皮、腎、肝、咽和脾臟。在我們的WISH實(shí)驗(yàn)中觀察到普遍一致的結(jié)果，然而，區(qū)別在于ftr82陽性信號總是局限于在96 hpf之前的不同階段的耳部囊泡（圖1D’-I’）。一個(gè)系統(tǒng)和更詳細(xì)的ftr82表達(dá)提供了表達(dá)譜，以深入了解潛在的組織特異性功能。此外，ftr82 在SVCV感染期間的6h和48 h時(shí)僅出現(xiàn)了輕微的上調(diào)。與最近的親屬ftr83不同，過表達(dá)ftr82并不誘導(dǎo)IFN的上調(diào)。根據(jù)之前關(guān)于ftr82的報(bào)道，它似乎是finTRIM基因中的一個(gè)特殊的基因，但沒有抗病毒活性的證據(jù)。此外，另一份報(bào)告顯示，ftr82 影響了由Notch/VEGF通路介導(dǎo)的斑馬魚的血管模式。它似乎表明，ftr82基因的功能仍然很大程度上未知。
考慮到ftr82在斑馬魚耳囊中的特異性高表達(dá)，我們推測ftr82可能在聽器官的發(fā)育中起作用。為了確定ftr82是否為聽力相關(guān)基因，我們首先構(gòu)建了ftr82突變體。ftr82基因的下調(diào)不僅影響耳小泡HC的形態(tài)發(fā)生，還影響pLL系統(tǒng)HC的形態(tài)發(fā)生，表現(xiàn)為pLL嵴HC減少、纖毛縮短、神經(jīng)鞘和功能性HC減少(圖2、3、S2、S3)。在CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)介導(dǎo)的ftr82突變體中也觀察到一致的hc缺陷表型(圖5和圖S4)，進(jìn)一步證實(shí)了這是由ftr82缺失引起的。此外，在ftr82突變體中出現(xiàn)了HC的異常表型，通過顯微注射外源性ftr82 mRNA可以挽救突變體(圖2、3、5)。結(jié)果表明，HC的丟失是由ftr82的功能喪失引起的。雖然在WISH檢測中沒有檢測到pLL系統(tǒng)中的陽性信號(圖1D-1I)，但ftr82基因確實(shí)破壞了pLL中hc和神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育(圖3、5、S3、S4)，這可能是由于WISH檢測方法的靈敏度限制。眾所周知，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的主要方式之一。HC細(xì)胞凋亡可由半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspases)、p53腫瘤抑制基因、活性氧等多種因素觸發(fā)。據(jù)報(bào)道，在人乳腺癌細(xì)胞中，TRIM24缺失導(dǎo)致p53依賴的自發(fā)凋亡，TRIM69通過p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控斑馬魚的發(fā)育。在這里，我們檢測了切割的caspase-3 252信號，一個(gè)細(xì)胞凋亡的標(biāo)記，在近一半的ftr82 突變體幼蟲中與HCs共定位（圖6）。結(jié)果表明，caspase-3激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致HCs缺陷的主要原因。斑馬魚HCs被認(rèn)為是用于感知外部聲音刺激和流體流動。ftr82缺失導(dǎo)致的HCs缺失導(dǎo)致了斑馬魚行為改變，表現(xiàn)為對外部聲音刺激的敏感性較低(圖4和5）。綜上所述，我們的研究表明，ftr82是調(diào)控HC形態(tài)發(fā)生和聽覺功能的關(guān)鍵基因。
Ftr82是魚類TRIMs家族的一員，在這項(xiàng)工作中首次被發(fā)現(xiàn)參與了聽覺器官的發(fā)育。雖然在哺乳動物中沒有相應(yīng)的同源物，但這并不妨礙我們對TRIMs功能的深入理解和推測。斑馬魚作為一種常見的模式生物，在聽覺器官發(fā)育研究中具有無需解剖即可快速讀出表型、實(shí)驗(yàn)周期短、成本低、熒光染色分析方便等明顯優(yōu)勢。這項(xiàng)工作不僅為全面了解ftr82基因的功能提供了充分的信息，而且為快速鑒定耳聾基因提供了新的見解。
斑馬魚的飼養(yǎng)和倫理聲明
本研究采用轉(zhuǎn)基因系Tg(Brn3c:mGFP)和野生型菌株AB。在前者中，膜定位的綠色熒光蛋白(GFP)在HCs中特異性表達(dá)。按照我們之前的方案，斑馬魚成年魚和胚胎在28.5℃的環(huán)境中飼養(yǎng)和維持。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)南通大學(xué)動物保護(hù)與利用委員會批準(zhǔn)。所有動物均嚴(yán)格按照南通大學(xué)動物護(hù)理與使用委員會批準(zhǔn)的動物程序處理，符合國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理與使用指南。
按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行全載原位雜交(WISH)。用設(shè)計(jì)的引物從斑馬魚胚胎cDNA文庫中克隆出466 bp的ftr82 cDNA片段(表S1)，并插入到pGEM-T-easy載體中。使用線性化pGEM-T-easy插入ftr82片段和DIG RNA標(biāo)記試劑盒(SP6&.T7) (Roche， #11175025910)，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的反義探針。之后，將不同發(fā)育階段的無色素的預(yù)先固定的斑馬魚胚胎用探針孵育過夜，用堿性磷酸酶(AP)-偶聯(lián)抗地高辛抗體(Roche， #11093274910)檢測。隨后，使用堿性磷酸酶(AP) -底物NBT/BCIP溶液(Roche， #11681451001)進(jìn)行顯色反應(yīng)，以可視化目標(biāo)基因的表達(dá)。按照上述步驟，用設(shè)計(jì)好的引物合成eya1 mRNA探針(表S1)，用于識別斑馬魚幼體的神經(jīng)鞘。
嗎啡肽顯微注射液及效率驗(yàn)證
利用基因工具公司合成了ftr82特異性剪接阻斷嗎啉。將嗎啉粉溶解在無RNAse的水中制備原液。然后將稀釋濃度為0.3 mM的嗎啉工作溶液微注射到單細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）驗(yàn)證了嗎啉在外顯子4和內(nèi)含子4連接位點(diǎn)引起錯(cuò)誤剪接的效率。從注射或不剪接嗎啉的胚胎中提取RNA，并逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄到cDNA。將設(shè)計(jì)引物標(biāo)記在第3外顯子和第7外顯子上（表S1）來檢測ftr82 297的敲除效率。
sgRNA/Cas9 mRNA的合成、顯微注射和突變體的鑒定
為了獲得ftr82突變體斑馬魚，首先合成了靶向ftr82外顯子2的特異性單導(dǎo)RNA (sgRNA)。采用含有ftr82基因靶向區(qū)(5′-GGAGGAGCTGAAGACAGCGG -3′)的正向引物和通用反向引物(表S1)，以pT7質(zhì)粒為PCR模板擴(kuò)增sgDNA。然后，根據(jù)制造商的說明，使用MAXIscriptTM T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen， #AM1314)，用sgDNA體外轉(zhuǎn)錄生成sgRNA。使用mMESSAGE MmachinTM T7 Kit (Invitrogen， #AM1344)，用線性化的pXT7-Cas9質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄獲得Cas9 mRNA。將濃度分別為300 ng/μL和100 ng/μL的Cas9 mRNA和sgRNA混合溶液2 nL微注射到單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中。為了確定是否發(fā)生突變，隨機(jī)選擇注射胚胎提取基因組DNA，并使用設(shè)計(jì)的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2的測序引物進(jìn)行擴(kuò)增(表S1)。對含有靶向位點(diǎn)的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序以確定突變類型。
mRNA合成和挽救實(shí)驗(yàn)
用設(shè)計(jì)的引物ftr82-mRNA-BamHI-F和ftr82-mRNA- XbaI-R擴(kuò)增了含有ftr82開放閱讀框約2000 bp DNA(表S1)。將擴(kuò)增片段插入人工pCS2+載體中，獲得重組質(zhì)粒ftr82-pCS2+。使用mMESSAGE MmachineTM SP6 Kit (Invitrogen，#AM1340)，以線性化重組質(zhì)粒為模板，體外轉(zhuǎn)錄ftr82 mRNA，然后使用RNeasy Mini Kit (Qiagen，#74104)進(jìn)行純化。將50 ng/μL的ftr82 mRNA溶液約2 nL與sgRNA或morpholino共注射到單細(xì)胞期胚胎中進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。
FM4-64染色和免疫熒光
使用紅色熒光生命染料FM4-64特異性標(biāo)記神經(jīng)鞘中的功能性HCs，具體步驟如下。將自由游動的幼蟲置于3 μM FM4-64胚液中，室溫黑暗浸泡45 s。然后去除染料溶液，用胚液輕輕沖洗三次后成像。采用免疫熒光法檢測caspase-3細(xì)胞凋亡信號。受精后72 h的幼蟲在室溫下用4% (w/v)多聚甲醛固定2 h，然后用1% Triton X-100滲透30 min，用10%驢血清在37℃下阻斷1 h。加入兔單克隆抗裂解caspase-3(1:500稀釋，CST, 329 #9664)和雞多克隆抗gfp(1:500稀釋，Abcam，#ab13970)的一抗，在4°C孵育過夜。然后，分別用Alexa FluorTM 555驢抗兔lgG (H+L)(1:1000稀釋，Invitrogen，# A -31572)和Alexa FluorTM 488山羊抗雞lgG (H+L)(1:1000稀釋，Invitrogen，# A -11039)的二抗檢測一抗。最后用Hoechst 33342(10μg/mL, Invitrogen，#62249)在室溫下染色20 min, PBS洗滌3次成像。此外，使用兔多克隆抗sox2(1:500稀釋，Abcam，#ab 97959)的一抗特異性識別pLL神經(jīng)鞘中的支持細(xì)胞。
快速反應(yīng)試驗(yàn)
聲驚嚇反射的行為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下。隨機(jī)選取25只受精后5 d（dpf）的正常幼蟲，放入薄層胚培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。在皿的底部，我們在實(shí)驗(yàn)中使用了6 dB和9 dB re ms-2到30 ms的刺激。每個(gè)刺激水平重復(fù)20次，用紅外攝像機(jī)在6秒的時(shí)間內(nèi)記錄幼蟲對聲音刺激行為反應(yīng)。然后，從錄像帶中提取幼蟲的運(yùn)動軌跡。并分析了運(yùn)動的平均距離和峰值速度，作為量化幼蟲對聲音刺激的驚嚇反應(yīng)的典型參數(shù)。
成像和統(tǒng)計(jì)分析
使用立體顯微鏡（Olympus，MVX10）記錄WISH 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。用共聚焦顯微鏡（Nikon，A1-DUT）記錄ftr82敲除或敲除模型的HC表型結(jié)果、染色和免疫熒光結(jié)果。首先用三卡因MS-222（Sigma，#A5040）麻醉，然后用0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖成像。獲得的共焦圖像采用Imaris X64軟件（版本352 9.0.1）進(jìn)行處理。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均± SEM 3由PraphPadPrism分析（版本8.0.2）分析。采用雙尾、非配對學(xué)生t檢驗(yàn)確定組間的顯著性差異，P < 0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。條形圖上“*、***、****、*****”的符號分別表示P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001、P < 356 0.0001，“ns”表示無顯著性。
基金：本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018YFA0801004；81870359）、江蘇省高等教育學(xué)校自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22KJB320020）、江蘇省“創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)博士”項(xiàng)目資助。
詳細(xì)網(wǎng)址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1673852722002521
注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。
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