管理书籍排行榜,完美的世界 1993 电影

0512-8957 3668 / 18013764755

【文獻(xiàn)解讀】敲除Nur77導(dǎo)致斑馬魚氨基酸、脂質(zhì)和葡萄糖代謝紊亂

來(lái)源:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2022.864631/full | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時(shí)間: 2023-10-28 | 1080 次瀏覽 | 分享到:

最近，越來(lái)越多的研究表明Nur77是控制葡萄糖和亞麻酸穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Nur77表達(dá)于多種代謝相關(guān)組織，如骨骼肌、肝臟、胰腺和脂肪。在骨骼肌細(xì)胞中，與能量代謝相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)減少。Nur77的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素信號(hào)(如Glut4)、糖酵解和糖原分解相關(guān)基因的顯著增加。Nur77過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠糖酵解改變肌肉質(zhì)量和肌纖維大小。高脂肪喂養(yǎng)的Nur77?/?小鼠表現(xiàn)出代謝變化，如能量消耗減少、胰島素抵抗、血糖清除率降低和骨骼肌脂質(zhì)含量增加。

雜志：Frontiers in Endocrinology

影響因子：5.2（2023）

年份：2022

通訊作者：Jie Liu、 Mingyu Li

通訊作者單位：Fujian Provincial Key Laboratory of Innovative Drug Target Research, School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen, China

摘要

背景：據(jù)報(bào)道，孤兒核受體Nur77參與多種代謝過(guò)程，包括碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝。然而，Nur77在代謝途徑調(diào)控中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

方法：在本研究中，我們通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了nur77敲除斑馬魚模型，然后對(duì)野生型和nur77缺失斑馬魚進(jìn)行了全生物體RNA測(cè)序分析，剖析了代謝相關(guān)通路的遺傳變化。

結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)，許多涉及氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝的基因發(fā)生了兩倍以上的變化。此外，我們發(fā)現(xiàn)nur77突變體表現(xiàn)出總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)增加，總氨基酸改變以及葡萄糖升高。我們還證明，葡萄糖升高不是由于葡萄糖攝取的改變，而可能是由糖酵解/糖異生障礙和β細(xì)胞功能受損引起的，包括insb表達(dá)下調(diào)、β細(xì)胞質(zhì)量減少和胰島素分泌抑制。

結(jié)論：重要的是，我們還驗(yàn)證了β細(xì)胞中Nur77的靶向表達(dá)足以挽救全球Nur77幼魚斑馬魚的β-細(xì)胞缺陷。這些結(jié)果為Nur77信號(hào)調(diào)節(jié)的全球代謝網(wǎng)絡(luò)以及Nur77在β細(xì)胞功能中的作用提供了新的信息。

關(guān)鍵詞：Nur77，斑馬魚，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，β細(xì)胞，脂質(zhì)代謝，葡萄糖代謝。

前言

核受體Nur77，也被稱為TR3、NR4A1、NGFI-B、NAK1或TIS1，屬于核受體超家族的NR4A亞家族。Nur77是一種早期即時(shí)反應(yīng)基因，可被多種生理分子和刺激誘導(dǎo)，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、應(yīng)激、葡萄糖和脂肪酸。它在細(xì)胞增殖、分化、炎癥、免疫、凋亡和代謝中起著多效作用。

不僅在骨骼肌中，Nur77在肝臟中也起著類似的代謝作用。Nur77的高表達(dá)驅(qū)動(dòng)肝臟葡萄糖生成，提高血糖水平，并誘導(dǎo)參與糖異生的基因。高脂肪喂養(yǎng)的Nur77缺失小鼠也表現(xiàn)出肝臟葡萄糖生成減少和肝臟胰島素抵抗。Nur77激動(dòng)劑，如胞孢素B (CsnB)，可以提高小鼠的血糖。Nur77還參與肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。在功能獲得方法中，肝臟過(guò)表達(dá)Nur77通過(guò)抑制甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白lc (SREBPIc)和改變其他脂質(zhì)酶基因表達(dá)來(lái)降低肝臟甘油三酯。高脂肪喂養(yǎng)的Nur77缺失小鼠表現(xiàn)出肝臟脂肪變性上調(diào)和肝臟脂肪生成基因高表達(dá)水平。

在脂肪組織中，Nur77在肥胖和糖尿病小鼠的脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低。Nur77對(duì)脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞的脂肪分化、脂質(zhì)積累和脂肪形成也有負(fù)調(diào)控作用。缺乏nur77的小鼠對(duì)高脂肪飲食(HFD)誘導(dǎo)的肥胖表現(xiàn)出更高的易感性，因此觀察到更高的體重和脂肪量。真正重要的是，celastrol雷公藤紅素顯著降低了體重，脂肪組織質(zhì)量，以及由nur77缺陷小鼠抑制的HFD引起的脂肪細(xì)胞的大小。

最近，研究人員研究了Nur77在胰腺β細(xì)胞中的重要作用。Nur77通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡來(lái)保護(hù)胰腺β細(xì)胞。相反，葡萄糖和棕櫚酸鹽誘導(dǎo)Nur77在胰腺β-細(xì)胞系、Ins-1和MIN6中的表達(dá)。Nur77表達(dá)水平升高會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)胰島素含量，葡萄糖刺激的胰島素分泌對(duì)β細(xì)胞有害。

因此，Nur77在調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝組織的脂質(zhì)和碳水化合物代謝中具有重要作用。一些小分子，如CsnB和celastrol，已被改進(jìn)為在nur77依賴途徑中調(diào)節(jié)代謝。這些研究表明，新的nur77靶向藥物在治療代謝性疾病、肥胖、血脂異常和心血管疾病方面可能具有巨大的潛力。

適當(dāng)?shù)暮Y選模型對(duì)藥物開發(fā)至關(guān)重要。斑馬魚的基因同源性高，幾個(gè)器官的發(fā)育與人類相似。便于獲得充足的胚胎和幼魚，用于全球系統(tǒng)研究和藥物篩選。雖然組學(xué)研究已經(jīng)應(yīng)用于Nur77 mice，但整個(gè)動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組，特別是代謝改變?nèi)匀徊磺宄?。在目前的研究中，我們首先生成了nur77基因敲除的斑馬魚，并利用整個(gè)斑馬魚幼魚進(jìn)行了RNA測(cè)序(RNA- seq)分析。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可以讓我們對(duì)缺乏nur77時(shí)基因表達(dá)的改變有一個(gè)全局的認(rèn)識(shí)。我們的目標(biāo)是闡明nur77斑馬魚的綜合代謝改變。此外，nur77敲除突變系應(yīng)該有助于nur77相關(guān)代謝調(diào)節(jié)的進(jìn)一步機(jī)制研究和藥物篩選。

方法與試劑

斑馬魚線和維護(hù)

斑馬魚(Danio rerio)在循環(huán)水培養(yǎng)系統(tǒng)(上海海升生物技術(shù)有限公司，上海，中國(guó))中培養(yǎng)，水溫28℃，光照14h，黑暗10h。胚胎從自然培養(yǎng)中獲得，按照Kimmel等人的方法在28.5°C的胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本研究以AB株、nur77突變體斑馬魚、Tg(gega:GFP)、Tg(Ins:H2BmCherry)(41)和(Tg Ins:GCaMP6s: eGFP)轉(zhuǎn)基因系為研究對(duì)象。所有程序均已廈門大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與利用委員會(huì)(協(xié)議號(hào):No. 539)批準(zhǔn)。2016年3月10日XMULAC20160089號(hào))。

利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立nur77基因敲除斑馬魚

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行基因組編輯。利用在線工具CRISPRscan設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)(CCGGGCAGCTGGACTCCTTC)。用T7試劑盒(MAXIscript T7 Transcription kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)合成sgRNA，用RNA純化試劑盒(RNA Clean and Concentrator-5, Zymo Research, Irvine, CA, USA)純化sgRNA。然后將sgRNA和Cas9蛋白(NEB，中國(guó)北京)共注射到單細(xì)胞期胚胎中。提取胚胎基因組DNA，評(píng)估基因組編輯效率。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增CRISPR靶位點(diǎn)周圍的基因組區(qū)域，電泳凝膠圖像檢測(cè)突變位點(diǎn)(引物序列5′~ 3′端為ECTCCCTCTTCAGCTCAGAGTTTCT， R：TGCAGATGCCGGACTTCCA)。將突變體FO代培養(yǎng)至性成熟，與AB型斑馬魚交配獲得Fl代。提取Fl代的基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增CRISPR靶位點(diǎn)周圍的基因組區(qū)域，測(cè)序得到13 bp基因(突變序列ACCTCCGGGCAGC)的單突變斑馬魚。進(jìn)一步雜交獲得nur77突變體的斑馬魚品系。

RNA提取，cDNA文庫(kù)制備和測(cè)序

使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA，USA)從40只斑馬魚幼魚中提取總RNA，重復(fù)三次。為了去除任何基因組DNA污染，使用RQI RNase-Free DNase (Promega, Madison, WI，USA)純化RNA。每個(gè)樣品的濃度和質(zhì)量由Agilent RNA6000納米試劑盒在Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies, Santa Clara, CA，USA)中測(cè)定。所有樣品的RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)(RIN/RQN)均為10。每個(gè)樣品的mRNA通過(guò)寡聚體(dT)珠選擇構(gòu)建cDNA文庫(kù)。用N6隨機(jī)引物將總mRNA片段逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA (Ds cDNA)。合成的雙鏈cDNA經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、5′端磷酸化和3′端腺苷化。然后將剪接連接到3'端腺苷酸cDNA片段。將連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以豐富cDNA模板。將這些PCR產(chǎn)物變性后，將單鏈DNA環(huán)化，形成最終的cDNA文庫(kù)。所有cDNA文庫(kù)在BGISEQ-500RS平臺(tái)(華大基因，深圳，中國(guó))上按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議進(jìn)行測(cè)序。

RNA序列數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)BGISEQ-500質(zhì)控測(cè)試，使用SOAPnuke軟件過(guò)濾成干凈讀數(shù)。該過(guò)程丟棄含有適應(yīng)序列的讀出，含有未知堿基“N”大于10%的讀出，以及低質(zhì)量讀出(讀出中低質(zhì)量堿基的百分比大于50%)。過(guò)濾后，將干凈的讀數(shù)與斑馬魚基因組(Danio rerio, GRzhll，http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)，使用HISat(v2.0.4)。經(jīng)過(guò)比較，使用斑馬魚單基因清潔讀取的Bowtie2和RSEM (RNA-Seq by Expect Maximization)，通過(guò)使用fragments per kilobase per million (FPKM)方法(fragments per kilobase transcript/million測(cè)序片段)來(lái)量化基因表達(dá)。此外，在Ensembl (www.ensembl)中對(duì)一些未識(shí)別的基因進(jìn)行了注釋。org)通過(guò)BLAST和Synteny分析。這些序列數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，可通過(guò)BioProject ID: PRJNA801348。

差異表達(dá)基因分析

DESEQ2用于鑒定差異表達(dá)基因(DEGs)。將差異倍數(shù)為22.00且校正后p值為0.05的基因作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DEG。對(duì)于重復(fù)樣本，在變化倍數(shù)為22.00，概率為20.80的條件下，利用NOISEO計(jì)算每個(gè)基因在每次比較中的log2倍數(shù)變化(Log2FC)和概率。利用基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析。顯著富集的基因?yàn)閝值為S0.001、FDR為s0.01的基因。

定量RT-PCR

采用定量RT-PCR (qRT-PCR)技術(shù)對(duì)DEGs進(jìn)行驗(yàn)證。提取的RNA用寡核苷酸引物(dT) 和M-MLV (Promega)逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。qRT-PCR反應(yīng)在Agilent AriaMx系統(tǒng)(Agilent Technologies)中使用PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Science)進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃10 s, 60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。我們使用了三組野生型或nur77樣本，每個(gè)樣本在三個(gè)平行副本中進(jìn)行測(cè)試。本實(shí)驗(yàn)采用2?ΔΔCt法計(jì)算mRNA水平，以β-actin水平作為內(nèi)參照，計(jì)算各基因相對(duì)于內(nèi)參照的水平(倍數(shù))。這些數(shù)據(jù)由每組3個(gè)生物樣本的平均值提供。qRT-PCR中使用的引物列于補(bǔ)充表S1中。

2-[N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1 3-Diazol-4-yl)氨基]-2-脫氧- d -葡萄糖(2-NBDG)攝取試驗(yàn)

將受精后6天左右的斑馬魚幼魚(dpf)在含有600 μM 2NBDG (B6035, Apexbio, Houston, Texas, USA)的0.3倍Danieau溶液中孵育3小時(shí)，然后麻醉，立即在M205FCA顯微鏡(Leica, Wetzlar, Germany)下成像。最后，根據(jù)Lee et al.，利用斑馬魚眼球晶狀體的熒光強(qiáng)度來(lái)指示葡萄糖攝取。

游離葡萄糖的測(cè)定游離葡萄糖

采用葡萄糖檢測(cè)試劑盒(Red glucose / glucose Oxidase Assay kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)測(cè)定。10只幼魚在100 ul樣品緩沖液中勻漿，離心后吸收上清。按照生產(chǎn)廠家說(shuō)明，測(cè)定相當(dāng)于1只幼魚(10 μl勻漿)的游離葡萄糖。每個(gè)樣品至少有3個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)。

總膽固醇和總甘油三酯的測(cè)定

采用總膽固醇檢測(cè)試劑盒(A111-1，南京建成生物工程研究所)和甘油三酯檢測(cè)試劑盒(Al10-1-1，南京建成生物工程研究所)測(cè)定斑馬魚的總膽固醇。隨機(jī)選取30條6日齡斑馬魚幼魚從野生型(WT)和nur77?/?組中收集。每組有3個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)序列?？偰懝檀几鶕?jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定總甘油三酯。

氨基酸測(cè)定

隨機(jī)收獲WT組和nur77組6dpf胚70個(gè)，每組3個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)序列。樣品在6 NHCl中冷凍干燥，110℃下水解24 h，加入蒸餾水調(diào)節(jié)體積至10 ml, 1 ml水解液用氮?dú)獯蹈?，懸浮? ml 0.02 M HCl中。樣品重懸后，用0.22 um濾膜過(guò)濾，用日本千代田日立L8900氨基酸自動(dòng)分析儀(千代田日立，東京，日本)測(cè)定氨基酸組成。幼魚體內(nèi)的氨基酸以微克/毫克濕組織表示。

GCaMP6s圖像采集與分析

對(duì)分離的胰島進(jìn)行GCaMP6s測(cè)定Tg (Ins: H2BmCherry);Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77?/?;Tg (Ins:H2BmCherry);Tg(Ins:GCaMP6s)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在6dpf。將分離的胰島分別包埋于含5和20 mM葡萄糖的細(xì)胞外液(ECS)中。利用Leica SP8對(duì)葡萄糖刺激的Ca2+內(nèi)流進(jìn)行成像，并通過(guò)Image J進(jìn)行分析。

β細(xì)胞計(jì)數(shù)

在4°C的4%多聚甲醛中過(guò)夜固定后，用1倍PBS加0.1% Tween-20 (PBST)洗滌，并在Aqua-Mount (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI, USA)中平裝，使其右側(cè)面向蓋蓋。將幼魚壓平，只是為了稍微破壞胰島，以便更好地分辨β細(xì)胞。根據(jù)mCherry信號(hào)，使用x40透鏡下的蔡司Axiolmager或x40透鏡下的蔡司LSM710共聚焦投影(Carl Zeiss, Oberkohen, baden-Wurberg, Germany)對(duì)β細(xì)胞計(jì)數(shù)。

胰島素免疫熒光染色

將6 dpf左右的幼魚固定在4%多聚甲醛中，4℃過(guò)夜。經(jīng)沖洗、脫水、再水合和丙酮處理后，將幼魚置于塊液(5% FBS in PBDT, 1倍PBS, 0.1% Tween-20, 1% DMSO)中室溫孵育2小時(shí)。本研究使用的一抗為抗胰島素(豚鼠，Dako A0564, 1:10 00在2% FBS PBDT中)，在4°C下過(guò)夜(O/N)。在PBDT中沖洗4倍10分鐘后，幼魚與二抗(山羊抗豚鼠，Invitrogen Al1075, 1:10 00在2% FBS PBDT中)在室溫下孵育2小時(shí)。幼魚在Aqua-Mount中平裝，使用蔡司LSM710成像。

轉(zhuǎn)基因系的建立

Tg(Ins: Nur77;利用minitol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建cmlc2:eGFP)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。使用多位點(diǎn)Gateway系統(tǒng)組裝轉(zhuǎn)基因。擴(kuò)增人Nur77 cDNA并亞克隆至pME-p5E-Ins、pME-Nur77和p3E-MCS，然后組裝到pDestTol2-CG2目的載體中，獲得Tg的最終轉(zhuǎn)基因(ins Nur77;cmlc2:eGFP)。cmlc2:EGFP元件用于轉(zhuǎn)基因載體的鑒定。Tg質(zhì)粒(ins:Nur77;cmlc2:eGFP)與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA(各25 ng/ul)混合，并使用描述的標(biāo)準(zhǔn)方案注射到單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中。

采用PCR方法檢測(cè)Ins-Nur77-F:5'CCACCACCATATCCACCATT-3'Ins-Nur77-R:5'TCTTCTCCGCCCACTTGC-3'的eGFP表達(dá)。

統(tǒng)計(jì)分析

所有原始數(shù)據(jù)均采用GraphPad prism8軟件(GraphPad軟件，La Jolla, CA, USA)進(jìn)行分析。結(jié)果以均數(shù)SEM表示。用于統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)集沒(méi)有排除離群值。統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)(SPSS)。P <0.05為顯著性。

結(jié)果

敲除斑馬魚Nur77基因CRISPR/Cas9

在斑馬魚基因組中，只有一個(gè)與人類Nur77同源的基因，我們將其命名為Nur77。為了闡明Nur77在斑馬魚中的功能，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了Nur77突變斑馬魚。我們得到了一個(gè)穩(wěn)定的突變系，在nur77的外顯子上有13bp的缺失(圖1A)。該突變導(dǎo)致讀框移位和過(guò)早終止密碼子，破壞了Nur77蛋白的所有已知功能域(圖IA;補(bǔ)充圖S1)。qRT-PCR分析顯示nur77 mRNA水平在nur77斑馬魚中顯著降低(圖1B)。突變體mRNA水平的降低可能是由于無(wú)義介導(dǎo)的mRNA衰變。然后，我們?cè)u(píng)估了nur7斑馬魚在不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)變化。然而，在12、24、48、72和144 hpf階段，野生型和nur77?/?斑馬魚之間沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)表型差異(圖1C)。此外，成年nur77在形態(tài)上正常且可受精(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖1 利用CRISPR/Cas9敲除斑馬魚nur77基因。(A) Crispr-Cas9靶點(diǎn)和突變等位基因示意圖。Nur77由6個(gè)外顯子(帶框)組成。sgRNA目標(biāo)外顯子1，目標(biāo)區(qū)域的序列與所選等位基因?qū)R。目標(biāo)位點(diǎn)用紅色字體表示，PAM位點(diǎn)用藍(lán)色字體表示。獲得的nur77-/-斑馬魚突變體缺少13個(gè)bp堿基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯子過(guò)早停止。(B)通過(guò)qRT-PCR分析驗(yàn)證nur77的表達(dá)水平n=3);t檢驗(yàn)P < 0.05。(C) 12、24、48、72、144 hpf發(fā)育階段WT和nur77-/-的形態(tài)。比例尺表示750 μm。

野生型和nur77?/?幼魚的轉(zhuǎn)錄組

為了進(jìn)一步探索Nur77在斑馬魚中的功能，我們對(duì)6dpf野生型和nur77?/?幼魚的總RNA進(jìn)行了高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)。這些樣本共產(chǎn)生2152萬(wàn)(M)對(duì)總原始reads，共檢測(cè)到25,9235個(gè)基因。平均基因定位率為73.3%(72.2%-74.5%)，基因唯一定位率在64.4% - 66.0%之間。主成分分析(PCA)表明，與野生型對(duì)照相比，nur77-/-突變體數(shù)據(jù)集聚類明顯(圖2A)。使用調(diào)整后的值SD.001的2倍變化閾值來(lái)定義DEGs。比較兩種基因型發(fā)現(xiàn)580個(gè)DEGs，其中nur77-/中190個(gè)上調(diào)，390個(gè)下調(diào)(圖2B;補(bǔ)充表S2)。所有差異表達(dá)基因均進(jìn)行了GO功能注釋，并被劃分為生物過(guò)程(BPs)、細(xì)胞組分(CCs)和分子功能(MFs) 3個(gè)主要功能類別?！凹?xì)胞過(guò)程”(20%)、“代謝過(guò)程”(14%)和“生物調(diào)節(jié)”(11%)是BPs涉及的主要項(xiàng)目(補(bǔ)充圖2A)?！凹?xì)胞”(27%)、“膜”(20%)和“細(xì)胞器”(10%)是CCs的前3類(補(bǔ)充圖2B)?！敖Y(jié)合”(52%)和“催化活性”(26%)是MFs的主要亞類(補(bǔ)充圖2C)。為了更好地了解nur77?/?幼魚中g(shù)o注釋的DEGs，我們將其中的580個(gè)DEGs進(jìn)行了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的經(jīng)典信號(hào)通路分析。如圖2C所示，這些DEGs顯著富集于44條不同的信號(hào)通路，這些通路與代謝、人類疾病、生物系統(tǒng)、細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理最為相關(guān)。由于代謝相關(guān)通路最為豐富，Nur77已知在多種代謝相關(guān)和能量需求的組織和細(xì)胞器中表達(dá)，包括肝臟、骨骼肌、脂肪、心臟和大腦。然后，我們?cè)谙旅孢M(jìn)一步分析了這些途徑。

圖2 nur77-/-突變體斑馬魚RNA-seq (RNA測(cè)序)分析，(A) 3個(gè)野生型和3個(gè)nur77-/-突變體RNA-seg數(shù)據(jù)集的主成分分析(PCA)圖，使用主成分1 (PC1)和主成分2 (PC2)進(jìn)行分析。(B)nur77-/-突變體和對(duì)照幼魚差異基因表達(dá)分析的火山圖，顯示了p值和對(duì)數(shù)褶變化之間的關(guān)系。紅色表示基因上調(diào)，藍(lán)色表示基因下調(diào)。(C)京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路中DEGs的富集分析。y軸表示途徑，x軸表示DEGs數(shù)量。

斑馬魚中Nur77的敲除受損的氨基酸代謝

對(duì)于氨基酸代謝，在10條氨基酸代謝通路中確定了10個(gè)DEGs(圖3A)。為了進(jìn)一步評(píng)估RNA-seq數(shù)據(jù)，我們采用qRT-PCR檢測(cè)了所選的氨基酸代謝相關(guān)基因(hadhaa, hmgcsl, aox5和ldha)。我們的qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致(圖3B)。在這10個(gè)DEGs中，有4個(gè)參與了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(ko00280)(圖3C;補(bǔ)充表S3)，包括羥?；鵆oA脫氫酶三功能多酶復(fù)合體亞單位α a (hadhaa)、羥甲基戊二酰CoA合成酶1 (hmgcs1)、乙醛脫氫酶家族9成員A1 (aldh9a1a.2)和乙醛氧化酶(aox5)。hahaa是線粒體三功能蛋白的雙功能亞基，負(fù)責(zé)長(zhǎng)鏈脂肪酸的線粒體b氧化。hmgesl催化HMG-CoA的合成。上述基因參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解途徑，并參與這些氨基酸的生糖和生酮過(guò)程。

據(jù)我們所知，Nur77與氨基酸代謝之間的關(guān)系幾乎沒(méi)有報(bào)道。為了進(jìn)一步檢測(cè)Nur77在氨基酸代謝中的作用，測(cè)定了整個(gè)幼魚的總氨基酸組成。如圖3D所示，纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)均降低。這三種氨基酸水平的降低可能與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑中基因表達(dá)水平的降低有關(guān)(圖3C)。此外，除了酪氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)之外，我們測(cè)定的許多其他氨基酸均減少(圖3D)。所有這些數(shù)據(jù)表明，在nur77?/?幼魚中氨基酸代謝失調(diào)。

圖3 Nur77調(diào)節(jié)斑馬魚幼體的氨基酸代謝。(A)氨基酸代謝富集轉(zhuǎn)錄本熱圖。顏色代表高(紅色)、低(藍(lán)色)或平均(白色)的表達(dá)值，基于每個(gè)基因的z分?jǐn)?shù)-每千堿基每百萬(wàn)映射讀取(FPKM)值的歸一化片段，z分?jǐn)?shù)指標(biāo)顯示在每個(gè)圖下。右邊顯示的是折疊變化(log2)。(B)通過(guò)qRT-PCR分析驗(yàn)證氨基酸代謝類別中差異表達(dá)基因的表達(dá)水平(n = 3)。(C)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解受到干擾。阻斷區(qū)代表轉(zhuǎn)錄編碼酶。綠色塊代表下調(diào)的基因，黑色塊代表未改變的基因。(D) WT和nur77-/-胚胎的氨基酸組成。結(jié)果用均數(shù)表示，標(biāo)準(zhǔn)誤差n3): p<0.06;"p<0.01: p<0.001，經(jīng)t檢驗(yàn)p<0.0001。

敲除Nur77損傷斑馬魚脂質(zhì)代謝

11條脂質(zhì)代謝途徑中的16個(gè)EDG被富集(補(bǔ)充表S4;圖4)。其中5個(gè)參與類固醇生物合成通路(ko00100)， 4個(gè)參與甘油脂代謝通路(ko00561)(補(bǔ)充表S4)。qRT-PCR分析結(jié)果與選定的脂質(zhì)代謝基因(ugt5al、cyp2p9、hadhaa、cyp51、sc5d、hmgcs1、Iss、lipca和sqlea)一致(圖4B)。有趣的是，所有參與膽固醇生物合成途徑的DGEs都下調(diào)了(圖4C)。角鯊烯環(huán)氧酶a (sqlea)催化膽固醇生物合成的第一個(gè)氧合步驟，并被認(rèn)為是該途徑的限速酶之一。甲基甾醇單加氧酶1 (msmol)在肝臟膽固醇生物合成中起作用。cyp51(固醇14a-去甲基化酶)作為一種細(xì)胞色素P450，對(duì)固醇的生物合成反應(yīng)至關(guān)重要，并在臨床中作為藥物靶點(diǎn)。羊毛甾醇合成酶(Iss)催化(S)-2,3氧化角鯊烯轉(zhuǎn)化為羊毛甾醇，是膽固醇、類固醇激素和維生素D生物合成中必不可少的限速酶。甾醇- c5 -去飽和酶(sc5d)在膽固醇生物合成中將膽甾醇轉(zhuǎn)化為7脫氫膽固醇，在肝臟中普遍表達(dá)。這些基因的所有改變表達(dá)都反映了膽固醇合成代謝的減少。

雖然有報(bào)道稱，喂食高脂肪飲食的Nur77缺失小鼠更容易肥胖，并且Nur77在肝臟和肌肉的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用，但脂質(zhì)含量的全身變化尚不清楚。在這里，我們比較了野生型和nur77?/?幼魚之間的TC和TG含量。nur77?/?幼魚的TC和TG顯著升高，如圖4D、E所示。nur77?/?較高的膽固醇水平可能抑制了膽固醇的合成代謝，從而降低了膽固醇生物合成途徑基因的表達(dá)(圖4D)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Nur77敲除損害了斑馬魚的脂質(zhì)代謝。

圖4 Nur77調(diào)節(jié)斑馬魚幼體的脂質(zhì)代謝。(A)脂質(zhì)代謝富集轉(zhuǎn)錄本熱圖。顏色代表高(紅色)、低(藍(lán)色)或平均(白色)表達(dá)值，表達(dá)值基于每個(gè)基因的每千堿基每百萬(wàn)映射讀取(FPKM)值的z評(píng)分歸一化片段。Z-score指標(biāo)顯示在每個(gè)圖譜的下方。折疊變化(log2)顯示在右邊。(B)通過(guò)gRT-PCR分析驗(yàn)證脂質(zhì)代謝類別中差異表達(dá)基因的表達(dá)水平(n=3)。(C)受干擾的膽固醇生物合成。阻滯區(qū)代表轉(zhuǎn)錄編碼酶。綠色塊代表下調(diào)的基因，黑色塊代表未改變的基因。(D) WT和nur77-/-斑馬魚(n-3)的全身膽固醇(TC)含量。(E) WT和nur77-/-斑馬魚的全身總甘油三酯(TG)含量。結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)誤差的平均值表示(n=3);P <0.05, P <0.001, t檢驗(yàn)p < 0.0001。

敲除Nur77會(huì)損害斑馬魚的碳水化合物代謝

在12個(gè)碳水化合物代謝途徑中有4個(gè)上調(diào)的deg和15個(gè)下調(diào)的deg參與(補(bǔ)充表S5;圖5 a)。我們選擇的碳水化合物代謝基因的qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致(圖5B)。在富集的通路中，前2位為糖酵解/糖異生(ko00010)(9個(gè)基因)和胰高血糖素信號(hào)通路(ko04922)(6個(gè)基因)，均參與糖代謝(補(bǔ)充表S5)。在糖酵解/糖異生通路中，所有DEGs的表達(dá)水平均降低，包括葡萄糖激酶(gck);丙酮酸激酶肌b (pkmb);磷酸果糖激酶，肌a/b (pfkma/b);葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶b (gpib);乳酸脫氫酶A;磷酸甘油酸變位酶(pgam2)、類乙酰輔酶a羧化酶(accl);乙醛脫氫酶9串聯(lián)重復(fù)序列2 (tandem duplicate 2, aldh9a1a.2);乙酰輔酶a羧化酶樣醛縮酶a、果糖二磷酸(aldoaa)(圖5C)。Gck、pkmb和pfkma/b是糖酵解/糖異生途徑中的關(guān)鍵酶。GCK是己糖激酶家族的一員，它在胰腺β細(xì)胞和肝細(xì)胞中磷酸化葡萄糖以產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸。Pfkma /b是磷酸果糖激酶的一種異構(gòu)體，通過(guò)糖酵解途徑將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-1,6-二磷酸。pkmb催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP轉(zhuǎn)化為丙酮酸和ATP，這是糖酵解的最后一步。綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示了斑馬魚的Nur77缺陷導(dǎo)致碳水化合物代謝紊亂，尤其是在葡萄糖代謝方面。

為了證實(shí)RNA-seq的數(shù)據(jù)，我們隨后測(cè)定了野生型和nur77?/?幼魚的總游離葡萄糖。如圖5D所示，nur77?/?的葡萄糖水平顯著高于野生型。游離葡萄糖升高可能是由于糖酵解/糖異生障礙，葡萄糖攝取受損，胰島素分泌減少。由于信號(hào)通路分析表明糖酵解/糖異生通路受損(圖5C)，因此我們進(jìn)一步研究了nur77?/?斑馬魚的葡萄糖攝取功能，并根據(jù)Lee等人進(jìn)行了2-NBDG攝取測(cè)定。正如晶狀體的熒光強(qiáng)度所示，在nur77?/?組中，葡萄糖攝取沒(méi)有顯著增加(圖5E, F)。這些數(shù)據(jù)表明，較高水平的游離葡萄糖在nur77?/?幼魚不是由于葡萄糖攝取，但可能受到糖酵解/糖異生或β細(xì)胞功能的影響。

圖5 Nur77調(diào)節(jié)斑馬魚幼體的碳水化合物代謝。(A)碳水化合物代謝富集轉(zhuǎn)錄本的熱圖。顏色代表高(紅色)、低(藍(lán)色)或平均(白色)表達(dá)值，表達(dá)值基于每個(gè)基因的每千堿基每百萬(wàn)映射讀取(FPKM)值的z評(píng)分歸一化片段。Z-score指標(biāo)顯示在每個(gè)圖譜的下方。折痕變化(og2)顯示在右側(cè)。(B)通過(guò)qRT-PCR分析驗(yàn)證碳水化合物代謝(n-3)類別中差異表達(dá)基因的表達(dá)水平。(C)受干擾的糖酵解/糖異生。塊表示轉(zhuǎn)錄編碼酶。綠色塊代表下調(diào)的基因，黑色塊代表未改變的基因。(D) WT和nur77-/-斑馬魚的總游離葡萄糖含量(n3)。(E)野生型和nur77-/-突變體幼魚2-NBDG葡萄糖攝取;葡萄糖攝取水平由熒光顯微鏡成像的晶狀體(箭頭)的熒光表示。對(duì)照組采用Wildtype和不含2-NBDG的nur77(上圖)。(F)根據(jù)圖像測(cè)量眼睛熒光強(qiáng)度。WT和nur77-/-斑馬魚幼魚熒光強(qiáng)度的定量測(cè)定。結(jié)果用均值表示，標(biāo)準(zhǔn)誤差n= 3);n = 3，無(wú)顯著性;“p< 0.05”，p< 0.01,p<0.001, p<0.0001經(jīng)t檢驗(yàn)。

敲除Nur77損傷斑馬魚β細(xì)胞功能

然后我們轉(zhuǎn)向分析RNA-seq數(shù)據(jù)中胰島素信號(hào)通路中的EDG。有趣的是，insb、gck和accl顯著降低(圖6A)。我們進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR證實(shí)了nur77?/?幼魚中insb的表達(dá)水平下降，而insa的表達(dá)水平?jīng)]有下降(圖6B, C)。接下來(lái)，我們通過(guò)免疫熒光法評(píng)估胰島素含量。從圖6D、E中，我們發(fā)現(xiàn)nur幼魚的胰島素含量明顯低于野生型幼魚。我們進(jìn)一步研究了nur77?/?斑馬魚的b細(xì)胞質(zhì)量是否有變化。我們將nur77?/?與b細(xì)胞報(bào)告系雜交Tg(Ins:H2BmCherry)。nur77?/?中β細(xì)胞數(shù)量明顯減少;Tg(Ins: H2BmCherry)(圖6F, G)。此外，為了測(cè)量胰島素分泌，使用鈣內(nèi)流報(bào)告線的實(shí)時(shí)成像Tg(Ins: GCaMP6s)。當(dāng)胰腺β細(xì)胞響應(yīng)葡萄糖分泌胰島素時(shí)，鈣的內(nèi)流導(dǎo)致綠色熒光發(fā)射增加。而且，熒光強(qiáng)度與胰島素分泌量成正比。如圖6H、1所示，用5 mM葡萄糖ECS溶液處理6 dpf斑馬魚胚胎時(shí)，兩種Tg(Ins:H2BmCherry)的綠色熒光無(wú)明顯差異;Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77?/?;Tg(Ins: H2BmCherry): Tg(Ins:GCaMP6s)。而經(jīng)20 mM葡萄糖ECS溶液刺激后，在Tg中產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色信號(hào)(Ins:H2BmCherry);Tg(Ins:GCaMP6s)，但在nur77?/?中熒光弱;Tg(Ins:H2BmCherry);Tg(Ins: GCaMP6s)(補(bǔ)充視頻1,2)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明敲除nur77會(huì)損害β細(xì)胞功能，包括insb表達(dá)下調(diào)、β細(xì)胞質(zhì)量減少和胰島素分泌抑制。

圖6 Nur77調(diào)節(jié)斑馬魚幼魚胰島素分泌和β細(xì)胞數(shù)量。(A)胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄本熱圖。顏色代表高(紅色)、低(藍(lán)色)或平均(白色)表達(dá)值，基于每個(gè)基因的每千堿基每百萬(wàn)映射讀取(FPKM)值的z分?jǐn)?shù)歸一化片段。(B, C) WT和nur77-/-斑馬魚幼魚中胰島素基因的qRT-PCR表達(dá)水平驗(yàn)證，(B) insa (n = 3)， (C)和insb (n = 3)。(D, E) WT和nur77-/-斑馬魚幼魚中胰島素含量。(D)對(duì)照和nur77-/-α細(xì)胞和β細(xì)胞的代表性熒光圖像;用Tg(gcg:eGFP)標(biāo)記α細(xì)胞為綠色熒光，用胰島素抗體免疫染色標(biāo)記β細(xì)胞為紅色熒光。(E)對(duì)照和nur77-/-的β-細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量。幼魚數(shù)(n = 12~18)。(F, G) Tg(Ins:H2BmCherry)和nur77-/-;Tg(Ins:H2BmCherry)斑馬魚幼魚胰腺β細(xì)胞數(shù)量。(F) 6 dpf時(shí)β細(xì)胞(紅色)在Tg(Ins:H2BmCherry)和nur77-/-;Tg(Ins:H2BmCherry)中的數(shù)量的代表性圖像。(G)測(cè)定4 ~ 7 dpf斑馬魚幼魚(n = 19~50) Tg(Ins:H2BmCherry)和nur77-/-;Tg(Ins:H2BmCherry)中β-細(xì)胞數(shù)量。(H, I)葡萄糖刺激β細(xì)胞中Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77-/-、Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)的GCaMP6s反應(yīng)。(H) GCaMP6s在β細(xì)胞中對(duì)Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77-/-、Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)在5或20 mM葡萄糖ECS溶液中反應(yīng)的代表性圖像;綠色信號(hào)為GCaMP6。(I)定量測(cè)定β細(xì)胞中Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77-/-nur77-/-、Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)對(duì)GCaMP6s的響應(yīng)(GFP熒光強(qiáng)度)。結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)誤差的平均值表示(n = 13~20);n，沒(méi)有意義;* * * * * p < 0.01, p < 0.001, t * * * * p < 0.0001。

β細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)Nur77足以挽救nur77?/?突變體的缺陷

接下來(lái)，我們想知道僅僅在β細(xì)胞中表達(dá)Nur77是否足以挽救nur77?/?突變體的β細(xì)胞缺陷。我們生成了一個(gè)轉(zhuǎn)基因系Tg(Ins:Nur77;cmlc2:eGFP)，其目標(biāo)在斑馬魚β細(xì)胞中僅在斑馬魚胰島素啟動(dòng)子控制下表達(dá)人類Nur77 cDNA, cmlc2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eGFP被用作轉(zhuǎn)基因載體的指示(圖7A)。有趣的是，當(dāng)Nur77在野生型背景下的β細(xì)胞中靶表達(dá)時(shí)，β細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有變化(對(duì)照與Tg(Ins: Nur77))(圖7B, C)。然而，在nur77突變背景下，nur77?/?;Tg(Ins: nur77);Tg(Ins:H2BmCherry)顯著增加了b細(xì)胞數(shù)量，其數(shù)量與對(duì)照組相似(圖7B, C)。此外，當(dāng)我們通過(guò)免疫熒光測(cè)定胰島素含量時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)nur77?/?Tg(Ins: nur77)幼魚顯著恢復(fù)了它們的胰島素?zé)晒鈴?qiáng)度(圖7D, E)。其游離葡萄糖水平也恢復(fù)到對(duì)照組的相似水平(圖7F)。這些數(shù)據(jù)表明，β細(xì)胞功能受損可能與nur77的缺失有關(guān)。

圖7 β細(xì)胞中靶向表達(dá)Nur77可恢復(fù)斑馬魚β細(xì)胞數(shù)量和胰島素含量。(A) Tg(Ins: Nur77;cmlc2:eGFP)轉(zhuǎn)基因系及其表達(dá)模式。Nur77的表達(dá)由斑馬魚胰島素啟動(dòng)子控制，cmlc2驅(qū)動(dòng)的eGFP被用作轉(zhuǎn)基因載體的指示。(B, C) β細(xì)胞數(shù)量在Tg(Ins:H2BmCherry)、nur77-/-、Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins: nur77)、Tg(Ins:H2BmCherry)、nur77-/-中的代表性圖像(B)和定量(C);Tg(Ins: Nur77);Tg(Ins:H2BmCherry)斑馬魚幼魚。幼魚數(shù)(n = 20~30)。(D, E) Tg(gcg:eGFP)、nur77-/-、(gcg:eGFP)、Tg(Ins: nur77)、Tg(gcg:eGFP)和nur77-/-的β細(xì)胞胰島素?zé)晒鈴?qiáng)度的代表性圖像(D)和定量(E);Tg(Ins: Nur77);Tg(gcg:eGFP)斑馬魚幼魚。用Tg(gcg:eGFP)表示胰腺α細(xì)胞，用胰島素抗體免疫染色用紅色熒光表示胰腺β細(xì)胞(n = 12~15)。(F) Tg(gcg:eGFP)、nur77-/-、(gcg:eGFP)、Tg(Ins: nur77)、Tg(gcg:eGFP)、nur77-/-中游離葡萄糖的總含量;Tg(Ins: Nur77);Tg(gcg:eGFP)斑馬魚幼魚(n = 3). ns，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;單因素方差分析**p < 0.01， **p < 0.001。

我們進(jìn)一步分析了在四個(gè)簇中表達(dá)的頂級(jí)標(biāo)記基因，發(fā)現(xiàn)一些基因主要特異性地表達(dá)在其中一個(gè)簇中，例如，tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和簇7(圖3B, S3)。功能富集分析顯示，上述4個(gè)細(xì)胞簇中表達(dá)的很多基因具有毛細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)功能(圖3C-F)，這表明這些細(xì)胞是毛細(xì)胞。為了進(jìn)一步確認(rèn)毛細(xì)胞的聚類和注釋，我們進(jìn)行了全載原位雜交(WISH)。zpld1a基因主要在嵴毛細(xì)胞中表達(dá)，根據(jù)我們的分析，嵴毛細(xì)胞被認(rèn)為位于簇12(圖3H)，這與之前的研究一致。至于簇0和7的細(xì)胞，雖然都是神經(jīng)肥大毛細(xì)胞，但它們之間存在差異。根據(jù)成熟和年輕毛細(xì)胞標(biāo)志物s100s和prox1a在兩個(gè)簇中的表達(dá)情況，簇0的細(xì)胞被歸類為成熟神經(jīng)肥大毛細(xì)胞，簇7被歸類為年輕神經(jīng)肥大毛細(xì)胞(圖S4)。

另一方面，我們分析了支持細(xì)胞的標(biāo)記基因klf17，發(fā)現(xiàn)它主要表達(dá)在簇1的細(xì)胞中(圖S5)，這表明這一簇細(xì)胞是支持細(xì)胞。同樣，我們還分析了據(jù)報(bào)道在套細(xì)胞中表達(dá)的基因，如tnfsf10、ponzr6、pkhd1l1、fat1b、crb3b、cts12、ovgp1和cldne，發(fā)現(xiàn)高水平表達(dá)這些基因的細(xì)胞聚集在簇9中(圖S6)。然而，它們表達(dá)了一些已被證明在毛細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，如myo6b、myo7aa(圖S7)，這提出了它們是可以分化為毛細(xì)胞的支持細(xì)胞的可能性。因此，我們得出結(jié)論，來(lái)自簇1和9的細(xì)胞分別是支持細(xì)胞和套細(xì)胞，來(lái)自簇14的細(xì)胞可能是毛細(xì)胞祖細(xì)胞。

討論

討論與結(jié)論肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等代謝性疾病在世界范圍內(nèi)日益增多，正在成為一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。因此，迫切需要開發(fā)新的治療方法和新的藥物靶點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)證明，孤兒核受體Nur77參與多種代謝過(guò)程，特別是碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝。雖然Nur77是一個(gè)孤兒核受體，幾個(gè)小分子已經(jīng)被確定為Nur77。代謝方面，CsnB來(lái)自dothiirella sp. HTF3已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶向Nur77以增加空腹小鼠的血糖。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，另一種Nur77激動(dòng)劑celastrol可以顯著降低HFD小鼠的體重、脂肪組織質(zhì)量和脂肪細(xì)胞大小。因此，Nur77作為代謝性疾病的新藥物靶點(diǎn)可能具有很大的潛力。為了全面了解Nur77和代謝，以及篩選小分子藥物，我們制作了Nur77敲除斑馬魚，并應(yīng)用RNA-seq分析揭示了Nur77的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。雖然氨基酸缺乏會(huì)誘導(dǎo)nur77相關(guān)的網(wǎng)狀吞噬來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平，但沒(méi)有關(guān)于nur77調(diào)節(jié)氨基酸代謝的研究報(bào)道。這是第一次給出nur77相關(guān)氨基酸調(diào)控的改變基因的全局視圖。在我們的研究中，幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸代謝基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(圖3A)。這些基因不僅在氨基酸代謝途徑中發(fā)揮功能，而且在葡萄糖和脂質(zhì)代謝中也發(fā)揮作用。例如，hahaa, hmgcsl, aldh9ala。2、aox5(圖3C)均在纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解途徑中;然而，這些途徑的下游分子與脂肪酸代謝和三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))相互串?dāng)_。因此，Nur77參與了細(xì)胞內(nèi)氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝途徑的串?dāng)_。多項(xiàng)研究揭示了Nur77信號(hào)通路在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物脂質(zhì)代謝中的重要作用。類似地，我們還觀察到nur77 null幼魚的脂質(zhì)代謝功能障礙，表明膽固醇、甘油脂、類固醇和脂肪酸代謝通路發(fā)生了改變(補(bǔ)充表S4)。DEGs中有5個(gè)參與膽固醇生物合成，包括lss、cyp51、sqlea、sc5d和hmgcs1(圖4C)。此外，脂肪酸代謝中的4個(gè)DEGs富集，包括acc、ppt、hadhaa和aldh (Supplementary Table S4)。據(jù)報(bào)道，Nur77參與調(diào)節(jié)β-氧化，促進(jìn)葡萄糖剝奪下黑色素瘤細(xì)胞的存活。也有報(bào)道稱，Nur77在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控卵巢卵泡細(xì)胞中的類固醇生成酶。這些基因在膽固醇生物合成和脂肪酸代謝中的表達(dá)水平變化可能與敲除nur77的斑馬魚TC和TG含量升高有關(guān)(圖4D, E)。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，無(wú)論是在肝臟還是脂肪組織中，Nur77缺失小鼠在高脂肪飲食后，TC和TG都會(huì)升高。綜上所述，Nur77功能的破壞導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常。

19個(gè)EDG在碳水化合物代謝中富集，其中大部分與葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(guān)(圖5A)。的確，nur7斑馬魚突變體的總游離葡萄糖升高(圖5D)，正常血糖是通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)肝臟葡萄糖產(chǎn)生和肌肉和脂肪組織的葡萄糖攝取來(lái)維持的(6668)。導(dǎo)致血糖升高的因素有多種，如葡萄糖攝取增加、糖酵解減少、糖異生增加、胰島素抵抗和胰島素缺乏。通路分析表明糖酵解/糖異生通路受損(圖5C)。參與糖酵解的基因，包括ldha、pkmb、pgam2和gok，在nur7斑馬魚突變體中都減少了，這表明糖分解代謝減少了。然而，參與糖異生的兩種主要限速酶pepck和gopc在nur77斑馬魚中沒(méi)有變化(圖5C)。這些數(shù)據(jù)表明糖酵解的減少可能導(dǎo)致葡萄糖升高。此外，我們還通過(guò)2-NBDG攝取試驗(yàn)檢測(cè)了葡萄糖攝取，但野生型和nur77斑馬魚之間沒(méi)有顯著差異(圖5E, F)。

我們進(jìn)一步證明，nur77?/?斑馬魚中葡萄糖的增加與β細(xì)胞功能受損有關(guān)(圖6,7)。在敲除nur77的斑馬魚幼魚中，β細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖6F, G)。此外，我們發(fā)現(xiàn)敲除Nur77下調(diào)了insb的表達(dá)。降低了斑馬魚β細(xì)胞中的胰島素含量，并減少了胰島素分泌(圖6)。與我們的研究結(jié)果一致，研究報(bào)告了Nur77的整體敲除導(dǎo)致新生和幼齡小鼠b細(xì)胞面積減少。敲低Nur77抑制了Ins-1細(xì)胞系中?-細(xì)胞的增殖，阻礙了線粒體中ATP的產(chǎn)生，從而抑制了葡萄糖刺激的胰島素分泌。Nur77被認(rèn)為可以防止活性氧(ROS)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的?-細(xì)胞凋亡。然而，一項(xiàng)研究報(bào)道，Nur77的遺傳缺失在小鼠的β細(xì)胞中與WT幼崽相比沒(méi)有表現(xiàn)出任何形態(tài)學(xué)差異。然而，這一結(jié)論僅基于胰島素免疫染色。

此外，我們證明了Nur77在β細(xì)胞中的靶向表達(dá)挽救了β細(xì)胞功能的缺陷，并恢復(fù)了正常的葡萄糖水平d圖)。雖然Nur77調(diào)節(jié)b細(xì)胞功能的詳細(xì)機(jī)制需要進(jìn)一步闡明，但已有研究表明Nur77與許多重要的b細(xì)胞相互作用轉(zhuǎn)錄因子，如mafA和Nkx6.1。據(jù)報(bào)道，脂肪酸刺激增加了Nur77的表達(dá)，然后Nur77與FoxOl相互作用降低細(xì)胞內(nèi)mafA蛋白的濃度，從而阻止胰島素基因的激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胰島素濃度下降和胰島素分泌受損。大鼠胰腺中Nkx6.1的過(guò)表達(dá)通過(guò)Nur77及其同源的Norl誘導(dǎo)β細(xì)胞增殖。Nur77在斑馬魚b細(xì)胞中的靶表達(dá)可以恢復(fù)?-細(xì)胞功能，這可能是由于Nur77與這些β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子一起重現(xiàn)。

結(jié)論

總之，我們對(duì)野生型和nur77?/?突變型幼魚進(jìn)行了全生物體RNA測(cè)序。通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)與野生型相比，nur77?/?中代謝相關(guān)通路中許多基因的表達(dá)改變了兩倍以上。這些基因主要與氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝有關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法，我們發(fā)現(xiàn)nur77?/?突變體表現(xiàn)出TC和TG增加，總氨基酸改變和葡萄糖升高。此外，我們證明葡萄糖升高不是由于葡萄糖攝取的改變，而是由糖酵解/糖異生障礙和?-細(xì)胞功能受損引起的，包括insb表達(dá)下調(diào)、?細(xì)胞質(zhì)量減少和胰島素分泌抑制。此外，我們還驗(yàn)證了在β細(xì)胞中靶向表達(dá)Nur77足以挽救全局nur77?/?突變體的β細(xì)胞缺陷。這些結(jié)果為調(diào)控Nur77信號(hào)的全球代謝網(wǎng)絡(luò)以及Nur77在b細(xì)胞功能中的作用提供了新的信息。因此，nur77敲除斑馬魚模型將成為進(jìn)一步研究nur77相關(guān)代謝調(diào)控機(jī)制和篩選nur77相關(guān)小分子化合物的系統(tǒng)、經(jīng)濟(jì)、有效的動(dòng)物模型。

基金：本研究獲得福建省自然科學(xué)基金(資助號(hào):2020J01042 ~ JL 2019J01036 ~ YX)資助。國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81670709至ML)，福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(2021MB02至ML)，廈門市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目3502Z20184027。

本文章原文：Frontiers in Endocrinology | www.frontiersin.org

詳細(xì)網(wǎng)址：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2022.864631/full

注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。

上一篇：【文獻(xiàn)解讀】斑馬魚過(guò)......

下一篇：【文獻(xiàn)解讀】在斑馬魚......