雜志：Atherosclerosis
影響因子：5.3（2023）
年份：2022
通訊作者：Chun Liang，Qing Jing
通訊作者單位：Department of Cardiology, Changzheng Hospital, Shanghai, 200003, China；
摘要
背景和目的：ApoEb是斑馬魚中與哺乳動(dòng)物ApoE同源的一種，缺乏ApoE會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等脂質(zhì)代謝紊亂(LMDs)。我們嘗試敲除斑馬魚ApoEb，然后建立LMD斑馬魚模型。
方法：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除ApoEb，并通過油紅O染色、共聚焦成像和脂質(zhì)測(cè)量證實(shí)脂質(zhì)蓄積。通過斑馬魚幼魚活體成像，我們?cè)u(píng)估了辛伐他汀(SIM)、依折麥布(EZE)和血脂康(XZK)的降脂作用。
結(jié)果：在ApoEb突變體中，血管發(fā)生了顯著的脂質(zhì)沉積，在幼魚和成體血漿的全身勻漿中進(jìn)行的脂質(zhì)測(cè)定顯示脂質(zhì)水平顯著升高。SIM、EZE和XZK明顯緩解ApoEb突變體的高脂血癥，XZK對(duì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集有顯著的抑制作用。
結(jié)論：本研究在ApoEb突變斑馬魚中建立了LMD模型。我們認(rèn)為這一多功能模型可用于研究高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化早期相關(guān)的血管病理，以及ApoE的生理功能。
關(guān)鍵詞：高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、載脂蛋白、ApoEb、血脂康、斑馬魚。
前言
載脂蛋白E (ApoE)是一種主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物肝臟的載脂蛋白。它在脂質(zhì)代謝，特別是極低密度脂蛋白(vldl)、膽固醇和高密度脂蛋白(hdl)的代謝中起著至關(guān)重要的作用。ApoE與心血管疾病(如高脂血癥和缺血性心臟病)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系已通過大量流行病學(xué)觀察和遺傳學(xué)研究以及干預(yù)性臨床試驗(yàn)被發(fā)現(xiàn)。大約一半的血漿ApoE與富含甘油三酯的脂蛋白有關(guān)，其中ApoE是低密度脂蛋白受體(LDLR)和LDLR相關(guān)蛋白(LRP)的主要配體。既往研究發(fā)現(xiàn)，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)調(diào)控LDLR及其他參與膽固醇生物合成的蛋白如羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)、脂肪酸合成酶(FASN)、蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草素/酮蛋白9型(PCSK9)的表達(dá)。
針對(duì)各種途徑的降脂藥物已經(jīng)成功地幫助人類控制高脂血癥。辛伐他汀(Simvastatin, SIM)是針對(duì)Ldlr表達(dá)的主要藥物之一，能夠有效降低LDL-C，減少人類心血管疾病的發(fā)病率。血脂康(XZK)是從紅曲米中提取的一種常用中藥。在國內(nèi)外的臨床試驗(yàn)中均顯示出強(qiáng)大的降脂效果。盡管XZK被廣泛使用，但其藥理和毒理學(xué)作用仍未完全闡明。
雖然發(fā)明了各種降脂藥物，但家族性高膽固醇血癥(FH)患者對(duì)這些藥物并不敏感，因此新的降脂藥物仍有待開發(fā)，有效的動(dòng)物模型至關(guān)重要。但是，使用ApoE-/-小鼠進(jìn)行藥物篩選和高脂血癥相關(guān)研究的過程是比較昂貴、耗時(shí)的。斑馬魚作為一種新型的模式動(dòng)物，具有胚胎透明、后代數(shù)量多、維護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn)。更重要的是，人類和斑馬魚之間的基因具有相對(duì)較高的保守性，包括編碼載脂蛋白家族成員的基因，如ApoA家族、ApoB、ApoC2和Ldlr。為了深入研究FH等脂質(zhì)代謝紊亂(LMDs)，近年來建立了相應(yīng)基因突變的斑馬魚品系。已知的FH的主要原因是Ldlr、ApoB(編碼載脂蛋白B的基因)和Pcsk9以及ApoE的致病變異。其中Ldlr、ApoB和Pcsk9突變斑馬魚系近年來已建立，但FH的病理生理機(jī)制尚不明確。為研究FH及相關(guān)cvd的發(fā)生發(fā)展提供一個(gè)不同的視角，本研究采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚ApoEb基因的表達(dá)，隨后進(jìn)行短時(shí)間高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)，建立了一種新型斑馬魚LMD模型。利用這一疾病模型，我們對(duì)XZK預(yù)防LMDs的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。本研究為今后高脂血癥、FH等LMDs的病理生理學(xué)研究以及降脂藥物的藥理和毒理學(xué)研究開辟了新的途徑。
材料和方法
野生型(Tuebingen)、Tg (fli1: EGFP)、Tg (ccl2:mCherry)和Tg (flk1:dsRed;lyz: EGFP)斑馬魚胚胎通過體外受精和自然產(chǎn)卵獲得，成魚在28℃下保持14/10小時(shí)的光/暗周期，并按照描述進(jìn)行分期。在Tg (fli1: EGFP)魚線中，綠色熒光蛋白標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。在Tg (flk1:dsRed;lyz: EGFP)幼魚，紅色熒光蛋白標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，綠色熒光蛋白標(biāo)記中性粒細(xì)胞。在Tg (ccl2:mCherry)細(xì)胞系中，心肌細(xì)胞被紅色熒光蛋白標(biāo)記。為了防止胚胎發(fā)育期間的色素沉著，在培養(yǎng)水中添加0.003% 2-苯基硫脲(PTU, Sigma-Aldrich, CA, USA)。從受精后第5天(dpf)開始，斑馬魚幼魚每天兩次喂食，分別以正常飼料(ND)(草履蟲，來自中國斑馬魚資源中心)或高脂飼料(HFD)(上海元野，中國)，其中每體重(w/w)含有4%的膽固醇和20%的甘油三酯。在藥物治療實(shí)驗(yàn)中，將辛伐他汀(Sigma-Aldrich，慕尼黑，德國)、依折麥布(Selleckchem，上海，中國)和XZK(北京北京大學(xué)WBL生物技術(shù)有限公司，北京，中國)溶解于二甲基亞砜(DMSO) (Sigma-Aldrich，慕尼黑，德國)中，并與HFD充分混合。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，藥物在使用時(shí)被溶解成不同的濃度。所有處理組的DMSO終濃度均≤0.5% vol/vol (v/v)。成年Tuebingen品系斑馬魚在相同環(huán)境中飼養(yǎng)，并按照描述每天喂食兩次鹵蝦(渤海，濱州，中國)。成年魚高脂飼料(含5% w/w膽固醇和24% w/w甘油三酯)購自中國南通營養(yǎng)集團(tuán)公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)上海長征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除ApoEb
本研究使用的gRNA質(zhì)粒和Cas9 mRNA質(zhì)粒是北京大學(xué)熊景偉博士贈(zèng)送的。使用T7 RNA聚合酶(Ambion, TX, USA)按照制造商的說明進(jìn)行g(shù)RNAs和Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄，并通過苯酚氯仿萃取純化。選擇了兩個(gè)ApoEb基因組靶序列:5 ' - gcccagatgggaggagatggtggg -3 '和5 ' - gcccagaggaagaaccgtgtcgg -3 '，其中后3nt為CRISPR/Cas9功能所需的原間隔鄰近基序(protospacer鄰基序，PAM)。將100 pg的gRNAs和200 pg的Cas9 mRNA共注射到1至2細(xì)胞期的胚胎中?；蚍中蜁r(shí)，取成魚尾鰭部分切除，全胚均質(zhì)。使用TransDirect動(dòng)物組織PCR試劑盒(Transgen，北京，中國)提取基因組DNA。使用Ex Taq DNA聚合酶(Takara, Tokyo, Japan)擴(kuò)增含有目標(biāo)位點(diǎn)的基因組DNA片段。用于擴(kuò)增ApoEb cDNA側(cè)面外顯子3至外顯子4的引物見補(bǔ)充表1。所有引物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Sanger測(cè)序詳細(xì)確認(rèn)基因型由中國上海Biosune有限公司提供。
定量RT-PCR
使用Trizol試劑(Thermo Fisher, MA, USA)從15只幼魚中分離總RNA，并使用FastQuant RT Kit (Tiangen, Beijing, China)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan)進(jìn)行定量RT-PCR檢測(cè)。用于mRNA檢測(cè)的引物均列在補(bǔ)充表1中。
油紅O染色
油紅O (Oil Red O, ORO)染色采用油紅O染料(Sigma-Aldrich, Munich, Germany)對(duì)斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)進(jìn)行染色。斑馬魚幼魚在4%多聚甲醛(生工，上海，中國)中固定12 h，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(生工，上海，中國)洗滌兩次，然后在0.3% ORO溶液中孵育3 h。染色的幼魚在成像前用PBS沖洗。
全載免疫熒光(Wm-IF)
3dpf Tg (flk1:dsRed;lyz:EGFP)幼魚被固定在4%多聚甲醛中，并用于Wm-IF，如前所述[[17]]。使用以下抗體:抗mpo (1:20 00;兔子;Abcam)，抗mfap4 (1:20 00;兔子;Abcam)和驢抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 647)抗體(1:20 00;Abcam)。
成像和計(jì)數(shù)
如之前所述，在HFD中添加1 μg/g的熒光膽固醇酯類似物yl BODIPY 576/589C11 (Invitrogen, Carlsbad, USA)，用于血管脂質(zhì)沉積的體內(nèi)可視化。將Tg (fli1:EGFP)幼魚按照不同的實(shí)驗(yàn)程序用這種熒光標(biāo)記的飼料喂養(yǎng)特定的時(shí)間后，將其安裝在含0.04% Tricaine的Danieu溶液中的低熔點(diǎn)瓊脂糖(Sigma-Aldrich)中，使其固定。在徠卡TCS SP5共聚焦顯微鏡下，以400 Hz、1024 × 1024像素、1.5 μm步長掃描幼魚。分別使用相同參數(shù)的共聚焦顯微鏡和Leica M205熒光顯微鏡對(duì)Tg (fli1: EGFP)細(xì)胞系的血管生成進(jìn)行活體成像，同時(shí)使用Leica M205熒光顯微鏡對(duì)Tg (flk1:dsRed;lyz: EGFP)魚線。采用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics, MD, USA)計(jì)數(shù)軀干連續(xù)10個(gè)節(jié)段的中性粒細(xì)胞數(shù)量。使用Leica M205熒光顯微鏡拍攝Tg (ccl2: mCherry)魚線的心臟跳動(dòng)圖像和影片。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)量。采用體視顯微鏡(Zeiss, Oberkochen，德國)對(duì)ORO染色和中性紅染色進(jìn)行亮視野成像。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量所有ORO染色或中性紅染色圖像中軀干連續(xù)5節(jié)段的積分光密度(IOD)值，相對(duì)定量血管脂質(zhì)積聚或巨噬細(xì)胞募集。所有的圖像都是側(cè)位圖，前向左，背側(cè)向上，除非特別注明。
血脂水平測(cè)定
同一組15只幼魚在冰PBS中安樂死，超聲破碎勻漿，收集上清作為1個(gè)勻漿樣。使用總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)定量試劑盒(中國南京建成)，分別按照制造商的方案測(cè)定稀釋后的成蟲血漿或幼魚勻漿中的脂質(zhì)水平。
中性紅染色
每組取15只活幼魚，分別在含2.5 mg/L中性紅色染料溶液(Solarbio，北京，中國)的12孔板中培養(yǎng)，由于巨噬細(xì)胞的募集，活幼魚會(huì)聚集在巨噬細(xì)胞中形成紅點(diǎn)。孵育8 h后麻醉幼魚，顯微鏡下觀察。
組織學(xué)
收集4 μm厚的成年斑馬魚石蠟切片。包含DA或PCV病變的切片分別按照先前報(bào)告的方案進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色。
統(tǒng)計(jì)分析
用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)評(píng)估正態(tài)性。數(shù)據(jù)擬合正態(tài)分布表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)，而箱線圖表示偏態(tài)分布數(shù)據(jù)。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于正態(tài)分布數(shù)據(jù)，進(jìn)一步進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)。當(dāng)數(shù)據(jù)符合方差齊性時(shí)，采用雙尾Student's t檢驗(yàn)或單因素方差分析。對(duì)于不符合方差齊性的數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)、Brown-Forsythe ANOVA檢驗(yàn)或Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。對(duì)偏態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。p值均為雙側(cè)，p < 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
在斑馬魚中，ApoE基因有兩個(gè)類似物——ApoEa (NCBI基因ID: 553587)和ApoEb (NCBI基因ID: 30314)。盡管其與小鼠或人類ApoE的同源性不到30%(補(bǔ)充圖1A)，但ApoEb(而非ApoEa)包含一個(gè)保守區(qū)域，編碼與人類ApoE的脂蛋白受體結(jié)合區(qū)(LRR)相似的氨基酸序列，其蛋白質(zhì)序列滿足血漿載脂蛋白潛在的兩性螺旋特征所描述的共同結(jié)構(gòu)特征。先前的一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，ApoEa的表達(dá)在魚類發(fā)育過程中逐漸減少，而ApoEb的表達(dá)則增加。所有這些都表明，在哺乳動(dòng)物ApoE等保守功能基元中，ApoEb可能在斑馬魚的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。為了利用CRISPR/Cas9有效阻斷ApoEb基因的表達(dá)，我們分別針對(duì)其外顯子3和4設(shè)計(jì)了2個(gè)gRNAs(圖1A)。這可能導(dǎo)致ApoEb mRNA中378個(gè)核苷酸的缺失，從而導(dǎo)致相應(yīng)ApoEb蛋白中126個(gè)氨基酸(aa)的丟失和1個(gè)氨基酸的誤翻譯(圖1B)。翻譯后的截?cái)嗟鞍卓赡軙?huì)失去載脂蛋白結(jié)構(gòu)域的部分和ApoEb功能所需的LRR(圖1C)。因此，突變體可能只有ApoEb蛋白的功能喪失。將合成的gRNA和Cas9 mRNA盡快注入受精卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，獲得突變體(F0)。F0基因組DNA的Sanger測(cè)序顯示，在幾個(gè)突變體中出現(xiàn)542個(gè)核苷酸缺失(Δ542)，如圖1D所示。為了將這一突變攜帶到其他具有不同轉(zhuǎn)基因背景的斑馬魚品系，成功誘變的F0代被飼養(yǎng)到成年，并與其他魚系雜交獲得F1代。性成熟后，將F1雄性與F1雌性雜交，得到攜帶相同突變的F2胚胎。經(jīng)過2代，純合子ApoEb突變Tg (fl1:EGFP)， Tg (flk1:dsRed;然后篩選出lyz: EGFP)和Tg (ccl2:mCherry)系。利用整合序列對(duì)正常ApoEb mRNA進(jìn)行Rt-qPCR檢測(cè)顯示，在5dpf ApoEb?/?突變體以及2月齡成魚的肝臟中，ApoEb mRNA水平幾乎檢測(cè)不到(圖1E)。這部分結(jié)果表明，純合子中存在不具有正常功能的ApoEb蛋白。
圖1 ApoEb敲除斑馬魚突變體的建立。(A) ApoEb位點(diǎn)gRNA靶位示意圖。設(shè)計(jì)了兩個(gè)gRNA靶點(diǎn)來誘導(dǎo)大片段缺失。外顯子3和4的白色片段表示要?jiǎng)h除的片段。紅色箭頭表示用于基因分型的引物的位置。綠色箭頭表示用于檢測(cè)正常ApoEb mRNA的引物的位置。+1，翻譯起始位點(diǎn);+748和+ 1290是gRNA的靶位;+2242, ApoEb的終止密碼子位點(diǎn)。(B) ApoEb突變體序列顯示開放閱讀框(ORF)缺失375 個(gè)核苷酸，這意味著缺失126個(gè)氨基酸(aa)和1個(gè)錯(cuò)誤的氨基酸(R→C)。(C)斑馬魚ApoEb蛋白含有一個(gè)保守的信號(hào)肽(SP)和載脂蛋白結(jié)構(gòu)域(Pfam ID: PF01442)，其中存在一個(gè)脂蛋白受體結(jié)合區(qū)(LRR)。部分載脂蛋白結(jié)構(gòu)域和ApoEb功能所需的LRR在預(yù)測(cè)的截?cái)嗟腁poEb突變蛋白中丟失。(D)與測(cè)序結(jié)果一致，基因分型顯示F2個(gè)雜合子(±)和純合子(?/?)的基因組Δ542缺失。(E)對(duì)5只dpf F3幼魚全身勻漿中ApoEb mRNA水平的定量分析顯示，純合子(?/?)以及2月齡成蟲肝臟中ApoEb的表達(dá)顯著降低。左圖為每個(gè)樣本15只幼魚，每組n = 12只。在右圖中，每組n = 10。
成年ApoEb突變斑馬魚的高脂血癥
在3個(gè)月大的野生型雄性斑馬魚和ApoEb突變斑馬魚之間，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的生理差異(圖2A和圖B)。為了測(cè)試ApoEb缺乏是否會(huì)導(dǎo)致高甘油三酯血癥，我們從喂食8周正常飲食(ND)和高脂肪飲食(HFD)的成年雄性斑馬魚身上采血，測(cè)量血漿中的脂質(zhì)譜。結(jié)果表明，ND喂養(yǎng)的ApoEb突變體具有較高的血漿TC、LDL-C和VLDL水平。ApoEb突變體血漿TG水平有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過HFD喂養(yǎng)后，ApoEb突變體血漿中的TC、TG、LDL-C和VLDL水平顯著升高，而HDL-C與同胞相比沒有變化(圖2C)。由于ApoEb很可能是斑馬魚LDLR的配體，而斑馬魚LDLR是細(xì)胞外膽固醇攝取和肝臟內(nèi)Srebp通路調(diào)節(jié)血漿膽固醇所必需的，因此我們接下來在正常喂養(yǎng)的2月齡ApoEb突變體的肝臟中測(cè)試了ApoEb敲除是否對(duì)Srebp通路產(chǎn)生影響，而Srebp通路也是許多降脂藥物的靶點(diǎn)(圖2D)。Srebp-2的兩個(gè)靶基因Hmgcr和Ldlr的表達(dá)水平在ApoEb突變體中顯著上調(diào)，而Srebp-2沒有顯著上調(diào)。在ApoEb突變體中，Srebp-1及其靶基因Fasn的mRNA表達(dá)增加。
圖2 成年ApoEb突變斑馬魚發(fā)生高脂血癥。(A) 3月齡野生型雄性斑馬魚與ApoEb突變斑馬魚之間無明顯差異。成年魚的體長是指從嘴部到尾鰭開始的長度(如紅線段所示)。(B) 3月齡成魚ApoEb缺失后體長和體重?zé)o明顯變化。每組N = 14。(C) 8周正常飲食(ND)或高脂肪飲食(HFD)喂養(yǎng)3個(gè)月大的野生型斑馬魚或ApoEb突變體的血漿脂質(zhì)譜。每個(gè)樣本共5只動(dòng)物，每組n = 6。(D) ApoEb突變成人肝臟中SREBP-1和-2通路的激活。每組N = 6。
ApoEb突變體幼魚的早期血管生成缺陷
3dpf ApoEb突變的幼魚在發(fā)育、卵黃利用和生長方面沒有顯著缺陷(圖3A)。3dpf野生型斑馬魚和ApoEb突變體的體長、卵黃面積和卵黃延伸沒有任何差異(圖3B)。然而，約40%的ApoEb突變體在3dpf時(shí)出現(xiàn)腦出血，主要發(fā)生在中腦和后腦(圖3C和D，紅色三角形表示)。3 dpf ApoEb突變體Tg (fli1: EGFP)幼魚的共聚焦成像顯示，腦血管網(wǎng)絡(luò)的完整性受到明顯干擾。例如，在圖3E中，紅色三角形表示ApoEb突變體中狹窄的腦后靜脈(PCeVs)，而白色三角形表示原始后腦通道(PHBCs)的缺失。然后我們觀察了突變體的節(jié)段間血管(ISVs)的發(fā)育。圖3F顯示了野生型和ApoEb突變的幼魚在48 hpf內(nèi)的ISVs發(fā)育情況，突變體在30、36和48 hpf時(shí)ISVs明顯縮小。然而，在6 dpf內(nèi)，雖然48個(gè)hpf ApoEb突變體的ISV直徑縮短，但I(xiàn)SVs擴(kuò)散的時(shí)間和長度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3F)。這些結(jié)果表明，血管生成缺陷發(fā)生在ApoEb突變體的早期發(fā)育階段。
圖3 ApoEb突變體幼魚的發(fā)育和血管生成。(A)野生型和ApoEb突變體胚胎在3dpf時(shí)的形態(tài)。突出顯示的紅色和藍(lán)色長度分別用于描繪體長和卵黃延伸的大小。用綠色虛線圈出的面積計(jì)算卵黃面積。標(biāo)尺，200 μm。(B)野生型和ApoEb突變體之間的體長、卵黃面積或卵黃延伸沒有顯著差異。每組N = 12。(C和D)約40%的ApoEb突變體在3dpf時(shí)，在中腦和后腦可見腦出血(紅色三角形表示)。每組N = 9;標(biāo)尺，200 μm。(E)腦血管網(wǎng)絡(luò)的完整性受到明顯干擾。紅色三角形表示ApoEb突變體中大腦后靜脈(PCeVs)變窄，白色三角形表示原始后腦通道(PHBCs)缺失。比例尺:上200 μm、下150 μm。(F)顯示了fli1:EGFP背景的野生型和ApoEb突變體幼魚在48 hpf內(nèi)的體間血管(ISVs)的發(fā)育。注意ApoEb突變體在30,36和48hpf時(shí)的ISVs變窄。在6 dpf(每組n = 3)內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)上，野生型和ApoEb突變體之間ISVs的發(fā)芽時(shí)間和傳播長度無顯著差異(p = 0.168)。然而，ApoEb突變體在48hpf內(nèi)，ISV直徑縮短(p = 0.001)(每組n = 15)。比例尺:200 μm (24hpf)或50 μm(28,30,36和48hpf)。
HFD誘導(dǎo)的ApoEb突變體發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂
我們進(jìn)行了ORO染色、共聚焦成像和脂質(zhì)測(cè)量來測(cè)試ApoEb突變體是否發(fā)展為LMD。我們發(fā)現(xiàn)ApoEb突變體的卵黃囊和血管都有脂質(zhì)含量(補(bǔ)充圖2A)。脂質(zhì)沉積隨著發(fā)育逐漸減少，一直持續(xù)到6 dpf，表明卵黃囊的脂質(zhì)在這一階段已被消耗殆盡(補(bǔ)充圖2A)。與ND喂養(yǎng)1天相比，ND喂養(yǎng)2天的7dpf ApoEb突變體幼魚血管中出現(xiàn)輕微的ORO染色(補(bǔ)充圖2B)，表明循環(huán)中中性脂質(zhì)水平中度升高?？捎糜谙鄬?duì)量化血管內(nèi)ORO染色強(qiáng)度的IOD值證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)(補(bǔ)充圖2C)。飼養(yǎng)5天后，用ND喂養(yǎng)的10dpf幼魚的ORO染色顯示ApoEb突變體有明顯的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積(補(bǔ)充圖2D)。然而，在5天ND喂養(yǎng)的10dpf ApoEb突變體中，血管中積累的熒光標(biāo)記膽固醇酯(576/589-CE，數(shù)字表示激發(fā)/發(fā)射波長)并沒有顯示出顯著變化(補(bǔ)充圖2D和E)。有趣的是，ISVs早期的血管生成缺陷似乎在這一階段得到了糾正。換句話說，7dpf突變體的血管系統(tǒng)是正常的(補(bǔ)充圖2D)。然后，我們測(cè)試了2天的HFD喂養(yǎng)是否能夠在ApoEb突變體幼魚中誘導(dǎo)LMD。結(jié)果表明，接受2天HFD喂養(yǎng)的ApoEb突變體的表型更加穩(wěn)定(補(bǔ)充圖2F和G)。在接受5天HFD喂養(yǎng)的10 dpf ApoEb突變體中，通過ORO染色也可以觀察到更多的血管內(nèi)脂質(zhì)積累(圖4A和B)。即使只接受2天的HFD喂養(yǎng)，也可能導(dǎo)致7 dpf ApoEb突變體幼魚的576/589-CE沉積顯著增加(圖4A)。每段平均脂質(zhì)沉積的計(jì)算也驗(yàn)證了這一結(jié)果(圖4C)。
圖4 ApoEb突變體幼魚發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂。(A)經(jīng)5天高脂飼料(HFD)喂養(yǎng)的10dpf幼魚的油紅O (ORO)染色顯示ApoEb突變體有明顯的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積。將熒光標(biāo)記的膽固醇酯(576/589-CE，數(shù)字表示激發(fā)/發(fā)射波長)添加到HFD中，這樣可以看到7 dpf野生型和ApoEb突變體幼魚在喂食2天HFD后的血管脂質(zhì)沉積。DA，主動(dòng)脈背側(cè);PCV，后主靜脈;標(biāo)尺，200 μm。(B)通過積分光密度(IOD)定量(A)中的血管內(nèi)ORO染色強(qiáng)度。每組N = 15。(C)計(jì)算每節(jié)段平均脂質(zhì)沉積(每組n = 15)。(D)采用RT-qPCR方法檢測(cè)10dpf野生型和ApoEb突變體幼魚(每組15只，每組6只)飼喂5 天正?；蚋咧暳虾骃rebp-1和-2通路的表達(dá)情況。(E)飼喂5天高脂飼料提高了10dpf ApoEb突變體全身勻漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平不變。每個(gè)樣本共15個(gè)胚胎，每組n = 6。
為了弄清楚ApoEb敲除對(duì)Srebp通路的主要影響，我們?cè)?dpf禁食的野生型和ApoEb突變的幼魚中進(jìn)行了檢測(cè)(Supplementary Fig. 2H)，結(jié)果顯示了Ldlr的有趣上調(diào)。雖然2天的ND并沒有改變Srebp通路的表達(dá)，但2天的HFD喂養(yǎng)顯著激活了ApoEb突變體的兩條Srebp通路(補(bǔ)充圖2I)。這與飼養(yǎng)5 天的10dpf ApoEb突變體中Srebp-1和-2通路的表達(dá)一致，表明ND可能誘導(dǎo)Hmgcr上調(diào)，而HFD上調(diào)了所有這些基因的表達(dá)(圖4D)。8周HFD喂養(yǎng)ApoEb突變體的肝臟結(jié)果也是如此(補(bǔ)充圖2J)。此外，對(duì)7dpf幼魚的全身勻漿的脂質(zhì)測(cè)量顯示，喂食HFD 2天的ApoEb突變體的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平顯著升高，而喂食2天的ND也增加了ApoEb突變體的膽固醇水平(補(bǔ)充圖2K)。然而，連續(xù)5天的ND并沒有提高脂質(zhì)水平(補(bǔ)充圖2L)，而5天的HFD喂養(yǎng)增加了10dpf ApoEb突變體的全身勻漿中TC、TG、VLDL和LDL-C的水平，而HDL-C水平不變(圖4E)。
我們還研究了ApoEb缺乏對(duì)全身炎癥的影響。我們發(fā)現(xiàn)，在5天HFD喂養(yǎng)的10dpf ApoEb突變體中，IL-1β和TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào)，而IL-6的表達(dá)保持不變(Supplementary Fig. 2M)。此外，我們發(fā)現(xiàn)急性脂質(zhì)負(fù)荷如2天的高脂喂養(yǎng)可能導(dǎo)致ApoEb突變體Tg (ccl2: mCherry)幼魚心功能受損和心律失常。補(bǔ)充圖2N顯示，喂食HFD 2天后，ApoEb突變體表現(xiàn)出更高的心率，更低的心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)，更小的心臟面積以及更短的靜脈竇(SV) -動(dòng)脈球(BA)距離，這表明心跳受限。補(bǔ)充影像1和2顯示，與野生型相比，喂食2天HFD的7 dpf ApoEb突變體顯示了明顯的舒張延長和早搏。以上結(jié)果提示，高脂飼料可能導(dǎo)致ApoEb突變斑馬魚發(fā)生嚴(yán)重的LMD。
辛伐他汀、依折麥布和血脂康可顯著改善ApoEb突變體幼魚的脂代謝紊亂
為了評(píng)估ApoEb突變斑馬魚短期(2天)高脂飲食是否可用于藥物篩選實(shí)驗(yàn)，我們需要找到合適的陽性對(duì)照。我們測(cè)試了Hmgcr抑制劑和廣泛應(yīng)用的降脂藥物辛伐他汀(SIM)對(duì)血管內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響。首先，將5 dpf幼魚用2d的高脂飼料喂養(yǎng)，最后24 h時(shí)添加不同濃度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 μg/mL)的SIM。24h SIM處理的生存試驗(yàn)顯示，0.4 μg/mL SIM處理12 h時(shí)，幼魚存活率保持在較高水平(補(bǔ)充圖3A)。然而，24小時(shí)SIM處理具有相對(duì)較高的致死率(補(bǔ)充圖3A)，這與之前的報(bào)道一致，并且對(duì)斑馬魚幼魚具有顯著的致畸作用。當(dāng)處理24 h時(shí)，幼魚表現(xiàn)出2倍的慢觸誘發(fā)逃逸率(用于測(cè)量斑馬魚幼魚的身體運(yùn)動(dòng)能力和對(duì)外界刺激的反應(yīng)能力的參數(shù)，補(bǔ)充圖3B)，以及異常形態(tài)的發(fā)生率升高(補(bǔ)充圖3C和D，紅色三角形表示彎曲的尾巴)。在較長的藥物處理實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)之前的研究，我們測(cè)試了依折麥布(ezetimibe, EZE)，當(dāng)處理超過2d時(shí)，EZE比SIM更安全。結(jié)果表明，5 μM和10 μM EZE處理的幼魚5d內(nèi)存活率較高(補(bǔ)充圖3E和F)。血脂康(XZK)≤120 μg/mL處理的幼魚12h存活率較好(補(bǔ)充圖3E和F)， XZK處理5d的最佳濃度為30 μg/mL(補(bǔ)充圖3E)。
在此基礎(chǔ)上，我們測(cè)試了SIM、EZE和XZK的降脂效果。ORO染色表明，30 μg/mL XZK處理12h可以有效減少經(jīng)2天HFD喂養(yǎng)的7 dpf ApoEb突變體的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積，而10 μM依折麥布或0.4 μg/mL SIM處理更有效(圖5A和B)。我們還通過共聚焦成像直接檢測(cè)了血管內(nèi)脂質(zhì)沉積(圖5C)。與此一致，XZK處理組576/589-CE的血管沉積顯著減少，EZE和SIM處理組進(jìn)一步減少(圖5C和D)。在5d處理實(shí)驗(yàn)中，10 μM EZE和30 μg/mL XZK與DMSO組(0.5% DMSO處理)相比，均顯著降低組織中的脂質(zhì)水平，HDL-C水平升高(圖5E)。我們還檢測(cè)了EZE或XZK處理對(duì)10 dpf ApoEb突變體幼魚中Srebp-1和2通路表達(dá)的影響(圖5F)。結(jié)果表明，EZE可能激活兩條通路，而XZK主要上調(diào)Srebp-2通路，Hmgcr和Ldlr的表達(dá)增加(圖5F)。
圖5 辛伐他汀、依折麥布和血脂康可顯著改善ApoEb突變體幼魚的脂代謝紊亂。(A)7dpf ApoEb突變體幼魚喂2天HFD后，用0.5% (v/v) DMSO 、30 μg/mL血脂康、10 μM依折麥布或0.4 μg/mL辛伐他汀處理12 h，血管內(nèi)脂質(zhì)沉積的ORO染色。標(biāo)尺，100 μm。(B)定量數(shù)據(jù)顯示血脂康治療組血管內(nèi)脂質(zhì)堆積明顯減少，依折麥布和辛伐他汀治療組血管內(nèi)脂質(zhì)堆積進(jìn)一步減少。每組N = 15。(C和D)血管脂質(zhì)沉積的代表性圖像和定量數(shù)據(jù)。每組N = 14;標(biāo)尺，100 μm。(E)與0.5% DMSO組相比，10dpf ApoEb突變體幼魚在添加10 μM依折麥布或30 μg/mL血脂康的條件下，飼喂5d HFD后，其全身勻漿的脂質(zhì)測(cè)量結(jié)果顯示，總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著升高。每個(gè)樣本共15個(gè)胚胎，每組n = 6。(F)采用rt-qPCR方法檢測(cè)依折麥布和血脂康處理對(duì)經(jīng)5 d HFD喂養(yǎng)的10dpf ApoEb突變體幼魚Srebp-1和-2通路表達(dá)的影響(每組15只，n = 6)。
以上結(jié)果證明ApoEb突變體LMD模型可用于藥物篩選。SIM和EZE分別在處理12h和5d時(shí)可作為陽性對(duì)照。通過快速相對(duì)定量的方法，我們還發(fā)現(xiàn)XZK能夠通過降低斑馬魚的總TC、TG、VLDL和LDL-C水平，同時(shí)提高HDL-C水平來緩解LMD。
XZK對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂的影響
XZK處理的攜帶ApoEb突變的Tg (flk1:dsRed;lyz:EGFP)幼魚的ORO染色顯示，隨著XZK濃度的增加，血管內(nèi)脂質(zhì)沉積逐漸減少(補(bǔ)充圖4A和B，圖6A為代表性圖像)，這可以通過血管內(nèi)染色強(qiáng)度的量化來證實(shí)(圖6B)。這種降脂作用可能在XZK對(duì)高脂血癥的預(yù)防作用中起重要作用。為了證明該魚系中顯示綠色熒光的細(xì)胞是中性粒細(xì)胞而不是巨噬細(xì)胞，我們進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證(圖6C)。如圖6C所示，由Lyz啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP(綠色)與中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物Mpo(紅色)有明顯的共定位(黃色)，但與巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物MFAP4沒有共定位。這表明在魚系中表達(dá)EGFP的細(xì)胞確實(shí)是中性粒細(xì)胞。另一方面，熒光攝影顯示，HFD喂養(yǎng)2d后，軀干大血管周圍表達(dá)EGFP的中性粒細(xì)胞大量聚集(圖6D)。而XZK和SIM治療組，中性粒細(xì)胞主要集中在腸道，而不是血管(補(bǔ)圖4C-D，圖6D為代表性圖像)，并且隨著藥物濃度的增加，血管中積累的中性粒細(xì)胞減少(圖6E)。這些結(jié)果表明，XZK對(duì)中性粒細(xì)胞的聚集有抑制作用，這可能是XZK預(yù)防LMD作用的另一機(jī)制。為了評(píng)估XZK處理是否影響巨噬細(xì)胞募集，我們對(duì)10 dpf的ApoEb突變體進(jìn)行中性紅染色，并在5d的HFD中添加EZE (10 μM)和XZK (30 μg/mL)。結(jié)果顯示，兩者均能有效減少巨噬細(xì)胞的募集(圖6F和G)。此外，在添加0.5% DMSO (DMSO)、XZK或EZE的HFD中，10dpf幼魚的全身勻漿中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA含量測(cè)定顯示，EZE顯著誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的下調(diào)。XZK處理可降低IL-1β mRNA表達(dá)，但對(duì)TNF-α無明顯影響。IL-6不受XZK和EZE的影響(圖6H)。
圖6 血脂康預(yù)防脂質(zhì)代謝紊亂的作用可能有多種機(jī)制。(A)藥物治療12h后，與DMSO組(0.5% DMSO)相比，低濃度血脂康(XZK)治療組(36μg/mL, Lo-XZK)和高濃度XZK治療組(500μg/mL, Hi-XZK)的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積均顯著降低，與0.4μg/mL辛伐他汀(SIM)相當(dāng)。標(biāo)尺，100μm。(B)定量血管內(nèi)ORO染色強(qiáng)度證實(shí)了(A)的結(jié)果。每組N = 15。(C) lyz啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP(綠色)與中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物Mpo(上一行紅色)有明顯的共定位(黃色)，但與巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物MFAP4(下一行紅色)無共定位。標(biāo)尺，200 μm。(D)在DMSO組(7dpf ApoEb突變體幼魚喂食含0.5% DMSO的2d HFD)中，中性粒細(xì)胞大量聚集在樹干大血管周圍(綠色箭頭)。中性粒細(xì)胞大量聚集在軀干大血管周圍(綠色箭頭)。XZK高濃度治療組(500μg/mL, Hi-XZK)、XZK低濃度治療組(18 μg/mL, Lo-XZK)和辛伐他汀治療組(SIM)中，中性粒細(xì)胞主要集中于腸道(白色箭頭)而非主干血管。標(biāo)尺，200 μm。(E)主干血管中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，≥18μg/mL XZK處理顯著降低了中性粒細(xì)胞的募集數(shù)量，說明特定濃度的XZK對(duì)中性粒細(xì)胞的募集有抑制作用。Dmso, 0.5% Dmso;Lo-XZK, 18μg/mL血脂康;Hi-XZK, 500μg/mL血脂康;SIM, 0.4μg/mL辛伐他汀;每組N = 12。(F、G) 依折麥布(10μM)和血脂康(30 μg/mL)處理均能有效減少10dpf ApoEb突變體5 d HFD喂養(yǎng)的巨噬細(xì)胞募集。每組N = 9;標(biāo)尺，200 μm。(H) RT-qPCR檢測(cè)10dpf幼魚在添加0.5% DMSO (DMSO)、30μg/mL血脂康和10μM依折麥布5 d的飼料中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)。每個(gè)樣本共15只幼魚，每組n = 6。
討論
目前，ApoE基因敲除小鼠和Ldlr基因敲除小鼠補(bǔ)充HFD已成為動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥等LMDs的常規(guī)動(dòng)物模型。ApoE敲除小鼠血脂明顯升高，主動(dòng)脈壁有大量脂質(zhì)沉積，可在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。盡管ApoE和Ldlr突變小鼠的表型相似，但它們?cè)诎l(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的飲食需求、突出的脂蛋白和肝脂肪酶缺乏的影響方面存在差異。ApoE-/-小鼠模型的優(yōu)勢(shì)在于，在喂食正常低脂鼠糧的動(dòng)物中，復(fù)雜的血管病變很容易發(fā)生，而喂食高脂肪、高膽固醇的西式飲食可以顯著加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，這是建立Ldlr敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的必要條件。此外，載脂蛋白ApoE除直接參與脂質(zhì)代謝外，在動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程中還具有多種作用，如調(diào)節(jié)單核細(xì)胞活化和平滑肌細(xì)胞(SMC)的遷移和增殖、一氧化氮合酶(NOS)介導(dǎo)的血小板聚集等?？傊煌囊蛩乜赡茉贏poE和Ldlr敲除小鼠中分別表現(xiàn)出不同的功能。換句話說，ApoE和LDLR突變體不能相互替代。
在最近的一篇綜述中，Vedder等人寫道:“ApoE-/-斑馬魚的發(fā)展將為動(dòng)脈粥樣硬化研究創(chuàng)造一種新的工具，可以與小鼠模型進(jìn)行比較。”在本研究中，我們旨在建立斑馬魚中ApoEb功能缺失的LMD模型，ApoEb是在斑馬魚進(jìn)化過程中由ApoE的兩個(gè)亞功能化類似物之一編碼的。斑馬魚ApoEb基因的表達(dá)具有物種特異性，其具體功能和機(jī)制研究尚缺乏。一些研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的載脂蛋白e蛋白與哺乳動(dòng)物的載脂蛋白e蛋白具有相似的功能域和高度同源性。在接下來的研究中，我們假設(shè)斑馬魚ApoEb在哺乳動(dòng)物中扮演ApoE基因的角色，ApoEb突變魚系增加了斑馬魚脂質(zhì)異常模型集，包括ApoC2突變斑馬魚等。雖然已經(jīng)建立了這些突變的斑馬魚系，但ApoEb突變體與其他突變體之間存在各種生理和病理生理差異。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚ApoEb缺乏導(dǎo)致腦出血、腦血管網(wǎng)絡(luò)缺損和內(nèi)室狹窄。在脂質(zhì)負(fù)荷下，ApoEb突變體表現(xiàn)為早期心功能障礙和顯著的血管脂質(zhì)沉積。先前的研究報(bào)道了一種具有血管脂質(zhì)沉積積累的WT幼魚斑馬魚高膽固醇血癥模型，其建立需要2周的HCD喂養(yǎng)，以及具有相似表型的Ldlr功能喪失突變斑馬魚模型，該模型需要5天的HCD喂養(yǎng)。然而，根據(jù)特定的研究目的，例如中性粒細(xì)胞在急性脂質(zhì)負(fù)荷中的快速反應(yīng)，我們的新ApoEb突變體通過HFD喂養(yǎng)誘導(dǎo)血管脂質(zhì)積累的時(shí)間可以減少到48小時(shí)。此外，我們的ApoEb突變斑馬魚模型的建立不僅對(duì)LMDs的研究有價(jià)值，而且可以用于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和阿爾茨海默病等疾病的研究，以及細(xì)菌抗原免疫等先天免疫系統(tǒng)的研究。
在我們的研究結(jié)果中，禁食的5dpf ApoEb突變體顯示Ldlr表達(dá)增加，這表明Srebp-2途徑被激活，F(xiàn)asn表達(dá)減少，這表明Srebp-1途徑被抑制。通過攝食不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)量，我們證實(shí)了HFD攝食ApoEb突變體中Srebp-1和-2通路的激活，并一致地表達(dá)了Ldlr的上調(diào)。眾所周知，Ldlr是肝臟膽固醇攝取的介質(zhì)，主要由SREBP-2調(diào)節(jié)。當(dāng)肝細(xì)胞缺乏相對(duì)于其生理需要所需的膽固醇時(shí)，Ldlr的上調(diào)將通過由SREBP-2嚴(yán)格控制的負(fù)反饋機(jī)制介導(dǎo)。另一方面，F(xiàn)ASN是一種與脂肪酸合成直接相關(guān)的多功能蛋白，在哺乳動(dòng)物的從頭脂肪生成中起著至關(guān)重要的作用。值得注意的是，我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)的ApoEb突變體中Fasn的下調(diào)與Ldlr突變體中Fasn的上調(diào)形成鮮明對(duì)比。然而，其他Srebp基因，包括Hmgcr和Pcsk9，在禁食幼魚中沒有顯著變化。Srebp-1或Srebp-2對(duì)不同靶基因的調(diào)控方式不同，其潛在機(jī)制可能為膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因的差異靶向提供新的見解和新途徑，值得進(jìn)一步探索。
在12 h的藥物治療實(shí)驗(yàn)中，我們使用SIM來測(cè)試所建立的模型是否可以用于降脂藥物的篩選。SIM有效地阻止了HFD誘導(dǎo)的血管脂質(zhì)沉積的積累，并提高了血漿HDL-C水平，表明促進(jìn)了膽固醇逆向運(yùn)輸回肝臟。這些結(jié)果與之前的報(bào)道相反，SIM在WT斑馬魚中沒有明顯的降脂作用。這種差異可能是由于SIM治療引起的ApoEb功能障礙誘導(dǎo)的Srebp通路激活和HMGCR抑制的潛在耦合效應(yīng)，部分原因是由于不同給藥方法對(duì)SIM的吸收不同。值得注意的是，之前的研究報(bào)告了SIM對(duì)斑馬魚幼魚以及人類患者的骨骼肌毒性。與此一致，我們的研究結(jié)果在體內(nèi)證實(shí)了SIM的肌肉毒性，其特征是身體運(yùn)動(dòng)減少，對(duì)外部刺激反應(yīng)緩慢，異常形態(tài)增加(彎曲尾巴和脊柱側(cè)凸)。在為期5天的藥物治療實(shí)驗(yàn)中，以EZE作為安全有效的陽性對(duì)照與XZK進(jìn)行比較。我們的研究結(jié)果顯示，EZE顯著激活Srebp-2通路，上調(diào)Srebp-2及其下游基因Hmgcr、Pcsk9和Ldlr的表達(dá)，與之前在小鼠中的研究一致，XZK對(duì)Srebp-2通路也有類似的作用。這與小鼠研究不一致，我們發(fā)現(xiàn)EZE也上調(diào)Srebp-1的表達(dá)，而不影響其下游Fasn。在目前的研究中，脂肪酸合成是否被激活以及在哪里被激活還很難確定，值得進(jìn)一步探索。因此，我們認(rèn)為ApoEb突變體幼魚可以用于機(jī)制研究，也可以用于初始遺傳或藥物篩選，以確定新的治療靶點(diǎn)，以及它們的潛在危害。
我們還對(duì)ApoEb突變體及野生型斑馬魚的DA和PCV切片進(jìn)行了組織學(xué)染色(補(bǔ)充圖5)。在我們的觀察中，ApoEb突變體的血管中可以自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，主要是在PCV中。與以往研究一致，HFD喂養(yǎng)導(dǎo)致血管內(nèi)纖維組織大量染紅，導(dǎo)致血管狹窄，大部分病變隱藏在這些組織中。有趣的是，病變內(nèi)有巨大的空泡和大量吞噬細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤(胞質(zhì)呈紫色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，吞噬褐色壞死物質(zhì))，與哺乳動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化病變相似。
在動(dòng)脈粥樣硬化早期，中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮下大量募集，釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，引起局部炎癥反應(yīng)。中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入并吞噬氧化LDL (oxLDL)，形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)脂質(zhì)條紋的形成，進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞，加重動(dòng)脈粥樣硬化。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，在晚期動(dòng)脈粥樣硬化病變中，中性粒細(xì)胞的數(shù)量和活性與急性冠脈綜合征(ACS)、不穩(wěn)定病變破裂、血栓形成等心血管事件的發(fā)生率呈正相關(guān)。此前的一項(xiàng)研究報(bào)道，芥菜籽及其提取物等中藥可以抑制中性粒細(xì)胞的募集，發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到XZK治療后血管內(nèi)中性粒細(xì)胞募集明顯抑制，這表明XZK可能對(duì)中性粒細(xì)胞也有類似的抑制作用。這一觀察結(jié)果與最近有爭議的觀點(diǎn)是一致的，即骨髓細(xì)胞而不是巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)斑馬魚幼魚的早期動(dòng)脈粥樣硬化，即中性粒細(xì)胞。EZE治療5天后，血管內(nèi)巨噬細(xì)胞募集減少，與小鼠模型一致。與EZE一樣，XZK也表現(xiàn)出對(duì)巨噬細(xì)胞募集的抑制作用。此外，EZE和XZK均能顯著下調(diào)IL-1β的表達(dá)，而EZE單獨(dú)也能降低TNF-α的表達(dá)。
我們的研究有幾個(gè)局限性。首先，成年斑馬魚實(shí)驗(yàn)周期長，不適合進(jìn)行藥物篩選等大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。幼魚周期短，成本低，但體積小，器官發(fā)育尚處于早期階段，難以進(jìn)行血液檢測(cè)和切片。這可能是一個(gè)缺點(diǎn)，但容易的基因操作和幼魚的不透明性為研究早期動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制提供了機(jī)會(huì)。也許，隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，ApoEb缺失對(duì)斑馬魚幼魚白細(xì)胞積累和動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的附加作用將在未來得到進(jìn)一步闡明。其次，不可能準(zhǔn)確地量化每只幼魚的攝食、消耗和排泄。在實(shí)驗(yàn)中，我們定期在顯微鏡下觀察幼魚的發(fā)育和攝食情況，并及時(shí)拋棄不健康或不攝食的幼魚，但仍不能完全消除個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。第三，敲除ApoEb是否會(huì)導(dǎo)致其他與脂質(zhì)代謝相關(guān)的病理后果尚不清楚，需要進(jìn)一步觀察。
結(jié)論
綜上所述，我們介紹了一種新的LMD遺傳模型。ApoEb突變斑馬魚幼魚經(jīng)短期高脂飲食喂養(yǎng)后，血管內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯且持續(xù)。我們認(rèn)為，這一新的模型可能為高脂血癥、FH等LMDs的病理生理和治療靶點(diǎn)篩選研究，以及新型降脂藥物的藥理和毒理學(xué)研究開辟另一條道路。
基金：這項(xiàng)研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20119yfa0802700)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(92168206)的支持。
原文：Hu Y X, You H M, Zhu R F, et al. Establishment of a lipid metabolism disorder model in ApoEb mutant zebrafish[J]. Atherosclerosis, 2022, 361: 18-29.
原文地址：https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2022.10.008
注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。
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