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雜志：International Journal of Molecular Sciences

影響因子：5.6（2022-2023）

年份：2023

通訊作者：Zongbin Cui

摘要

糖尿病已逐漸成為威脅人類健康的嚴重疾病。糖尿病的發(fā)病機制相當復雜，目前尚未完全闡明。斑馬魚已被廣泛認為是研究糖尿病發(fā)病機制和治療干預的有用模型。然而，過度喂養(yǎng)導致斑馬魚糖尿病的分子基礎仍不清楚。本研究通過過度喂養(yǎng)建立斑馬魚糖尿病模型，探討過度喂養(yǎng)導致斑馬魚糖尿病的分子基礎。與對照組相比，過度喂養(yǎng)4周后斑馬魚的體長、體重和狀態(tài)因子指數(shù)均顯著增加?？崭寡撬矫黠@升高，伴有肝內大量脂滴積聚。血清和肝臟中甘油三酯和膽固醇水平均顯著升高。轉錄組測序用于研究過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟的變化。過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟中上調和下調的差異表達基因(DEGs)數(shù)量分別為1582和2404個。對差異表達基因進行KEGG和GO富集分析，確定關鍵信號通路和關鍵DEGs。結果表明，在與脂肪酸代謝相關的信號通路中，有16個基因被發(fā)現(xiàn)顯著上調。具體而言，這些基因主要參與脂肪酸轉運、脂肪酸氧化和酮體生成。此外，13個在葡萄糖代謝中起關鍵作用的基因，特別是在糖酵解和糖生成途徑中，在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中顯著下調。這些結果表明，在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中，胰島素抵抗和葡萄糖進入肝細胞的抑制。這些發(fā)現(xiàn)闡明了斑馬魚過度喂養(yǎng)導致糖尿病的潛在分子基礎，并為進一步研究糖尿病的發(fā)病機制和治療提供了模型。

關鍵詞：糖尿病；斑馬魚；肝；RNA-seq；信號通路。

前言

糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是全球死亡率的主要原因。預計到2045年，全球糖尿病病例將從目前的約5.37億增加到7.83億。據估計，約有670萬20-79歲的成年人死于糖尿病或其并發(fā)癥。2021年中國糖尿病患者人數(shù)為1.409億人。糖尿病是由于胰島素分泌不足或細胞對胰島素敏感性下降引起的，導致長時間的高血糖水平，隨后對體內許多組織和器官造成損害，如腎衰竭、心血管疾病、神經和腦損傷以及其他微血管并發(fā)癥。糖尿病主要有三種類型:1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)和妊娠期糖尿病。

2型糖尿病(T2DM)是最常見的糖尿病類型，占糖尿病病例的95%，其首發(fā)癥狀為胰島素抵抗。人體獲取葡萄糖的主要途徑有三個:腸道對食物的吸收、糖原的分解(糖原分解)和糖異生。胰島素是調節(jié)人體大部分細胞(尤其是肝臟、脂肪組織和肌肉)對血液中葡萄糖攝取的主要激素。因此，胰島素缺乏或其受體不敏感在所有形式的糖尿病中起著核心作用。胰島素不僅促進葡萄糖的吸收，而且刺激脂肪的合成。高甘油三酯水平和肝脂肪變性與胰島素抵抗相關。

許多T2DM患者在達到2型糖尿病診斷標準之前已經有糖尿病前期的跡象，如空腹血糖受損和/或糖耐量受損。尤其是糖耐量受損是進展為全面型糖尿病的主要診斷危險因素。血液中膽固醇和甘油三酯水平高，以及收縮壓和舒張壓升高，也是發(fā)展為糖尿病的危險因素。糖尿病患者常出現(xiàn)以膽固醇和甘油三酯代謝異常為特征的血脂異常等代謝綜合征。心血管疾病(CVD)是T2DM患者發(fā)病和死亡的主要原因。增加糖尿病患者CVD風險的一個重要因素是動脈粥樣硬化性脂質異常，而血液中膽固醇和甘油三酯水平的升高是血脂評估的重要標志物。既往研究表明，T2DM患者的肝臟脂代謝也存在明顯紊亂。

T2DM主要由生活方式因素和遺傳因素引起。目前已知，許多生活方式因素在T2DM的發(fā)生中起重要作用，包括肥胖(定義為體重指數(shù)大于30)、缺乏體力活動、不良飲食、壓力和城市化。含糖飲料等飲食因素與風險增加相關。飲食中的脂肪類型也是重要因素，因為飽和脂肪和反式脂肪會增加風險，而多不飽和脂肪和單不飽和脂肪會降低風險。過量食用精米可能會增加糖尿病的風險，尤其在中國和日本人群中。通過改變生活方式或改善胰島素敏感性或減少肝臟葡萄糖生成的藥物，可以減緩或逆轉糖尿病前期向顯性T2DM的進展。

然而，糖尿病發(fā)生發(fā)展的分子機制仍未闡明。斑馬魚已廣泛應用于代謝性疾病的研究領域。在糖尿病研究方面，斑馬魚有幾個特點。斑馬魚具有與哺乳動物相似的血糖調節(jié)機制，幾種已獲批準的2型糖尿病藥物可顯著降低斑馬魚高糖模型的血糖。此外，斑馬魚已被用于研究胰島β細胞再生的機制，并篩選促進胰島β細胞再生的化合物。在脂肪代謝方面，斑馬魚已被用于研究脂肪代謝和減肥藥的開發(fā)，以及篩選和評價能夠降低體內膽固醇水平的藥物。然而，斑馬魚的血容量相對較低，不利于進行大規(guī)模、重復的采血實驗，如研究血糖代謝調節(jié)機制等?？紤]到不同物種間脂質代謝的保守性，斑馬魚被認為是研究糖尿病和肥胖等代謝紊亂的良好模型，而利用斑馬魚作為模式生物來研究糖尿病也逐漸得到認可。建立斑馬魚糖尿病模型的方法多種多樣，包括化學方法、飲食誘導、葡萄糖浸泡和基因敲除。利用斑馬魚糖尿病模型研究干細胞治療糖尿病和糖尿病心力衰竭。飲食誘導的糖尿病導致斑馬魚胰腺胰島素分泌增加。然而，飲食因素引起的斑馬魚糖尿病在分子水平上的改變仍未被揭示。

本研究通過過度喂養(yǎng)建立斑馬魚糖尿病模型。我們發(fā)現(xiàn)過度喂食的斑馬魚肝臟中有過多的脂滴積聚。通過高通量RNA-seq的比較分析揭示了在過度喂養(yǎng)的斑馬魚中促進脂滴積累和胰島素抵抗的新分子因子。這些研究結果為斑馬魚通過過量喂養(yǎng)成功誘導糖尿病提供了支持，為進一步研究糖尿病的病因和治療提供了模型。

材料和方法

本研究中使用的AB菌株斑馬魚在28℃的標準實驗室條件下維持，光/暗循環(huán)為12/12小時。

本研究中過度喂養(yǎng)的方法是基于發(fā)表的研究。選取4月齡野生型雄性斑馬魚，根據體重和體長隨機分為過度喂養(yǎng)組和對照組，每組20條。對照組在常規(guī)條件下每天喂養(yǎng)1次(上午9:00)，過度喂養(yǎng)組在常規(guī)條件下每天喂養(yǎng)4次(上午9:00、上午11:00、下午15:00、下午17:00)。每次投喂4.08 g/20尾。

凍紅魚主要成分的粗脂肪、粗蛋白質、粗灰分和粗纖維含量分別為4.07%、52.73%、19.2%和9.56%。熱量為3.2254 kcal/g。

采血和測定

斑馬魚采血方法與前一篇文章相同。成年斑馬魚禁食18 h后采血。根據制造商的說明，使用Accu-Chek Performa血糖儀測量血糖水平。

油紅O染色和組織學

對照組和過度喂養(yǎng)組的肝組織被固定在4%多聚甲醛(PFA, Beyotime Biotechnology，上海，中國)中4℃過夜。固定后，如前所述用油紅O染色。組織切片的照片使用來自Leica (Wetzlar，德國)的Aperio VERSA Brightfield熒光和FISH數(shù)字病理掃描儀拍攝。采用ImageJ軟件進行定量分析。

總膽固醇和甘油三酯的測定

總膽固醇和甘油三酯(TG)水平根據制造商的說明書使用商業(yè)試劑盒測定?？偰懝檀紮z測試劑盒(A111-1-1)和甘油三酯檢測試劑盒(F001-1-1)購自南京建成生物工程研究所。

RNA測序的樣本收集和分析

斑馬魚被禁食一夜，然后在過量喂養(yǎng)4周后被處死。收集3條斑馬魚的肝臟作為一個樣本，使用TRIzol Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA)進行總RNA提取，每組包含3個獨立樣本。樣本質量分析、RNA文庫制備和RNA-seq方法如前所述1。構建6個測序文庫并測序。文庫建設和高通量rna測序由中國科學院水生生物研究所分析檢測中心(http://www.ihb.ac.cn/fxcszx/， 2022年11月29日訪問)的專家完成。

生物信息學分析

生物信息學分析按照之前的描述進行。簡而言之，我們首先使用Trimmomatic(0.38版)過濾原始數(shù)據，以去除關節(jié)和低質量數(shù)據，并獲得干凈讀取。然后使用HISAT2(版本2.1.0)將這些高質量的reads映射到從NCBI組裝數(shù)據庫獲得的參考基因組(Danio rerio GRCz11)，以獲得對齊文件的BAM形成。然后，使用讀取匯總程序featurests對讀取計數(shù)進行匯總。這些計數(shù)使用Bioconductor DESeq2包用于基因差異表達分析。篩選低豐度基因(總reads數(shù)< 10)進行差異表達分析。差異倍數(shù)≥1.5且p值≤0.05的基因被視為差異表達基因(DEGs)。

利用KOBAS-i對DEGs進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)和基因本體論(GO)富集分析。利用R-studio軟件中的ggplot2生成KEGG富集結果的點圖和GO富集結果(p值≤0.05)的條形圖。使用RStudio (Version 1.4.1717)根據富集分析結果中共享基因的數(shù)量計算兩條KEGG信號通路之間的Jaccard系數(shù)，并使用Cytoscape (Version 3.8.2)軟件繪制網絡圖。利用Cytoscape插件cytoHubba，通過最大集團中心度(MCC)方法分析核心信號通路和基因，并導出可視化結果。使用REVIGO工具根據KOBAS-i獲得的p值對GO項進行聚類和修剪。

統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel for Windows軟件(Microsoft Office 2013, Microsoft, Redmond, WA, USA)進行統(tǒng)計學分析。采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據以均數(shù)±標準差表示。

雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)4周后空腹血糖水平的升高

過度喂養(yǎng)(OF) 4周后，雄性斑馬魚的體長、體重和條件因子指數(shù)均顯著高于對照組(CK)。其中，CK組斑馬魚平均體長為3.03 cm，而OF組斑馬魚平均體長為3.25 cm。CK組斑馬魚平均重量為0.42 g, of組斑馬魚平均重量為0.58 g。CK組斑馬魚的平均條件因子指數(shù)為1.52,OF組斑馬魚的平均條件因子指數(shù)為1.69。過度喂養(yǎng)1個月后，與CK組相比，斑馬魚的體長、體重和條件因子指數(shù)分別增加了1.1倍、1.4倍和1.1倍(圖1A-C)。

圖1 雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)后體指數(shù)、空腹血糖、甘油三酯和總膽固醇的變化。過量喂養(yǎng)組雄性斑馬魚的體長(A)、體重(B)、條件因子指數(shù)(C)、空腹血糖(D)以及血清中甘油三酯(E)和總膽固醇(F)水平顯著升高(*，p < 0.05;**， p < 0.01;N = 13)。vegfc信號通路促進斑馬魚心臟損傷后冠狀動脈內皮細胞(cEC)增殖。

此外，OF組的空腹血糖平均水平為3.25 mmol/L，顯著高于CK組的2.03 mmol/L(圖1D和圖S1A)。然而，與CK組相比，OF組雌性斑馬魚的空腹血糖水平并沒有出現(xiàn)顯著變化(圖S1B)。

CK組和OF組血清甘油三酯平均水平分別為1.44 mmol/L和7.89 mmol/L。與CK組相比，OF組的血清甘油三酯水平增加了5.5倍(圖1E)。CK組和of組血清膽固醇平均水平分別為3.67 mmol/L和7.33 mmol/L。與CK組相比，OF組血清中的膽固醇水平顯著增加了2倍(圖1F)。

綜上所述，這些數(shù)據表明雄性斑馬魚在過度喂養(yǎng)4周后已經發(fā)展出糖尿病的特征。

雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)4周后肝臟脂滴的積聚

肝臟在調節(jié)血糖水平方面起著重要作用。對CK組和OF組的肝臟切片進行油紅0染色，發(fā)現(xiàn)OF組的肝臟內脂滴積聚增加(圖2A)。ImageJ定量顯示，與CK組相比，OF組的油紅色區(qū)域面積增加了80倍(圖2B)。

圖2 過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中脂滴的積累。對照組和過量攝食組肝臟切片油紅O染色圖像(A)。通過Image J軟件(版本1.50i)對對照組和過量攝食組肝臟脂滴積累的倍數(shù)變化進行量化，并以直方圖顯示(B)。對照組和過量攝食組肝臟甘油三酯(C)和膽固醇(D)水平。(數(shù)值為平均值±SEM;*， p < 0.05;**， p < 0.01;CK:對照組，OF:過食組;N = 5。)

斑馬魚肝臟中的甘油三酯和膽固醇水平也受到過度喂養(yǎng)的顯著影響。CK組和OF組肝臟甘油三酯平均水平分別為0.78×10?5 mmol/mg和3.47×10?5 mmol/mg。與對照組相比，斑馬魚肝臟中的甘油三酯水平增加了4.5倍(圖2C)。

CK組和OF組肝臟膽固醇平均水平分別為1.02×10-5 mmol/mg和1.46×10-5 mmol/mg。與CK組相比，OF斑馬魚肝臟中的膽固醇水平增加了1.4倍(圖2D)。

這些結果表明，過度喂養(yǎng)對斑馬魚的脂質代謝產生嚴重影響，導致脂質在肝臟中蓄積。

RNA-Seq分析鑒定差異表達基因

為了確定OF組肝臟在分子水平的胰島素抵抗現(xiàn)象，我們對CK和OF組肝臟進行了轉錄組分析(圖S2A)。RNA測序的原始數(shù)據范圍為19.29 ~ 22.81M。去除適配器和低質量數(shù)據后，凈讀長范圍為19.25 ~ 22.77M，各組的凈讀長比均在99%以上，表明RNA測序數(shù)據的質量可靠(圖S2B)。各組的clean reads被映射到斑馬魚的參考基因組，映射率在92%以上(圖S2B)。

主成分分析(PCA)顯示OF組和CK組分別聚類在一起，組間差異明顯(圖3A)。共獲得3986個差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，其中1582個上調，2404個下調(fold change≥1.5且p值≤0.05)(圖3B和表S1)。

圖3 對照組和過量喂養(yǎng)組肝臟轉錄組數(shù)據分析結果。差異表達基因的基因表達譜主成分分析(PCA) (A)。直方圖(B)顯示斑馬魚過飼后肝臟中上調和下調的差異表達基因(deg)數(shù)量(倍數(shù)變化≥1.5,p值≤0.05)。

DEGs的KEGG富集分析

使用在線軟件KOBAS(版本3.0)對DEGs進行KEGG富集分析(表S2)。上調DEGs中最富集(p值≤0.05)的KEGG通路為代謝通路、脂肪酸降解、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、過氧化物酶體和β-丙氨酸代謝。下調DEGs中最富集的KEGG通路(p值≤0.05)為緊密連接、凋亡、C型凝集素受體信號通路、NOD樣受體信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用(圖4A、B)。

圖4 過量飼養(yǎng)后肝臟中DEGs的KEGG富集分析結果。上調DEGs (A)和下調DEGs (B)的KEGG富集分析結果點圖。上調DEGs (C)和下調DEGs (D)的最大團簇中心性(MCC)最高的前10個樞紐通路網絡(節(jié)點間的邊表示Jaccard相似性系數(shù);節(jié)點的顏色和大小分別代表路徑的p值和路徑中基因的數(shù)量。)

由于不同KEGG信號通路可能共享相同的DEGs，因此引入Jaccard相似性系數(shù)，根據共享DEGs的比例計算兩條信號通路之間的距離(表S3)。獲得上調和下調DEGs的KEGG通路網絡。然后，使用CytoHubba軟件識別網絡中的樞紐通路。在表達上調的DEGs富集的信號通路中，排在前5位的hub信號通路是代謝通路、脂肪酸降解、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、色氨酸代謝和賴氨酸降解(圖4C和表1)。在表達下調的DEGs富集的信號通路中，排在前5位的樞紐信號通路是C型凝集素受體信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、NOD樣受體信號通路、凋亡和toll樣受體信號通路(圖4D和表2)。此外，22個DEGs被映射到脂肪酸降解的KEGG通路，這是第一個從上調DEGs富集的樞紐信號通路(圖4C和表S2)。在從下調的DEGs富集的核心信號通路中，有47個DEGs被映射到MAPK信號通路，這是核心通路中的第一個(圖4D和表S2)。

纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、脂肪酸降解、色氨酸代謝和賴氨酸降解等樞紐通路共有11個上調的樞紐DEGs(圖5A)。在這些核心DEGs中，有8個上調至少1倍，包括aldh2.1、CABZ01032488.1、acads、aldh2.2、hadh、ehhadh和ehhadh(圖5B)。此外，C型凝集素受體信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、NOD樣受體信號通路、凋亡和toll樣受體信號通路等樞紐通路共有14個樞紐下調的DEGs(圖5C)。在這些核心DEGs中，有8個被下調至少1倍，包括il1b、nfkbiaa、tnfa、hrasb、nfkb1、oik3ca、traf2b和rhoab(圖5D)。

圖5 確定了樞紐通路中的樞紐基因。從上調的DEGs中富集到前4個核心通路的11個核心基因的網絡(A)。從下調的DEGs中富集到前5個核心通路的14個核心基因的網絡(C)。從下調的核心基因的網絡(D)。edge代表(A,C)中路徑對應的基因。

DEGs的GO富集分析

利用KOBAS對差異表達基因進行GO富集分析。從上調的DEGs中富集出133個GO項，其中與生物過程相關的GO項58個，與細胞成分相關的GO項15個，與分子功能相關的GO項60個(表S4)。此外，從下調的DEGs中富集出238個GO項，其中與生物過程相關的GO項117個，與細胞成分相關的GO項30個，與分子功能相關的GO項91個(表S4)。

采用在線軟件REVIGO (version 1.8.1)進行富集分析，獲得具有代表性的GO術語。在生物學過程中，表達上調的DEGs富集的代表GO項包括脂肪酸β-氧化(GO:0006635)、細胞對雌激素刺激的反應(GO:0071391)、胚胎造血(GO:0035162)、脂質轉運(GO:0006869)和突觸囊泡胞出的調節(jié)(GO:2000300)。在分子功能上，由上調的DEGs富集的代表性GO項包括?；o酶A脫氫酶活性(GO:0003995)、脂肪-酰基輔酶A結合(GO:0000062)、酰基甘油脂肪酶活性(GO:0047372)、鐵離子結合(GO:0005506)、脂質轉運活性(GO:0005319)和乙酰輔酶AC-?；D移酶活性(GO:0003988)(圖6A)。

圖6 GO富集分析代表性項的條形圖。使用REVIGO工具，上調的DEGs (A)和下調的DEGs (B)的GO項被降低，并顯示在條形圖中。代表性GO術語的不同方面用不同的顏色表示。BP:生物過程;MF:分子功能;CC:細胞成分。

下調DEGs富集的代表性生物學過程包括對細菌的防御反應(GO:0042742)、糖酵解過程(GO:0006096)、氨基酸轉運(GO:0006865)、金屬離子轉運(GO:0030001)和JNK級聯(lián)的正調控(GO:0046330)。代表性的細胞成分包括中間絲狀體(GO:0005882)、NADPH氧化酶復合物(GO:0043020)、頂端質膜(GO:0016324)、雙細胞緊密連接(GO:0005923)和自噬體膜(GO:0000421)。代表性分子功能包括l-氨基酸跨膜轉運活性(GO:0015179)、蛋白酪氨酸激酶活性(GO:0004713)、腫瘤壞死因子受體結合活性(GO:0005164)、配體門聯(lián)鈣通道活性(GO:0099604)和金屬肽酶活性(GO:0008237)(圖6B)。

過度喂養(yǎng)上調斑馬魚肝臟脂肪酸代謝基因和下調葡萄糖代謝基因

通過對OF斑馬魚肝臟中DEGs的分析，過度喂養(yǎng)影響的主要信號通路為脂肪酸和葡萄糖代謝(圖7)。

圖7 過量攝食組肝臟脂肪酸代謝和葡萄糖代謝信號通路上調和下調基因示意圖。斜體和紅色的字母代表上調基因，斜體和綠色的字母代表下調基因。

在上調的DEGs中，有16個DEGs參與脂肪酸代謝信號通路。其中，plin1上調14倍，編碼一種主要附著在脂滴表面的脂滴相關蛋白。其他15個DEGs主要參與脂肪酸跨膜轉運(fabp10b、slc27a2a)、脂肪酸β -氧化(hacd2、acaa1、acaa2、acadl、acadm、acads、acadvl、echs1)、酮體生成(hmgcl)、膽固醇轉移(scp2a、cetp)、肉堿棕櫚酰轉移酶(cpt2)和乙酰輔酶a合成酶(acsf2)等過程(圖7和圖S3，以及表3)。

此外，下調的DEGs中有13個與糖代謝信號通路相關。下調倍數(shù)變化最大的兩個DEGs是hk2(下調6倍)和gyg1b(下調8倍)。這些下調的DEGs主要參與糖酵解(hk1, hk2, pfkla, pfkpb, aldoaa, aldocb, gapdhs, eno1a, eno1b, pkma)和糖原生成(gys1, gsk3bb, gyg1b)。此外，一個參與糖原分解的DEG (pygl)被上調2.5倍(圖7，圖S4和表4)。這些結果表明，OF斑馬魚的肝細胞中葡萄糖含量降低，葡萄糖攝取受阻。

綜上所述，OF斑馬魚肝臟脂肪酸代謝活性增強，而葡萄糖代謝活性受到抑制，說明OF斑馬魚肝臟的能量供應來源已經從葡萄糖代謝轉向脂肪酸代謝，這與T2DM的生理現(xiàn)象是一致的。

討論

T2DM的主要特征是胰島素抵抗和代償性胰島素分泌不足，導致血糖水平升高。胰島素抵抗是指肝臟、肌肉和脂肪組織對胰島素的反應性降低，從而導致高血糖、血脂異常、內臟型肥胖和炎癥因子升高等癥狀。T2DM早期血液中胰島素水平升高，然而，長期的葡萄糖刺激會對胰島β細胞產生毒性，導致糖尿病后期的內質網應激和細胞凋亡，導致β細胞合成和分泌胰島素的能力下降，從而導致血漿中胰島素水平下降。糖尿病患者常伴有血清膽固醇和甘油三酯升高。因此，可以通過測定血清中的甘油三酯水平、膽固醇含量和葡萄糖耐量來評估胰島素抵抗。本研究中，雄性斑馬魚經過1個月的過度喂養(yǎng)后，體長、體重、條件因子指數(shù)、空腹血糖水平以及血清甘油三酯和膽固醇含量均顯著高于對照組，表明我們成功建立了過度喂養(yǎng)的T2DM斑馬魚模型。

T2DM模型的建立主要是通過破壞組織對胰島素的敏感性，導致葡萄糖吸收受損，從而導致血糖水平升高。將成年斑馬魚交替浸泡在水或2%葡萄糖溶液中28-30天，誘導空腹血糖水平升高、視網膜損傷和骨細胞功能受損。3 hpf(受精后小時)至5 dpf(受精后天數(shù))的斑馬魚幼魚交替浸泡在4%和5%葡萄糖溶液中可誘發(fā)糖尿病樣視網膜病變。斑馬魚浸泡在逐漸增加的葡萄糖溶液中——50毫米葡萄糖溶液浸泡4天，100毫米葡萄糖溶液浸泡3天，200毫米葡萄糖溶液浸泡13天——表現(xiàn)出體重增加和血糖水平升高的癥狀。成年斑馬魚在111 mM的葡萄糖溶液中浸泡14天后，其血糖水平升高，眼部糖化蛋白的數(shù)量也增加，但肌肉中胰島素受體的轉錄水平下降，對外源胰島素的反應受損。

超重或肥胖也是T2DM發(fā)生發(fā)展的重要因素;因此，在斑馬魚中建立糖尿病模型的另一種方法是通過過度喂養(yǎng)或高脂喂養(yǎng)。成年斑馬魚過量食用市售魚食可表現(xiàn)出糖尿病癥狀，如葡萄糖耐量降低和胰島素表達減少。用10%膽固醇喂養(yǎng)斑馬魚并同時將其浸泡在2%葡萄糖溶液中19天，會導致斑馬魚幼魚出現(xiàn)更多的糖尿病癥狀，如胰島素、胰高血糖素、葡萄糖、甘油三酯和膽固醇水平顯著升高。在肥胖個體中，脂肪組織釋放更多的非酯化脂肪酸、甘油、激素、促炎細胞因子等因子。這些因素可誘發(fā)胰島素抵抗，加速胰腺損傷，最終導致T2DM。此外，脂肪組織中的胰島素抵抗可導致線粒體功能障礙，導致ROS和炎性細胞因子的產生，以及脂肪因子、細胞因子、趨化因子、過多的脂質和毒性脂質代謝物釋放到血流中。這些物質進一步加劇其他組織的胰島素抵抗。此外，肝組織中的胰島素抵抗導致脂肪酸在肝臟中的蓄積增加。在之前的研究中，我們分析了過量進食斑馬魚的肝臟和胰腺的基因表達譜，并揭示了人類T2DM的共同通路。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過量喂養(yǎng)的雄性斑馬魚在空腹血糖水平升高的同時，肝臟內大量脂滴聚集。高脂飲食喂養(yǎng)小鼠表現(xiàn)為糖耐量受損、胰島素抵抗、體質量增加、血漿和肝臟甘油三酯水平升高、肝臟脂肪變性。在本研究中，這些特征在雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)4周后被觀察到。然而，過度喂養(yǎng)導致糖尿病的分子基礎仍不清楚。因此，我們進一步進行了轉錄組分析，以研究過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟中的新變化。

在過度喂養(yǎng)4周后，雄性斑馬魚的空腹血糖水平顯著升高，而雌性斑馬魚即使在過度喂養(yǎng)8周后，空腹血糖水平也沒有顯著變化。世界范圍內的差異性研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)病率存在性別差異，男性發(fā)病率高于女性?？梢酝茰y，其原因可能是雌激素過多導致女性胰島素抵抗的可能性更大。

需要進一步的研究來揭示雌激素和睪酮在糖尿病男女性別差異中的作用機制。

肝臟中多余的脂肪酸需要通過β-氧化消耗或轉化為膽固醇或甘油三酯，然后通過載脂蛋白轉運到身體的其他部位。肝臟中過量的甘油三酯和膽固醇被包裝在脂滴中。Perilipin 1由plin1表達，是一種主要附著在脂滴表面的脂滴相關蛋白。其功能包括增加脂滴大小和調節(jié)甘油三酯水平。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)這個基因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中表達上調了14倍。

此外，我們發(fā)現(xiàn)從脂肪酸轉運到脂肪酸β氧化的整個代謝過程中的多個其他基因顯著上調。例如，基因slc27a2a和fabp10b分別上調2.9倍和2.8倍。slc27a2a基因編碼長鏈脂肪酰基輔酶a合成酶家族的一個成員，參與脂質生物合成和脂肪酸降解。fabp10b編碼脂肪酸結合蛋白(FABP)，主要促進脂肪酸的攝取、細胞內轉運和代謝。將脂肪酸類從細胞膜轉運到其代謝部位以進行β-氧化和甘油三酯類和磷脂類的合成。因此，在過量喂養(yǎng)的雄性斑馬魚中，slc27a2a和fabp10b的上調可以促進脂肪酸從細胞外到細胞內的轉運。固醇載體蛋白2a (scp2a)主要調控細胞內脂質轉運，促進外源性脂肪酸合成甘油三酯和膽固醇。膽固醇酯轉運蛋白(cetp)的主要功能是轉運膽固醇酯和甘油三酯，調節(jié)膽固醇的反向轉運，將外周組織中多余的膽固醇轉運到肝臟進行代謝和消化。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)這兩個基因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中的表達分別上調了2.3倍和2.1倍。

上調DEGs的KEGG富集分析結果中，有5條與脂肪酸代謝相關的信號通路。KEGG富集結果中最重要的樞紐通路為脂肪酸降解和脂肪酸代謝。與脂肪酸降解和代謝相關的核心基因為hadh、ehhadh、acat1、hadhaa、acads和echs1。其中，上調最多的基因是acads，其編碼?；鵆oA脫氫酶，參與脂肪酸β-氧化的第一步。這些樞紐基因可作為糖尿病早期診斷的潛在分子標志物。在上調的DEGs的GO富集分析中，代表性的GO項為脂肪酸β-氧化，包含13個原始GO項。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些上調的基因主要參與脂肪酸轉運、脂肪酸氧化和膽固醇轉運。

過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中acsf2和cpt2的表達水平分別上調2.5倍和2.7倍。長鏈脂肪酸首先需要?；o酶a合成酶家族成員2 (acsf2)催化成?；o酶a，然后通過肉堿棕櫚酰基轉移酶2 (cpt2)轉移到線粒體內膜。經過多次酶催化反應，長鏈脂肪酸轉化為乙酰輔酶a，進入三羧酸循環(huán)氧化。此外，過量喂養(yǎng)斑馬魚肝臟中參與脂肪酸β-氧化的多種酶基因顯著上調，包括?；o酶a脫氫酶(acadvl, acadl, acadm, acads)、烯丙基輔酶a水合酶(echs1)、3-羥基輔酶a脫氫酶(hacd2)和β-酮硫酶(acaa1, acaa2)。脂肪酸β-氧化的產物乙酰輔酶a可進一步轉化為酮體，并轉運到其他組織，為機體提供能量[58]。由hmgcl編碼的HMG-CoA裂解酶在生酮過程中起重要作用，該基因在過量喂養(yǎng)的糖尿病斑馬魚肝臟中上調1.6倍。脂肪酸β-氧化主要受PPARα信號通路調控[59]。我們發(fā)現(xiàn)PPARα通路已從上調基因中顯著富集，并且過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中有15個上調的deg被定位到該信號通路上。以上數(shù)據表明，過量攝食可以促進斑馬魚肝臟脂肪酸代謝。這些與脂肪酸代謝相關的基因的上調導致線粒體代謝負擔增加，導致ROS的產生和線粒體功能障礙。線粒體功能障礙和氧化應激在很大程度上與T2DM有關。

細胞內葡萄糖的代謝主要通過糖酵解進行。然而，與糖酵解相關的基因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中的表達水平顯著下調。這些酶主要包括己糖激酶(hk1、hk2)、磷酸果糖激酶(pfkla、pfkpb)、果糖二磷酸醛縮酶(aldoaa、aldocb)、甘油醛磷酸脫氫酶(gapdhs)、烯醇化酶(eno1a、eno1b)和丙酮酸激酶(pkma)。編碼糖原合成相關蛋白的基因gyg1b、gsk3bb和gys1在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中顯著下調。gyg1b編碼一種具有葡萄糖基轉移酶活性的糖原蛋白，其表達減少6倍，其催化產物為糖原合成酶的底物。gys1基因編碼糖原合酶，在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中下調1.6倍。激活糖原合成酶的糖原合成酶激酶(gsk3bb)下調2.6倍。然而，催化糖原分解的基因pygl在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中上調了2.5倍，表明過度喂養(yǎng)導致肝細胞葡萄糖含量降低和葡萄糖攝取受損。

本研究通過轉錄組鑒定了斑馬魚肝臟中的4個胰島素受體亞單位(irs1, irs2a, irs2b, irs4a)和2個胰島素受體(insra, insrb)。其中irs1、insra表達上調，irs2a、irs2b、irs4a、insrb表達下調。然而，這6個基因的倍數(shù)變化均小于1.5，并且在統(tǒng)計學上不顯著(p值> 0.05)(表S5)。據報道，胰島素受體磷酸化的降低對胰島素抵抗細胞中胰島素信號通路的阻斷是重要的。胰島素受體雜合子缺失的小鼠具有正常的葡萄糖和胰島素耐受性。這些研究表明胰島素受體的磷酸化在胰島素信號轉導中比胰島素受體表達水平的改變起著更重要的作用。此外，過去幾年的大量研究表明，肝內脂滴的形成以及膽固醇和甘油三酯含量的增加與胰島素抵抗相關。在本研究中，過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中出現(xiàn)了脂滴的過度積累和甘油三酯和膽固醇水平的升高，在一定程度上說明了胰島素抵抗的發(fā)生。

綜上所述，我們利用高通量轉錄組測序和生物信息學分析技術，揭示了過量飲食斑馬魚肝臟中與脂肪酸和葡萄糖代謝相關的信號分子的變化。過量喂養(yǎng)的雄性斑馬魚表現(xiàn)出脂肪酸代謝增強和葡萄糖代謝抑制，提示胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生。

結論

本研究通過過度喂養(yǎng)建立斑馬魚糖尿病模型。與對照組相比，過度喂養(yǎng)4周后斑馬魚的體長、體重和條件因子指數(shù)均顯著增加?？崭寡撬矫黠@升高，肝臟內大量脂滴積聚。血清和肝臟中甘油三酯和膽固醇含量也顯著升高。通過對過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟的轉錄組測序，我們發(fā)現(xiàn)16個上調的DEGs在脂肪酸代謝的信號通路中發(fā)揮作用，包括脂肪酸轉運，脂肪酸氧化和酮生成。此外，13個下調的DEGs參與了糖代謝信號通路中的糖酵解和糖生成，表明過量喂養(yǎng)雄性斑馬魚的胰島素抵抗和葡萄糖進入肝細胞的抑制。這些發(fā)現(xiàn)闡明了過度喂養(yǎng)導致斑馬魚糖尿病的分子基礎，為進一步研究斑馬魚糖尿病的發(fā)病機制和治療奠定了基礎。

基金：這項研究得到了國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFA0800503)、廣東省科學院建設國內一流科研機構項目(2021GDASYL-20210103024)、中國科學院科技發(fā)展計劃項目(2022gdaszhh -2022010202)、廣東省科學院專項基金項目(2021GDASYL-20210102003)、國家自然科學基金項目(31871463和31571504)的支持。

原文：Ge G, Ren J, Song G, et al. Transcriptome Analysis Reveals the Molecular Basis of Overfeeding-Induced Diabetes in Zebrafish[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(15): 11994.

原文地址：https://doi.org/10.3390/ijms241511994

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