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【文獻解讀】MicroRNA-27b消耗增強斑馬魚體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累，誘導脂肪細胞增生

來源:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29286302/ | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時間: 2023-11-04 | 746 次瀏覽 | 分享到:

miR-27b已成為膽固醇和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)樞紐，并成為治療動脈粥樣硬化和肥胖的潛在治療靶點。然而，miR-27b對體內(nèi)脂質(zhì)水平的影響仍有待確定。斑馬魚的脂質(zhì)通常以三?；视停═Gs）的形式儲存，它們的主要儲存部位是內(nèi)臟、肌肉內(nèi)和皮下的脂質(zhì)庫，而不是血管和肝臟。在本研究中，我們應用microRNA-海綿（miR-SP）技術(shù)，生成表達轉(zhuǎn)基因miR-27b-SP（C27bSPs）的斑馬魚，該基因破壞內(nèi)源性miR-27b活性，誘導血管內(nèi)脂質(zhì)積累（高脂血癥）和非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的早期發(fā)病。C27bSPs幼魚和幼魚的血管和肝臟中油性紅O染色明顯增加，表明miR-27b消耗在功能上促進了脂質(zhì)積累。C27bsp也顯示出脂肪墊的增加，這是由于脂肪細胞增生。分子分析顯示，miR-27b的缺失增加了與脂肪生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)的基因的表達。此外，miR-27b-SP增加了過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBP-α和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1c（SREBP-1c）的表達，并有助于脂肪生成和脂肪生成。結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明，miR-27b-SP通過直接增加多種成脂/成脂轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而導致脂肪生成和脂肪生成的增加。在本研究中，miR-27b的表達改善了C27bSP的脂質(zhì)代謝，提示miR-27b是調(diào)節(jié)斑馬魚早期高脂血癥和脂肪形成的重要脂肪生成因子。

雜志：International Journal of Molecular Sciences

影響因子：5.6（2022）

年份：2017

通訊作者：Kun-Yun Yeh , Guor Mour Her

通訊作者單位：Division of Hemato-Oncology, Department of Internal Medicine, Chang-Chung Memorial Hospital, Keelung 204, Taiwan;

Department of Bioscience and Biotechnology, National Taiwan Ocean University, Keelung 202, Taiwan; c.y.stephen.lai@gmail.com (C.-Y.L.); 10236012@ntou.edu.tw (C.-Y.L.).

摘要

關(guān)鍵詞：microRNA海綿、脂肪細胞發(fā)生、脂肪形成、肝脂肪變性、非酒精性脂肪肝。

前言

除了經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄監(jiān)管機構(gòu)，microRNAs（miRs）已被證明參與幾乎所有代謝穩(wěn)態(tài)過程，包括脂肪細胞發(fā)生，脂肪生成和葡萄糖刺激胰島素分泌，以影響參與非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）發(fā)病機制的代謝途徑。最近的研究表明，miRs能夠調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因的表達，包括miR-122、miR-33、miR-106、miR-758、miR-26、miR-370、miR-378、let-7、miR-27、miR-143、miR-34a和miR-335。一些miRs已被證明可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，這可能參與了NAFLD的發(fā)病機制。因此，某些miRs可能參與了代謝性疾病的發(fā)病機制。Karbiener等人證實在人脂肪來源的干細胞（hMADS）細胞的脂肪形成過程中，miR-27b水平下降，miR-27b的過表達抑制了在脂肪形成和后期甘油三酯積累的早期開始階段PPAR-γ和CCAAT增強子結(jié)合蛋白-α（C/EBP-α）的表達。PPAR-γ在其30 UTR中有一個高度保守的預測結(jié)合位點，并被證實為miR-27b的直接靶點。Kang等人發(fā)現(xiàn)，miR-27是一種抗成脂的microRNA，部分原因是通過靶向抑制素（PHB）和損害線粒體功能。Kang等在研究中發(fā)現(xiàn)，在誘導hMADS成脂后，miR-27a和miR-27b的水平均下調(diào)，而miR-27a或miR-27b的過表達抑制了PHB的表達和脂肪細胞分化。此外，Kong等人證實，miR-27b在糖皮質(zhì)激素（GC）誘導的中心脂肪積累的發(fā)病機制中起著核心作用。過表達miR-27b抑制了棕色脂肪的分化和原代脂肪細胞的能量消耗。相反，抑制miR-27b的功能會下調(diào)棕色脂肪組織中特定基因的表達。此外，Vickers等人在硅、體外和體內(nèi)提供了證據(jù)，表明miR-27b是脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)樞紐的一個強有力的候選者。他們證明，肝臟miR-27b對脂質(zhì)水平有反應，并調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝基因的表達（mRNA和蛋白），包括血管生成素樣3（ANGPTL3）和甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶1（GPAM），這些基因此前與脂質(zhì)相關(guān)疾病的病理生物學有關(guān)。盡管有這些觀察結(jié)果，但迄今為止，還沒有關(guān)于miR-27b對體內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響的報道。

許多研究已經(jīng)證明了斑馬魚和人類的脂質(zhì)代謝之間的同源性。事實上，斑馬魚最近已經(jīng)成為研究NAFLD的重要模式生物。我們之前的研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白、強定蛋白、陰陽1（YY1）和大麻素受體1（CB1R）通過增加成年斑馬魚脂肪生成基因表達的轉(zhuǎn)錄活性來誘導肝脂肪變性的發(fā)展。分子分析顯示，過表達錨定蛋白誘導肝臟脂肪變性，并調(diào)節(jié)四種肝臟microrna，miR-16、miR-27b、miR-122和miR-126的表達譜。在本研究中，我們報道了YY1通過下調(diào)C/EBP同源蛋白10（CHOP-10）與肝臟脂質(zhì)積累的關(guān)系，該蛋白抑制了斑馬魚幼魚和成魚脂肪生成程序中PPAR-γ和C/EBP-α的表達。

本研究旨在探討miR-27b缺失對斑馬魚幼魚和成魚脂質(zhì)代謝的影響。我們生成了microRNA-海綿（miR-SP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚（C27bSP），以分析miR-27b消耗對脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響。在本研究中，我們描述了miR-27b在27bSP和野生型斑馬魚的脂質(zhì)代謝中的作用。我們確定了miR-27b缺失對斑馬魚脂肪生成和脂肪生成通路調(diào)控的影響。過度抑制miR-27b的表達與高脂血癥、NAFLD（或NASH）和肥胖表型相關(guān)。這項工作的結(jié)果首次揭示了miR-27b可以調(diào)節(jié)與斑馬魚脂肪代謝紊亂相關(guān)的分子病理信號通路。

結(jié)果

miR-27b海綿功能的設(shè)計與測試

成熟的miR-27b序列在許多物種中都是完全保守的，在5’端有一個相同的種子序列（圖1A）。為了研究內(nèi)源性miR-27b在斑馬魚中的功能，我們設(shè)計了一種含有10個miR-27b結(jié)合位點的miR-27b海綿，以及4個與miRNA核苷酸9-12不匹配的核苷酸間隔物，以阻斷miR-27b的抑制活性(圖1B)。為了評估海綿結(jié)構(gòu)在體內(nèi)和體外的抑制活性，我們評估了海綿產(chǎn)物對miR-27b的隔離是否會破壞miRNA-27b與靶mRNA 3’UTR內(nèi)的靶位點的結(jié)合。因此，我們使用熒光素酶報告基因pb-Act-eGFP-mir-27b-TS和一個載體進行了eGFP報告基因分析，其中eGFP 的3’UTR mRNA包含miR-27b的完美靶序列。

我們檢測了miR-27b簇海綿元件（miR-27b-SP）的表達，以評估其在體內(nèi)發(fā)揮作用以降低miR-27b表達的能力。在體內(nèi)和體外都進行了eGFP報告基因檢測，以確認miR-27b-SP和miR-27b靶向序列（miR-27b-TS）的直接相互作用。在體外實驗中，與對照GFP (TS-mut或SP-mut)相比，miR-27b-SP過表達以一致的方式挽救了miR-27b-TS的GFP強度降低(圖1C)。相應地，體內(nèi)實驗表明，與對照組相比，miR-Act-EGFP-miR-27b-TS/miR-27b共表達降低的eGFP熒光強度可以以miR-27b-27b劑量依賴的方式挽救（圖1D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，miR-27b-SP可以特異性抑制miR-27b的表達，并通過消除miR-27b的表達來隔離miR-27b在其靶基因上的活性。

圖1 miR-27b-海綿（miR27b-SP）的設(shè)計和驗證。（A）序列比對表明成熟miR-27b在許多物種中都是完全保守的，包括樹棲蜥蜴（aca-miR-27b）、田鼠（cgr-miR-27b）、家山羊（chi-miR-27b）、斑馬魚（dre-miR-27b）、紅原雞（gga-miR-27b）、人（hsa-miR-27b）、灰色短尾負鼠（mdo-miR-27b）、恒河猴（mml-miR-27b）、小鼠（mmu-miR-27b）、鴨嘴獸（oan-miR-27b）、眼鏡蛇（oha-miR-27b）、七鰓鰻（pma-miR-27b）、大鼠（rno-miR-27b）、大西洋鮭魚（ssa-miR-27b)、野豬（ssc-miR-27b）和中國樹鼩（tch-miR-27b)。（B）將pri-miR-27b和miR27b-SP轉(zhuǎn)化為b-Act表達載體。premiR-27b莖環(huán)結(jié)構(gòu)顯示，其中成熟的miR-27b用紅色突出顯示。(C)采用體外EGFP報告基因分析來確認miR-27b與靶序列之間的直接相互作用。用b-Act-miR-27b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ZFL、ZEM2S和SOB-15細胞，并測定EGFP強度。* p < 0.01，和** p < 0.005。(D)采用體內(nèi)EGFP報告基因分析，證實了miR-27b在受精后6天內(nèi)的miR-27b與目標序列之間的直接相互作用。

轉(zhuǎn)基因C27bSPs（bC27bSP1、2和hC27bSP1、2）斑馬魚品系的生成

為了在斑馬魚中產(chǎn)生穩(wěn)定的mcherry融合miR-27b-SP表達，我們使用pb-Act-mCherry-miR-27b-SP和LF2.8-mCherry-miR-27b-SP構(gòu)建物來產(chǎn)生傳遞生殖系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚株系C27bSPs（圖2A）。通過pb-Act-mCherry-miR-27b-SP構(gòu)建，生成了斑馬魚轉(zhuǎn)基因株系bC27bSPs（Tg（-2.5β-Act：mCherry-miR-27b-SP）），其中miR-27b的表達被全局消除（圖2B，面板1,2）。利用LF2.8-mCherry-miR-27b-SP構(gòu)建，我們生成了斑馬魚轉(zhuǎn)基因株系hC27bSPs（Tg（-2.8fabp10a：mCherry-miR-27b-SP）），其中miR-27b在肝臟中被特異性消除（圖2B，面板3,4）。

我們采用莖環(huán)RT-PCR方法檢測成熟miR-27b在bC27bsp和hC27bsp中的表達水平。根據(jù)miR-27b的表達，選擇2個bC27bSP（bC27bSP1和bC27bSP2）和2個hC27bSP（hC27bSP1和hC27bSP2）轉(zhuǎn)基因株系（圖2C）。與野生型對照相比，miR-27b在hC27bSP1和hC27bSP2細胞系的肝臟中分別顯著下調(diào)了15.4倍和7.8倍。此外，我們還證明，與野生型（WT）相比，肝臟過表達miR-27b-SP并沒有改變hC27bsp中其他組織中內(nèi)源性成熟miR-27b的水平（圖2C）。在bC27bSP1和bC27bSP2細胞系的肝臟中，肝臟成熟的miR-27b分別減少了近3.8倍和2.9倍。然而，與WT相比，bC27bSPs中其他組織的成熟miR-27b水平顯著降低（圖2C）。結(jié)果表明，miR-27b-SP能夠阻斷體內(nèi)miR-27b的表達。

圖2 miR27b-SP轉(zhuǎn)基因斑馬魚產(chǎn)生。(A)將pri-miR-27b和miR27b-SP克隆到LF2.8或b-Act表達載體中。(B)miR27b-SP在bC27bSP1全身表達的紅色熒光圖像（面板1,9 dpf，40×放大，比例尺200μm；面板2，受精后4個月（mpf），40×放大，比例尺100 mm）和hC27bSP1肝臟（3,9 dpf；4,4 mpf，40×放大，比例尺：100 mm）。(C)對bC7asp（bC27bSP1、2）和hC7asp（hC27bSP1、2）、肝臟、心臟、腸道、大腦、眼睛、脂肪和肌肉組織成熟miR-27b的莖環(huán)RT-qPCR分析。每組均為n=5-8。* p < 0.01，和** p < 0.005。

抑制內(nèi)源性miR-27b可增加體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累

為了檢測hC27bSPs、bC27bSPs和WT幼魚之間的中性脂質(zhì)，我們對受精后10d（dpf）幼魚進行了油紅O染色（圖3）。在WT幼魚中沒有檢測到油紅O信號（圖3A、A’、A’’），盡管它確實對膀胱進行了非特異性染色（圖3A’）。hC27bSPs的幼魚僅在肝臟中表現(xiàn)出強烈的染色（圖3B、B’、C、C’）。飼喂高脂飲食（HFD）的bC27bSPs幼魚在肝臟（圖3D’、E’）、大腦和心臟（圖3D’、E’）中均有中度染色，在血管系統(tǒng)中也有額外的染色，包括后主脈、背主動脈和節(jié)段間血管（圖3D’’、E’’）。

重要的是，hC27bSPs中的體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累（78?86%）和肝臟脂質(zhì)積累（77?81%）的發(fā)生率要高得多，而WT幼魚中肝臟脂質(zhì)積累僅為1.4?5.3%，血管內(nèi)脂質(zhì)積累為4.4%（圖3F）。這些數(shù)據(jù)表明，miR-27b的消耗可誘導斑馬魚幼魚的體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累。

圖3 通過Oil Red O（ORO）染色，miR27b-SP對hC27bsp和bC7aSPs肝臟和血管內(nèi)脂質(zhì)的影響。（A-E）用高脂飼料（HFD）喂養(yǎng)的代表性幼魚的全貼裝ORO染色的側(cè)視圖（40×放大，比例尺：200μm）。軀干和后部的放大顯示在面板0和00（110×放大，比例尺：100μm）。(F)通過ORO染色計算hC27bSPs和bC27bSPs幼魚中脂肪變性和血管內(nèi)脂質(zhì)的百分比。ORO染色重復進行三次，平均每組60-80只幼魚。星號表示差異有統(tǒng)計學意義；* p < 0.01，** p < 0.005?？s寫：e、眼、背主動脈、視網(wǎng)膜，背縱向吻合血管、心臟、腸、節(jié)段間血管、PCV，后主靜脈，膀胱，卵黃囊。

miR-27b缺失增加了C27bsp中與脂肪生成相關(guān)的基因的表達

由于miR-27b缺失可誘導斑馬魚的內(nèi)營養(yǎng)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累和肝脂肪變性，我們接下來研究了miR-27b缺失對脂肪生成和未折疊蛋白反應（UPR）靶基因表達的影響。和對照組相比脂肪酸（FA）膜轉(zhuǎn)運體的mRNA水平顯著上調(diào)，包括脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（FATPs），如slc25a10和slc35b4，脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）如bC27bSPs和hC27bSPs中的FABP6和脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT/CD36（圖4A)。脂質(zhì)存儲基因的mRNA水平升高，包括ACAT-2、LDL受體LDLR和LPIN1（圖4B）。許多參與肝臟脂肪生成的基因受到甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1c（SREBP-1c）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）和CCAAT增強子結(jié)合蛋白-α（C/EBP-α），它們被發(fā)現(xiàn)上調(diào)（圖4C）。參與脂肪酸合成的關(guān)鍵脂肪生成酶的mRNA水平顯著升高，包括乙酰輔酶a羧化酶1（ACC1）、脂肪酸合酶（FAS）、A酰基輔酶A合酶（ACS）、?；o酶a：?；D(zhuǎn)移酶1-酰基甘油-sn-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（AGAPT）、磷脂酸磷酸酶（PAP）和二酰基甘油O-?；D(zhuǎn)移酶2（DGAT2）（圖4D）。與對照組（WT和WT-liver）相比，所有標記物在bC27?和hC27?的肝臟中均顯著且高上調(diào)。這些結(jié)果表明，bC27bsp和hC27bsp中的脂質(zhì)積累是脂質(zhì)生物發(fā)生相關(guān)基因上調(diào)的結(jié)果。

圖4 對bC27bSPs幼魚和hC27bSPs幼魚肝臟中選定的成脂基因的RT-qPCR分析。C27bSPs中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(A)脂質(zhì)儲存(B)、脂肪生成因子(C)和脂肪生成酶(D)基因的相對mRNA表達量與野生型魚的基因表達量相比較。qRT-PCR進行三次重復。用每組平均4個月雄雌魚的cDNA對所選基因進行表達分析。數(shù)值與β-actin進行歸一化處理。星號表示差異有統(tǒng)計學意義；與對照組相比，* p < 0 .01，** p < 0.005水平。

hC27bSP成魚發(fā)展為NAFLD并最終發(fā)展為NASH

我們懷疑C27bSPs幼魚（<60 dpf）在早期出現(xiàn)NAFLD表型。與預期的一樣，飼喂低脂飲食（LFD）的C27bSPs幼魚（21 dpf）出現(xiàn)了明顯的肝臟脂肪變性，而飼喂相同飲食的WT幼魚沒有出現(xiàn)脂質(zhì)沉積（圖5A，面板1?5）。組織學分析顯示，WT中均勻的肝竇和肝細胞顯示完好的細胞質(zhì)和明顯的細胞核（圖5A，圖6），幼年C27bsp的肝臟切片顯示肝細胞質(zhì)中有不同程度的空泡化（圖5A，圖7?10）。宏觀上看，WT成年肝臟在受精后4.5個月（mpf）顏色正常、柔軟和樂觀（圖5A，面板11），而大約80%的4.5 mpf C27bsp魚顯示黃色和油膩的肝臟，這是典型的斑馬魚脂肪肝（圖5A，面板12?15）。Oil Red O染色進一步證實了脂肪肝結(jié)果，結(jié)果顯示，與成年WT相比，成年c27bps的肝組織中有囊泡狀脂肪變性和大量脂滴（圖5A，圖17?20）（圖5A，圖16）。此外，我們還觀察到肝脂質(zhì)（與WT相比，hC27bSP1、hC27bSP2、bC27bSP1和bC27bSP2的含量分別為5.8-、4.9-、3.2-和2.8倍）和膽固醇與WT相比，hC27bSP1、hC27bSP2、bC27bSP1和bC27bSP2的含量分別為3.1-、2.6-、2.1-和1.8倍）顯著增加（圖5B)。然而，與hC27bsp和WT相比，bC27bsp的血脂和膽固醇水平僅稍微升高（圖5B）。

在成年hC27bsp（年齡大于10 mpf）中，肝細胞內(nèi)的慢性脂質(zhì)積累進一步引發(fā)了肝細胞損傷和肝應激，這與之前觀察到的NASH樣表型一致（圖5C，面板3?6），并與WT進行了比較（圖5C，面板1、2）。我們發(fā)現(xiàn)，氧化應激顯著增加了hC27bSPs和bC27bSPs中肝臟MDA和過氧化氫的釋放；然而，在喂食LFD的WT肝臟中沒有或更少觀察到氧化應激的影響（圖5D），表明miR-27b消耗可以顯著增強斑馬魚肝臟的氧化應激。此外，對hC27bSP2 NASH肝臟的分子分析顯示，參與NASH發(fā)育的基因表達上調(diào)。與預期的一樣，與WT相比，hC27bSPs成魚炎癥基因il-1b、il-6、tnf-α、ifn-γ、nfkb2和nf-kb的表達增加（圖5E）。此外，hC7aSPs成魚還表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應激標志物atf6、ern2、ire1、prek、hspa5和ddit3的上調(diào)（圖5E）。這些結(jié)果表明，hC27bsp成人發(fā)生了NAFLD和NASH，這是由于肝臟中脂肪的積累，并伴隨著隨后的炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路的激活。

圖5 在hC27bsp和bC27bsp成人中觀察到NAFLD和NASH表型。(A)不同喂養(yǎng)量和脂質(zhì)含量下C27bSPs幼魚的肝臟組織學變化。用低脂飼料（LFD）喂養(yǎng)的C27bSPs幼魚肝臟中WT（圖1）、hC7aSPs（圖2和3）和bC7aSPs（圖4和5）的ORO染色。110倍放大，比例尺：100μm。用LFD喂養(yǎng)WT（圖6）、hC7aSPs（圖7和圖8）和bC7aSPs（圖9和圖10）的斑馬魚幼魚肝臟的組織學變化，400×放大，比例尺：10μm。4個月大的WT（11）、hC7aSP（12和13）和bC7aSP（14和15）成人肝臟的代表性大體解剖。40×的放大倍數(shù)，比例尺：50毫米。通過成年WT（16）、hC7aSP（17和18）和bC7aSP（19和20）的oro染色切片證實了脂質(zhì)積累。400×的放大倍數(shù)，比例尺：25μm。(B)11個月大的hC27bsp和bC27bsp成人的脂質(zhì)含量（肝臟和血清甘油三酯和膽固醇）的比較。（每組n=4-6）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(C)11個月大的WT(1)、hC27bSP1(3)和hC27bSP2(5)肝臟的代表性大體解剖圖像。40×的放大倍數(shù)，比例尺：50毫米。對11個月大的WT(2)、hC7aSP1(4)和hC7aSP2(6)肝臟進行H&E染色，顯示與WT相比，hC27bSPs誘導肝臟應激和損傷。400×的放大倍數(shù)，比例尺：50μm。將肝臟線粒體中MDA和過氧化氫的(D)水平與hC27、WT成人bC27和過氧化氫水平進行比較。(E)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應激標志物atf6、ern2、ire1、prek、hspa5、grp78和ddit3（上升）和炎癥基因il-1b、il-6、tnf-α、ifn-γ、nfkb2和NF-kB的表達增加（下降）。qrt-pcr一式3份。用每組平均4個月雄雌魚的cDNA對所選基因進行表達分析。數(shù)值與β-actin進行歸一化處理。星號表示具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，* p < 0 .01，** p < 0.005水平。

miR-27b缺失可誘導斑馬魚早期發(fā)生脂肪細胞增生

為了評估m(xù)iR-27b在斑馬魚早期脂肪形成中的重要性，我們分析了同一階段飼喂LFD或HFD的bC27bSPs和WT幼魚（圖6A，B）。與野生型相比，在幼魚發(fā)育過程中，bc27bsp7魚體重和長度均顯著增加（圖6C，D）。此外，我們還比較了在24 dpf時油紅o染色的內(nèi)臟脂肪細胞的大小。我們檢測到，與野生型斑馬魚相比，bC27bSPs中內(nèi)臟脂肪細胞的質(zhì)量增加了（圖6E），而含有內(nèi)臟脂肪細胞增生的斑馬魚幼魚的百分比也增加了（圖6F）。因此，miR-27b缺失導致斑馬魚幼魚內(nèi)臟脂肪細胞增生，暗示miR-27b表達對斑馬魚胚胎后生長和幼魚脂肪細胞形成的影響。

圖6 miR-27b缺失導致bC27bSPs幼魚生長和脂肪細胞形成的增強。(A)bC7aSPs和WT幼魚的代表性圖像，喂養(yǎng)HFD和(B)喂養(yǎng)LFD，40×放大，比例尺：200μm。(C)飼喂LFD或HFD的bC27bSPs和WT幼魚的平均體重（每組n=為40-50）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(D)飼喂LFD或HFD的bC27bsp和WT幼魚的平均體長（每組n=為40-50）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(E)與WT對照組相比，在24 dpf時，bC27bSPs中的oro染色的內(nèi)臟脂肪細胞。內(nèi)臟脂肪細胞被圈起來。110×的放大倍數(shù)，比例尺：200μm。(F)含有內(nèi)臟脂肪細胞增生的bC27bsp和WT幼魚的百分比（每組n=40-50）。* p < 0.01，和** p < 0.005。

成年bC27bsp體積大，白色脂肪組織質(zhì)量增加

為了確定miR-27b缺失是否可能在脂肪組織中具有功能相關(guān)性，我們檢測了成年bC27bsp白色脂肪組織（WAT）表型，發(fā)現(xiàn)它們對肥胖或超重有肥大反應。在四個月的時間里，我們發(fā)現(xiàn)bC27bsp對被喂食HFD有顯著的尖銳反應。與生長曲線一致，bC27bSPs成魚的體重在5個月內(nèi)顯著增加（圖7A）。比喂食HFD的bC27bSP1成魚豐滿且更大（圖7B）。從大體觀察(圖7C，左)、內(nèi)臟大小(圖7C，中)和脂肪庫外植體(圖7C，右)可以看出，飲食引起的體重增加伴隨著脂肪積累的顯著增加。此外，我們還研究了miR-27b-SP是否能調(diào)節(jié)伴隨脂肪形成的bC27bsp的WAT中的肥大。肥大的WAT伴隨著成脂轉(zhuǎn)錄因子的表達增加，包括PPAR-γ、C/EBP-α和SREBP-1c（圖7D）。這些結(jié)果表明，miR-27b的缺失通過上調(diào)參與脂肪形成的成脂轉(zhuǎn)錄因子，加速了斑馬魚的脂肪細胞分化。

圖7 miR-27b消耗誘導成人bC7aSPs的體重增加和脂肪質(zhì)量增加。(A) bC27bSPs、hC27bSPs和WT用HFD喂養(yǎng)210天。每月監(jiān)測每只斑馬魚的連續(xù)體重（n=20-25）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(B)男性和女性bC27bSP1和WT喂養(yǎng)HFD 5個月的代表性圖像。(C) miR-27b消耗導致更大的腹部脂肪（左），更大的內(nèi)臟器官（中）和腹部脂肪墊大小的增加（右）。脂肪組織被圈起來。40×放大，比例尺：25mm(D)，WT和bC27bSP1腹部脂肪中成脂基因和蛋白的表達。PPAR-γ、C/EBP-β和SREBP-25pxRNA（左，qRT-PCR）和蛋白質(zhì)（右，免疫印跡）。* p < 0.01，和** p < 0.05。

討論

microRNA miR-27b參與了許多代謝過程，這些代謝過程與多種疾病有關(guān)，包括脂質(zhì)代謝、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗和2型糖尿病。盡管其重要，但很少有功能驗證的相關(guān)代謝模型，也缺乏體內(nèi)研究。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-27b在斑馬魚的脂肪細胞發(fā)生和脂肪生成中均具有負調(diào)控因子。我們報道了一個新的發(fā)現(xiàn)，即miR-27b缺失導致內(nèi)營養(yǎng)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累和高脂血癥，以及幾種脂肪生成標志物基因的表達增加。在斑馬魚。最近的報道已經(jīng)確定miR-27b是脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)樞紐，并有許多證實。Vickers等人預測miR-27b是脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)樞紐。他們證明，肝臟miR-27b對脂質(zhì)水平敏感，并調(diào)節(jié)兩個關(guān)鍵代謝基因的表達，血管生成素樣3（ANGPTL3）和甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶1（GPAM），這兩個基因之前已經(jīng)涉及到血脂異常病理。此外，我們還發(fā)現(xiàn)C27bSPs中的脂質(zhì)積累是由于參與FFA合成途徑的基因上調(diào)，導致后來的發(fā)病率伴隨不同水平的肝脂肪變性。我們的研究結(jié)果表明，miR-27b在體內(nèi)表達的脂質(zhì)代謝途徑平行，而在哺乳動物和斑馬魚中，miR-27b介導的調(diào)控的脂質(zhì)代謝具有很強的相似性。

為了更清楚地定義內(nèi)源性miR-27b在肝臟反應中的生理作用，我們建立了一個肝臟特異性的miR-27b-SP轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，hC27bSPs。值得注意的是，hC27bSPs在幼魚期發(fā)生生理NAFLD，在成魚期發(fā)生NASH。我們的研究結(jié)果與最近的一項研究一致，表明抑制miR-27b可以恢復大鼠肝星狀細胞（HSCs）中的細胞質(zhì)脂滴。Vickers等人報道，miR-27b被特異性發(fā)現(xiàn)參與肝臟中的脂質(zhì)代謝，并發(fā)現(xiàn)與正常小鼠肝臟相比，miR-27b在HFD肝臟中顯著增加。他們將miR-27b模擬物或抑制劑（antagomiRs）引入人肝細胞（Huh7細胞）。miR-27b模擬物的過表達導致4個脂肪生成基因PPAR- γ、ANGPTL3、N-去乙?；?磺基轉(zhuǎn)移酶1（NDST1）和GPAM的表達顯著增加，而內(nèi)源性miR-27b的抑制顯著上調(diào)了相同的4個基因。Vacaru等人，證明斑馬魚肝脂肪變性與UPR激活的標志物相關(guān)，而強大的UPR誘導脂肪變性。此外，一種miR-27a/b抑制劑顯著增加了促炎因子產(chǎn)生，如IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α。相反，用miR-27a/b模擬物處理細胞后，炎癥反應降低。相應地，我們提供了證據(jù)，表明肝臟中miR-27b的消耗導致了肝臟脂肪變性和脂肪變性，甚至脂肪性肝炎的發(fā)展，這對炎癥反應和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有進一步的聯(lián)合作用。

一些miRNAs，包括miR-27，已經(jīng)參與了加速或抑制前脂肪細胞分化的過程。最近，來自三個研究小組的研究結(jié)果表明，miR-27b是脂肪細胞分化的負調(diào)控因子。Zou等報道，柿子單寧在脂肪形成早期通過調(diào)控PPAR-γ、C/EBP-α和miR-27來抑制3T3-L1細胞的脂肪細胞分化。Karbiener等人發(fā)現(xiàn)，miR-27b在hMADS細胞中的抗成脂作用是由于抑制了PPAR-γ所致。Kang等人證實，miR-27a和b通過靶向PHB和損害hMADS細胞中的線粒體生物發(fā)生和功能來抑制脂肪形成。研究表明，miR-27b消耗對HFD誘導的脂肪細胞增生敏感，這至少部分解釋了bC27bSPs的體重增加或肥胖，表明bC27bSPs可作為早發(fā)性體重增加的模型。bC27bsp在幼魚期生長迅速（10?21dpf），導致幼魚期體重和長度增加。體重增加可能是早期生命脂質(zhì)積累引起的生長“超前”的結(jié)果，可能與脂質(zhì)代謝損傷和能量消耗不足狀態(tài)有關(guān)，從而影響斑馬魚胚胎后的生長。

根據(jù)外觀和脂肪庫的檢查，與對照組相比，幼魚bC27bSPs的脂肪量略有增加，而bC27bSPs的年輕成魚的脂肪量顯著增加。這種效應在成人中顯著增加的事實表明，bC27bsp對與年齡相關(guān)的體重增加很敏感。此外，我們的研究結(jié)果表明，bC27bsp中脂肪質(zhì)量的增加是由細胞數(shù)量的增加（脂肪細胞的增生）引起的。相應地，miR-27抑制脂肪細胞分化，這與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。miR-27b在大鼠、小鼠和人類細胞模型中作為脂肪形成的負調(diào)控因子。Chan等人報道，人參皂苷-Rb1可以下調(diào)miR-27b的活性，進而促進PPAR-γ的表達和脂肪的形成。然而，miR-27b已被發(fā)現(xiàn)能促進脂肪的形成。Kong等人發(fā)現(xiàn)，miR-27b是Prdm16的中心上游調(diào)控因子，可以控制WAT的褐變。白色脂肪的“布朗寧”已經(jīng)成為目前持續(xù)對抗肥胖的焦點。因此，靶向miR-27b可能會促進由WAT轉(zhuǎn)化為棕色脂肪組織（BAT）介導的能量消耗，并有可能預防肥胖。雖然成年斑馬魚的脂肪組織已被描述，其生理和形態(tài)與哺乳動物相似已被證實為，但對斑馬魚BAT的發(fā)育知之甚少。我們的體內(nèi)觀察表明，在bC27bSP1的脂肪細胞終末分化過程中，miR-27b缺失通過誘導PPAR-γ、C/EBP-α和SREBP-1c而導致脂肪細胞增生。我們的結(jié)果表明，bC27bSPs中脂肪體積的增加是由于脂肪生成的增加。我們假設(shè)miR-27b可能比燃料代謝更介調(diào)節(jié)脂肪積累，通過能量消耗抑制脂肪組織。這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了miR-27b功能等值對斑馬魚脂肪組織的潛在重要性，這也被證明與斑馬魚的一般發(fā)育和大小密切相關(guān)。

總之，我們的研究結(jié)果表明，miR-27b的慢性消耗會導致總脂質(zhì)含量的增加，從而導致斑馬魚中高脂血癥和NAFLD表型的早期發(fā)病。miR-27b的慢性消耗會導致脂肪形成增加，進而導致脂肪形成（斑馬魚的脂肪細胞增生）和斑馬魚體重增加。所提出的幼年C27bSP模型顯示了病理狀態(tài)的改變，如肝脂肪變性，更多的是，脂肪性肝炎和高脂血癥。具有傳染性nash樣和肥胖表型（不同水平的嚴重肝脂肪變性和脂肪質(zhì)量）的老年C27bsp是研究人類代謝性疾病的理想模型，如高甘油三酯血癥、肥胖和糖尿病。

原文網(wǎng)址：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29286302/

注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻，以及補充圖、表可以點擊至原文查閱。

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