雜志：Redox Biology
影響因子：11.4（2022）
年份：2020
通訊作者：Jens Kroll
通訊作者單位：Department of Vascular Biology and Tumor Angiogenesis, European Center for Angioscience (ECAS), Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, Mannheim, Germany
摘要
甲基乙二醛（MG）形成的增加與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)。在斑馬魚中，敲除主要的MG解毒系統(tǒng)乙二醛酶1，導(dǎo)致MG升高有限，但乙醛脫氫酶（ALDH）活性和aldh3a1的表達顯著升高，提示Aldh3a1在糖尿病中的代償作用。為了評估Aldh3a1在葡萄糖穩(wěn)態(tài)和糖尿病中的作用，我們使用CRISPR-Cas9生成了aldh3a1?/?斑馬魚突變體。用斑馬魚轉(zhuǎn)基因報告株系分析了血管系統(tǒng)和胰腺形態(tài)。分別進行相應(yīng)的活性羧基類物質(zhì)（RCS）、葡萄糖、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)篩選，并測定ALDH活性以供進一步驗證。aldh3a1?/?斑馬魚幼魚表現(xiàn)出視網(wǎng)膜血管舒張性改變，葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，這可通過pdx1沉默誘導(dǎo)的高血糖而加重。出乎意料的是，MG沒有改變，但另一種與Aldh3a1高親和力的脂質(zhì)過氧化RCS， 4-羥基壬烯醛(4-HNE)在Aldh3a1突變體中增加。4-HNE通過胰腺破壞引起的高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜表型，可以通過l -肌肽治療來挽救。此外，在2型糖尿病患者中，血清4-HNE升高并與疾病進展相關(guān)。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，從遺傳易感性到病理進展，4-HNE解毒功能受損和4-HNE濃度升高可作為生物標(biāo)志物，也是糖尿病的可能誘導(dǎo)劑。
關(guān)鍵詞：Aldh3a1；活性碳基物種；4-羥基壬烯醛；葡萄糖穩(wěn)態(tài)；糖尿病
引言
20-79歲人群的糖尿病患病率正在迅速上升，從2000年的1.51億（占全球人口的4.6%）上升到2019年的4.63億（9.3%），預(yù)計到2045年將達到7億（10.9%）。糖尿病患者發(fā)生微血管和大血管并發(fā)癥的風(fēng)險增加，這可導(dǎo)致失明、腎衰竭和下肢截肢。例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，也是工作年齡人群視力下降的主要原因。由于嚴重DR患者因身體、情感和社會健康狀況下降以及衛(wèi)生保健資源增加而導(dǎo)致生活質(zhì)量下降，因此早期診斷和及時治療DR對于預(yù)防視力障礙和失明至關(guān)重要。
甲基乙二醛（MG）是一種活性碳基（RCS），是晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的主要前體。糖尿病患者血漿和組織中MG升高，和AGEs與微血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。除了乙二醛酶、MG中心解毒系統(tǒng)外，MG還可以通過醛酮還原酶和醛脫氫酶（ALDH）進行解毒。最近的一項研究顯示敲除乙二醛酶1（Glo1）只導(dǎo)致斑馬魚的MG升高了1.5倍。而在glo1突變體中，ALDH活性增加了2倍，aldh3a1的表達顯著增加，這表明aldh3a1是相應(yīng)RCS解毒的替代蛋白。
除了MG外，醛脫氫酶還具有RCS底物的譜，如乙醛和4-羥基壬烯醛（4-HNE）。4-HNE作為最突出的脂質(zhì)過氧化特異性醛，在過去40年的中受到了廣泛的關(guān)注，在病理條件下導(dǎo)致細胞凋亡、線粒體功能障礙、炎癥和蛋白酶體功能障礙等損傷作用。由于4-HNE具有較高的反應(yīng)性，它與多種疾病的進展有關(guān)，包括但不限于阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）、心臟病、動脈粥樣硬化、癌癥和糖尿病。
4-HNE在糖尿病中的作用尚不清楚，初步數(shù)據(jù)也表明存在濃度依賴性效應(yīng)。低于細胞毒性量，4-HNE通過活性過氧化物酶體增殖激活受體δ（PPARδ）復(fù)合物對高糖發(fā)生反應(yīng)，最終增加INS-1E細胞的胰島素分泌。4-HNE與糖尿病腎病、神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)。然而，為了分析內(nèi)源性4-HNE增加的體內(nèi)損傷機制，目前還缺乏合適的動物模型。醛脫氫酶3家族，成員A1（Aldh3a1）是一種代謝酶，主要將有毒的脂質(zhì)過氧化醛氧化為相應(yīng)的羧酸。一些研究已經(jīng)證明，ALDH3A1對4-HNE具有較高的親和力，但對丙二醛（MDA）的解毒能力較低，以支持其多面功能。然而，目前尚不清楚永久敲除Aldh3a1是否會導(dǎo)致4-HNE濃度的增加并最終導(dǎo)致糖尿病和器官損傷。
因此，本研究旨在評估斑馬魚體內(nèi)RCS水平及其敲除Aldh3a1對葡萄糖代謝和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的影響，同時探討糖尿病患者血清中4-HNE的臨床相關(guān)性。我們的數(shù)據(jù)表明，從遺傳易感性到病理進展，4-HNE解毒功能受損和4-HNE濃度升高不僅是生物標(biāo)志物，也是糖尿病的可能誘發(fā)因素。
結(jié)果
ALDH3A1酶系統(tǒng)存在于人類、小鼠和斑馬魚中，但該酶蛋白在不同物種中的相似性尚未被描述。首先，我們對氨基酸序列進行了比對，結(jié)果顯示斑馬魚Aldh3a1與人類Aldh3a1的蛋白質(zhì)相似性為61.6%，與小鼠的相似性為57.6%；作為酶編碼基因，半胱氨酸和谷氨酸的活性位點相同（圖1A）。然后，采用RT-qPCR方法，更好地了解斑馬魚中aldh3a1 mRNA水平在發(fā)育和器官分布方面的潛在表達差異。結(jié)果表明，受精后96h，ahdh3a1 mRNA比24 hpf增加3倍。而在成年魚中，大腦和眼睛是表達最多的器官，與心臟相比，它們分別顯著增加了11倍和7倍（圖1B）?？傊@些數(shù)據(jù)已經(jīng)確定了斑馬魚幼魚和成魚器官中aldh3a1的存在，并確定了以斑馬魚為模型研究aldh3a1酶系統(tǒng)的可能性。
圖1 不同物種的Aldh3a1序列比對及在斑馬魚中aldh3a1 mRNA的表達。(A) 氨基酸比對結(jié)果顯示，不同物種之間具有很高的相似性和相同的活性位點（紅色框）：第一行，斑馬魚Aldh3a1；第二行，人類ALDH3A1；第三行，小鼠ALDH3A1。(B) 野生型斑馬魚aldh3a1 mRNA表達熱圖在幼魚中從24 hpf到96 hpf呈上升趨勢，其中大腦和眼成年器官表達量最高。高表達和低表達分別顯示為粉紅色和藍色。用RT-qPCR檢測基因的表達量，并歸一化至b2m。將24只hpf野生型幼魚和心臟（成魚器官）的平均值標(biāo)準(zhǔn)化為1只；幼魚：n=3窩，30只幼魚，成魚器官：n=4，每個樣本一個器官。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，然后采用Sidak多重比較檢驗，**p < 0.01，***p < 0.001。RT-qPCR，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)；hpf，受精后數(shù)小時；b2m，β2微球蛋白。
斑馬魚中Aldh3a1基因敲除的產(chǎn)生
由于目前還不存在Aldh3a1敲除斑馬魚模型，為了探索Aldh3a1在斑馬魚和糖尿病中的作用，我們采用CRISPR-Cas9技術(shù)生成了aldh3a1?/?斑馬魚。我們設(shè)計了一個針對aldh3a1第2外顯子的CRISPR-guideRNA（gRNA）（圖2A），并將aldh3a1 gRNA與Cas9 mRNA注射到斑馬魚單細胞期胚胎的細胞中。在將F0陽性鑲嵌突變體與野生型雜交后，我們鑒定了aldh3a1的不同突變，選擇11個堿基插入（圖2A）作為移碼突變進行進一步繁殖和實驗，通過基因分型PCR（圖2B）進行區(qū)分，從而形成終止密碼子（圖2C）。在96 hpf時，純合子和野生型斑馬魚幼魚的大體形態(tài)無差異（圖2D）。并對F2第一代進行了基因型計數(shù)。4月齡時，野生型、異型和純合子成魚的數(shù)量分別為14條、27條和12條，符合孟德爾遺傳(圖2E)，表明aldh3a1?/?突變體沒有生存逆境。為了評估在aldh3a1突變體中插入11個堿基是否導(dǎo)致翻譯后aldh3a1蛋白無功能，以乙醛為底物測定了總ALDH活性，aldh3a1突變體展現(xiàn)出30%顯著降低（圖2F）。以上這些都證明了aldh3a1基因敲除突變體的成功產(chǎn)生。
圖2 利用CRISPR-Cas9技術(shù)生成Aldh3a1敲除斑馬魚。(A)在aldh3a1的第2外顯子中設(shè)計Aldh3a1-CRISPR靶點，選擇CRISPR/cas9誘導(dǎo)的11個核苷酸插入進行進一步研究。進行基因型分析，色譜圖顯示aldh3a1野生型、雜合子和純合子測序結(jié)果。(B) 基因分型-pcr凝膠顯示了aldh3a1野生型、純合子和雜合子斑馬魚突變系的不同條帶。藍色箭頭、紫色箭頭和白色三角形分別表示aldh3a1野生型、純合子和雜合子斑馬魚的基因分型-pcr產(chǎn)物。紅色框表示標(biāo)記，下帶為200 bp，上帶為300 bp。PCR產(chǎn)物大?。阂吧?，255 bp；純合子，266 bp。(C) 氨基酸序列顯示在aldh3a1-/-的第2外顯子上有一個終止密碼子。(D) 顯微鏡圖像顯示，與96 hpf時aldh3a1+/+幼魚相比，aldh3a1-/-幼魚大體形態(tài)正常。黑色比例尺:500 μm。(E) 不同基因型的成魚數(shù)量與第一代F2的孟德爾遺傳結(jié)果一致：aldh3a1+/+ = 14、aldh3a1+/-= 27和aldh3a1-/-= 12。(F) aldh3a1-/-斑馬魚在96 hpf時斑馬魚裂解液中酶活性降低，n=6組，每組有46-50只幼魚。統(tǒng)計學(xué)分析采用Student’s-t檢驗，*p < 0.05。Bp，堿基對。PAM，原間隔子-鄰近基序。
內(nèi)源性pdx1表達沉默增強了aldh3a1?/?Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚的血管改變
我們之前的研究已經(jīng)證實，高組織葡萄糖誘導(dǎo)了斑馬魚幼魚的幾種畸形和不協(xié)調(diào)的血管結(jié)構(gòu)。為了研究Aldh3a1基因敲除和高血糖條件下可能對血管發(fā)育的影響，我們建立了一個攜帶Tg（fli1：EGFP）斑馬魚報告基因的Aldh3a1突變系來進行本實驗。在正常情況下，在96 hpf時，aldh3a1+/+和aldh3a1?/?斑馬魚幼魚的超分支無差異，但異常節(jié)段間血管（ISVs）略有增加（圖3）。由于胰腺和十二指腸同源盒1（Pdx1）是胰腺發(fā)育的必要轉(zhuǎn)錄因子，包括β細胞成熟和十二指腸分化，因此我們使用pdx1嗎啡肽瞬時沉默其表達來介導(dǎo)高血糖并模擬糖尿病狀態(tài)。而在嗎啉介導(dǎo)的pdx1沉默中，與aldh3a1+/+幼魚相比，aldh3a1?/?幼魚表現(xiàn)出增強的血管改變，超分支數(shù)量增加和異常的ISVs（圖3）。
圖3 在aldh3a1/Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚中，內(nèi)源性pdx1表達的沉默增強了軀干血管的改變。注射pdx1嗎啡啉沉默內(nèi)源性pdx1表達，導(dǎo)致96 hpf時aldh3a1-/-Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚干血管中異常isv和超分支的形成增強。(A) 代表性光學(xué)顯微鏡圖像為斑馬魚幼魚的大體形態(tài)，黑框表示共聚焦圖像中看到的區(qū)域。白色箭頭表示異常的isv，白色三角表示超分支。白色比例尺= 100 μm，黑色比例尺= 500 μm。(B–C) 圖中異常isv和超分支形成的定量；每組n=15-17。將6 ng的嗎啡啉：Control-Mo和SB-pdx1-Mo分別注入斑馬魚胚胎的單細胞期。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析后的Sidak多重比較檢驗，然后采用Sidak多重比較檢驗，**p<0.05、***p<0.01、****p < 0.0001. pdx1：胰腺和十二指腸同源盒1、ISV：節(jié)段間血管、Mo:嗎啡啉、NS，無統(tǒng)計學(xué)意義。
視網(wǎng)膜血管的擴張和收縮的自動調(diào)節(jié)減弱被認為是DR的早期跡象。為了了解aldh3a1敲除和高血糖對視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的短期影響，我們分析了120 hpf時Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚的視網(wǎng)膜玻璃樣網(wǎng)絡(luò)。aldh3a1?/?幼魚展現(xiàn)內(nèi)視環(huán)(IOC)分支變寬，通過直徑增加來量化，但與aldh3a1+/+相比，沒有變化(圖4)，這意味著aldh3a1突變體的視網(wǎng)膜血管收縮功能早期受損。嗎啡肽介導(dǎo)的pdx1沉默導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管生成性血管改變，在aldh3a1?/?幼魚中，IOC分支直徑和芽的數(shù)量增加（圖4）?？傊?，這些結(jié)果表明Aldh3a1缺失后血管發(fā)生中度改變，在高血糖條件下可增強。
圖4 aldh3a1-/-Tg（fli1：EGFP）斑馬魚內(nèi)源性pdx1表達沉默增強視網(wǎng)膜透明樣血管改變。注射pdx1嗎啡啉沉默內(nèi)源性pdx1表達，導(dǎo)致120 hpf時aldh3a1-/-Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚IOC分支直徑擴大，芽形成增加。(A) 在對照-Mo或SB-pdx1-Mo注射后，aldh3a1+/+和aldh3a1-/-幼魚中分離的透明樣血管的代表性共聚焦掃描。在120 hpf時，玻璃狀網(wǎng)絡(luò)有一個籃狀結(jié)構(gòu)，在中央玻璃狀動脈（白色盒狀）分支，并連接到包含晶狀體的內(nèi)環(huán)狀玻璃體血管（白色箭頭），在成熟的成人視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中也定期稱為IOC。幾個芽（白色三角洲）相互連接著籃狀的血管拱廊，并直接表明血管生成。白色比例條= 20 μm。(B–C) 圖中IOC分支直徑和芽形成的定量，每組n=13-15。將6 ng的嗎啡啉：Control-Mo和SB-pdx1-Mo分別注入斑馬魚胚胎的單細胞期。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，然后采用Sidak多重比較檢驗，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。Mo、嗎啉、IOC、內(nèi)視圈、NS，不顯著。
ALDH抑制、aldh3a1短暫沉默和永久敲除破壞了斑馬魚幼魚的初級內(nèi)分泌胰腺
由于尚未有攜帶胰腺轉(zhuǎn)基因報告基因的aldh3a1突變體的生成，因此對于aldh3a1在初級胰腺中的功能探索及其與Pdx1的相互作用，ALDH活性抑制和aldh3a1沉默策略至關(guān)重要。選擇兩種常見的ALDH抑制劑，棉酚和N，N-二乙基氨基苯甲醛（DEAB）進行孵育試驗。此外，為了通過反義方法短暫降低aldh3a1在斑馬魚中的表達，我們設(shè)計了兩個嗎啡啉，SB-aldh3a1-Mo#1和SB-aldh3a1-Mo#2，并分別靶向aldh3a1-201的內(nèi)含子3-外顯子4和外顯子4-內(nèi)含子4連接（圖S1A）。通過RT-PCR驗證了嗎啉的有效性（圖S1B），顯微圖像顯示注射后正常的大體形態(tài)，表明aldh3a1嗎啉沒有引起其他脫靶或毒性作用（圖S1C）。
因為Hb9（Mnx）參與了脊髓運動神經(jīng)元細胞命運規(guī)范和胰腺β細胞分化，我們首先使用Tg（hb9：GFP）轉(zhuǎn)基因報告細胞系（也稱為Tg[mnx1：GFP]）分析了原發(fā)性胰腺區(qū)域的大小。DEAB處理和兩種嗎啡啉介導(dǎo)的aldh3a1沉默導(dǎo)致初級胰腺的破壞，通過減少72 hpf時斑馬魚幼魚的尺寸來量化（圖5A-B）。然后利用Tg（ins：nfsB-mCherry）轉(zhuǎn)基因報告系進行β細胞大小分析，不僅為β細胞再生提供了合適的模型，而且是早期胰腺早期生長過程中操縱細胞相互作用的替代策略。定量后，注射SB-aldh3a1-Mo#2和DEAB處理后，早期β細胞體積明顯減少，注射SB-aldh3a1-Mo#1的斑馬魚幼魚呈后代變化趨勢（圖5A和C）。這些結(jié)果表明，aldh3a1沉默和ALDH抑制介導(dǎo)的初級形態(tài)被破壞。
胰腺在胰島素分泌中起著重要作用，因此調(diào)節(jié)葡萄糖。為了闡明Aldh3a1缺失導(dǎo)致的胰腺發(fā)育不良的后果，我們采用基于RT-qPCR的方法測定了胰島素原（ins）、胰島素原b（insb）和pdx1 mRNA的表達。我們發(fā)現(xiàn)，在48 hpf時，aldh3a1沉默和敲除ALDH活性抑制的ins和pdx1顯著減少。Insb，另一個參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的胰島素編碼基因，在發(fā)育過程中也作為促生長、存活和神經(jīng)營養(yǎng)因子，沒有改變，表明Insb不能彌補胰島素分泌的減少（圖5 D-E，圖S2）。此外，在aldh3a1?/?幼魚中，胰腺發(fā)育相關(guān)基因ISL LIM同源盒1（isl 1）和ISL LIM同源盒2a（isL2a）mRNA呈明顯的下降趨勢而與aldh3a1+/+幼魚相比，在48 hpf ISL LIM同源盒2b（isl2b）mRNA明顯降低（圖S3)。
圖5 在斑馬魚幼魚中，ALDH抑制、aldh3a1短暫沉默和永久敲除破壞了初級胰腺。(A)DEAB處理抑制ALDH，內(nèi)源性aldh3a1表達沉默導(dǎo)致Tg（hb9：GFP）原代胰腺尺寸減少，Tg（ins：nfsB-mCherry）斑馬魚幼魚β細胞團面積減少。白色框表示原發(fā)性胰腺；灰色框表示β細胞塊面積；白色刻度條= 100 μm，灰色刻度條= 50 μm。(B–C) 在圖中定量原發(fā)性胰腺(B)和β細胞質(zhì)量(C)的面積大小，每組n=12-33。(D–E).與pdx1嗎啉介導(dǎo)的沉默(E)相似，在48 hpf時，aldh3a1沉默(D)和aldh3a1永久敲除(E)斑馬魚幼魚的ins mRNA表達均顯著降低，而insb沒有改變。用RT-qPCR檢測mRNA的表達情況，并歸一化至b2m。對照mo注射(D)和aldh3a1+/+斑馬魚幼魚(E)的平均值標(biāo)準(zhǔn)化為1，n=3-6組，每組30只幼魚。每個嗎啡啉6 ng分別注入斑馬魚胚胎的單細胞階段。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，然后采用Sidak多重比較檢驗，*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001。
此外，為了了解受損的胰腺是如何在轉(zhuǎn)錄組水平上反映出來的，我們在48 hpf時對aldh3a1+/+和aldh3a1?/?的幼魚進行了全基因組RNA-Seq檢測（圖6A）。RNA-Seq概述，包括質(zhì)量控制、主成分分析（PCA）、調(diào)控基因火山圖和Top 20 KEGG通路分析，顯示aldh3a1突變體與野生型之間具有可比性特性（圖S4 A-D）。與ins表達減少的結(jié)果一致，我們通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)胰島素信號通路顯著減少（歸一化富集評分，?1.72；調(diào)整p = 0.003；圖6B-C和表S6）。有趣的是，aldh3a1突變體的內(nèi)分泌胰腺發(fā)育通路顯著下調(diào)，而非外分泌胰腺發(fā)育通路（圖6C-F）。綜上所述，這些結(jié)果進一步表明，Aldh3a1是初級胰腺發(fā)育、形態(tài)和胰島素分泌功能的重要調(diào)控因子。
圖6 aldh3a1-/-斑馬魚幼魚的胰島素信號通路和內(nèi)分泌通路下調(diào)，而外分泌胰腺發(fā)育通路不下調(diào)。(A)幼魚RNA-Seq示意圖。每組30只幼魚，5組aldh3a1+/+和6組aldh3a1-/-斑馬魚幼魚進行RNA分離。(B–C) RNA-Seq熱圖(B)顯示胰島素信號通路相對mRNA表達，通過KEGG分析顯示在aldh3a1-/-斑馬魚顯著下調(diào)(C)，**p= 0.003。(D–F).RNA-Seq熱圖顯示外分泌(D)、內(nèi)分泌(E)和全(F)胰腺發(fā)育通路中mRNA相對表達，GSEA分析內(nèi)分泌胰腺發(fā)育通路而非外分泌通路發(fā)育途徑顯著下調(diào)(C)。高表達和低表達分別顯示為粉紅色和藍色。調(diào)整p值：*p < 0.05，**p < 0.01；NS，不顯著；GSEA，基因集合富集分析；KEGG，京都基因和基因組百科全書。
敲除Aldh3a1的斑馬魚幼魚表現(xiàn)出葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，并可通過內(nèi)源性pdx1表達沉默而進一步加重
基于以上研究發(fā)現(xiàn)，Aldh3a1可以調(diào)節(jié)原發(fā)性胰腺的形態(tài)和功能，我們推測Aldh3a1的缺失可能導(dǎo)致胰腺功能障礙導(dǎo)致的葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡。在正常條件下，對aldh3a1突變體和pdx1沉默條件下進行了一系列的代謝組學(xué)篩選和葡萄糖測定。在96 hpf時，aldh3a1?/?幼魚的丙酮酸循環(huán)和糖酵解輸出呈下降趨勢（圖7A-B）。此外，在96 hpf時，aldh3a1?/?斑馬魚幼魚中的氨基酸譜顯示了幾種還原的糖生成氨基酸，包括天冬酰胺（Asn）、甘氨酸（Gln）和蛋氨酸（Met）（圖7C）。令人驚訝的是，對照嗎啉干預(yù)的aldh3a1?/?幼魚與aldh3a1+/+ pdx1沉默幼魚的ATP和ADP水平相同，而pdx1沉默的aldh3a1?/?幼魚的ATP和ADP水平顯著最低（圖7D）。這一結(jié)果表明，aldh3a1突變體的能量代謝受損，并伴有高血糖而惡化，這可能是葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損的直接反映。通過RNA-Seq GO通路富集分析進一步證實了所有這些代謝組學(xué)的變化，所有核心基因在所涉及的7個通路中均顯示logFC值均下調(diào)（圖7E）。我們還注意到硫醇、糖水平和脂肪酸的一些變化（圖S5），表明aldh3a1除了具有葡萄糖調(diào)節(jié)外，還具有代謝組學(xué)功能。
然后，在48 hpf時，測定aldh3a1?/?幼魚的葡萄糖水平增加約40%，作為葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損的直接指標(biāo)；pdx1沉默后，兩種基因型的葡萄糖水平均升高，aldh3a1?/?的葡萄糖水平比aldh3a1+/+幼魚增加約30%，表明效應(yīng)強度增強（圖7F）。最后，我們分析了糖尿病條件下aldh3a1的表達情況。通過RT-qPCR方法，我們發(fā)現(xiàn)在pdx1表達沉默后，48 hpf野生型幼魚ALDH基因的aldh3a1 mRNA增加了3倍（圖S6）。這一結(jié)果進一步表明，Aldh3a1是糖尿病患者葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。
圖7 敲除aldh3a1的斑馬魚幼魚表現(xiàn)出葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，并可通過內(nèi)源性pdx1表達沉默而進一步加重。(A)RNA-Seq GSEA分析顯示，在48 hpf時，檸檬循環(huán)和糖酵解/糖異生表達下調(diào)，(B) 丙酮酸中間產(chǎn)物在96 hpf時呈下降趨勢。(C) 在96 hpf時，aldh3a1-/-幼魚的氨基酸譜顯示出幾種還原的糖原氨基酸，包括Asn、Gln和Met。(D) 96hpf時，aldh3a1-/-的幼魚中ADP和ATP水平顯著下降，pdx1沉默時，ATP和ADP水平顯著最低；(E) 通過RNA-Seq GO通路富集分析進一步證實了這些代謝組學(xué)變化，所有核心基因在相關(guān)的7個通路中l(wèi)ogFC值均下調(diào)。(F) 在48 hpf時，aldh3a1-/-幼魚的葡萄糖水平升高，而pdx1沉默增強了受損的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。每個嗎啡啉6 ng分別注入斑馬魚胚胎的單細胞階段。統(tǒng)計分析采用配對樣本t檢驗或單因素方差分析，然后采用Sidak多重比較檢驗，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
4-HNE的升高導(dǎo)致Aldh3a1缺失后葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡
為了檢驗Aldh3a1是否可以彌補Glo1的損失的假設(shè)，作為MG解毒的替代酶，同時也為了確定導(dǎo)致原發(fā)性胰腺和葡萄糖穩(wěn)態(tài)損害的相關(guān)因素，我們測量了相應(yīng)的酶活性和RCS的濃度。出乎意料的是，在96 hpf時，aldh3a1突變體的ALDH和Glo1都沒有改變解毒MG的能力（圖8A）。此外，野生型和aldh3a1突變體之間的MG水平?jīng)]有改變，這表明MG對aldh3a1敲除導(dǎo)致的血管表型不是必需的（圖8A）。此外，該基因型上的乙二醛和3-脫氧葡萄糖酮（3-DG）均未發(fā)生改變（圖S7）。
然后，我們用4-HNE作為底物和aldh3a1突變體的4-HNE濃度來測量ALDH活性。在96 hpf時，Aldh3a1的缺失導(dǎo)致斑馬魚幼魚體內(nèi)4-HNE依賴的ALDH活性降低了約30%，內(nèi)部4-HNE濃度增加了70%（圖8B）。此外，4-HNE主要與半胱氨酸促進1,4-邁克爾添加加合物的形成，在96 hpf時，aldh3a1?/?幼魚的游離半胱氨酸減少了約20%（圖8C）。這表明超過生理數(shù)量的半胱氨酸與超過4-HNE結(jié)合，導(dǎo)致aldh3a1突變體后游離半胱氨酸水平下降。為了評估4-HNE水平升高是否導(dǎo)致aldh3a1?/?幼魚的表型，進行了一系列4-HNE孵育試驗，選擇10 μM進行實驗，因為它們有效，斑馬魚幼魚孵育后表現(xiàn)出正常的大體形態(tài)（表S1）。首先，檢測ins、insb和pdx1的表達情況。經(jīng)過4-HNE處理后，Ins和pdx1顯著降低（圖8D），這與aldh3a1的瞬時敲除和永久敲除相一致。此外，與aldh3a1突變體相似，在96 hpf的野生型幼魚中檢測到一些減少的糖原氨基酸，包括Asn和Met（圖8E）。然后，經(jīng)過4-HNE處理后，在120 hpf時，野生型幼魚的葡萄糖水平升高了2.5倍（圖8F）。最后，與Aldh3a1敲除相比，10 μM 4-HNE的孵育顯示出相似的軀干血管形態(tài)（圖S8）。
圖8 4-HNE解毒缺陷和4-HNE的升高導(dǎo)致Aldh3a1缺失后葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡。(A)aldh3a1-/-斑馬魚幼魚的ALDH活性無變化，以MG為底物時Glo1活性無變化，在96 hpf時MG量無變化。(B–C) 當(dāng)aldh3a1-/-以4-HNE為底物時，斑馬魚幼魚的ALDH活性降低，在96 hpf時4-HNE量增加，游離半胱氨酸減少，但pdx1突變體的ALDH活性和4-HNE量沒有顯著變化。(D–F).10 μM 4-HNE處理野生型斑馬魚幼魚引起：(D) 在48 hpf時，ins和pdx1 mRNA的表達降低。用RT-qPCR分析mRNA的表達情況，并歸一化至b2m；(E) 在96hpf時，糖原性氨基酸Asn和Met減少；(F) 在120 hpf時葡萄糖升高。(G) 在96hpf時，pdx1沉默的斑馬魚幼魚的4-HNE和ALDH依賴的4-HNE解毒能力沒有改變。(H) 簡明的機制流程圖顯示了Aldh3a1缺失后4-HNE解毒缺陷的后果。n=3~7組，每組30~50只幼魚 。統(tǒng)計分析采用配對樣本t檢驗。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
外源性4-HNE破壞胰腺，通過高血糖誘導(dǎo)透明樣血管改變，并可通過RCS清除劑治療來挽救
由于pdx1沉默導(dǎo)致了斑馬魚幼魚的高血糖（圖7F），并且在4-HNE處理后檢測到pdx1的表達量降低（圖8D），我們檢測到pdx1突變體中4-HNE濃度和ALDH依賴的4-HNE解毒能力。然而，它們都沒有明顯的變化（圖8G），表明高血糖在這種情況下不能調(diào)節(jié)4-HNE的量，提示4-HNE作為上游化合物，抑制pdx1的表達，破壞胰腺，增加葡萄糖。為了進一步證明4-HNE與胰腺破壞、高血糖和血管改變之間的因果關(guān)系，并排除4-HNE的非特異性副作用，我們觀察了4-HNE孵化期胰腺形態(tài)和透明質(zhì)血管，并通過RCS清掃劑和抗高血糖干預(yù)檢查是否存在拯救作用。選擇l -肌肽作為RCS的抗氧化劑和清除劑，保護組織免受4-HNE引起的氧化損傷。此外，我們選擇了PK11195作為抗高血糖藥物，它對高血糖斑馬魚幼魚的血糖水平有較強的降低作用。4-HNE處理后的斑馬魚幼魚顯示出早期原發(fā)性胰腺的尺寸降低（圖9A-C），這與aldh3a1沉默后的變化一致。1 mM -肌肽處理對Tg(hb9:GFP)和Tg(ins:nfsB-mCherry)幼魚在10 μM 4-HNE孵育后造成的胰腺破壞均有恢復(fù)趨勢(圖S9和S10);5 mM和10 mM L -肌肽能明顯恢復(fù)胰腺形態(tài)(圖9 A-C，圖S9和S10)。然而，PK11195對4-HNE誘導(dǎo)的胰腺功能障礙無拯救作用（圖9A-C）。
伴隨著外部4- HNE干預(yù)引起的高血糖(圖8F)，我們還觀察到與aldh3a1?/?斑馬魚幼魚在120 hpf時相似但嚴重的視網(wǎng)膜玻璃樣血管表型，分支直徑增加，血管互聯(lián)形成顯著增加，通過更多的芽(圖9D-F)進行量化。10 μM PK11195處理顯著恢復(fù)了芽的血管生成方面，并在10 μM 4-HNE孵育下增加了視網(wǎng)膜透明體網(wǎng)絡(luò)的分支直徑(圖9D-F)。因此，我們確定了血管生成的視網(wǎng)膜透明樣網(wǎng)絡(luò)很可能是由4- HNE孵育后的高血糖引起的。此外，我們還闡明了Aldh3a1敲除后4-HNE的解毒功能受損，而4-HNE濃度的增加是胰腺破壞的觸發(fā)器，最終導(dǎo)致高血糖和血管生成血管改變（圖8G）。
圖9 外源性4-HNE破壞胰腺，誘導(dǎo)透明樣血管改變，并可分別通過L-肌肽和PK11195治療得到挽救。(A)10 μM 4-HNE處理誘導(dǎo)Tg（hb9：GFP）原發(fā)胰腺尺寸降低，Tg（ins：nfsB-mCherry）斑馬魚幼魚β細胞質(zhì)量趨勢降低，5 mM肌肽挽救，而10 μM PK11195干預(yù)?；疑虮硎睛录毎|(zhì)量面積；白色白度條= 100 μm，灰度條= 50 μm。(B–C) 圖中早期胰腺(B)和β細胞質(zhì)量(C)的面積大小，每組=17-26。(D) 4-HNE孵育導(dǎo)致Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚在120hpf)的透明樣血管系統(tǒng)中IOC分支直徑（白色箭頭）和芽（白色三角洲）增加，通過10 μM PK11195干預(yù)挽救。白色比例條= 20 μm。(E–F) 圖中IOC分支直徑和芽的定量，每組n=10-20。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，然后采用Sidak多重比較檢驗，**<0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
糖尿病患者血清4-HNE水平升高
為了評估4-HNE水平是否也與人類糖尿病的發(fā)生有關(guān)，我們對患者的血清進行了4-HNE的測量。本研究納入海德堡大學(xué)醫(yī)院20例患者，根據(jù)病史分為對照組（n=9）和2型糖尿病（T2DM，n=11）。各組患者的年齡、性別、BMI、LDL、TG等生化結(jié)果等特征相匹配（表S2）。我們發(fā)現(xiàn)T2DM患者的血清4-HNE水平顯著高于對照組（Fig. 10A）。為進一步研究4- HNE與糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們以糖化血紅蛋白和空腹血糖作為簡單線性回歸分析的參考參數(shù)。4-HNE的積累與糖化血紅蛋白（圖10B）和空腹血糖水平（圖10C）均顯著正相關(guān)，提示4-HNE在糖尿病進展中起著至關(guān)重要的作用。再加上發(fā)現(xiàn)4-HNE阻斷斑馬魚的胰腺并導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡，我們的臨床證據(jù)進一步支持了4-HNE在糖尿病中的基本功能（圖10D）。
圖10 T2DM患者血清4-HNE水平升高。(A)T2DM患者血清4-HNE水平明顯高于對照組，采用非配對t檢驗，*p = 0.032。(B–C) 簡單線性分析顯示，4-HNE與HbA1c (B)和空腹血糖(C).呈顯著正相關(guān)。x軸表示血清4-HNE水平，y軸表示患者住院期間由海德堡大學(xué)測量的HbA1c(B)和空腹血糖(C)。11例T2MD患者和9例對照組被納入分析。(D) T2MD患者血清4-HNE水平升高。
討論
在本研究中，我們首次建立了Aldh3a1敲除斑馬魚模型，并證明了4-HNE濃度升高對斑馬魚葡萄糖穩(wěn)態(tài)和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的影響，以及4-HNE與人類糖尿病的相互作用。Aldh3a1缺失導(dǎo)致的內(nèi)源性4-HNE濃度升高，原發(fā)胰腺破壞導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，導(dǎo)致中度視網(wǎng)膜血管舒張表型，實驗性糖尿病條件通過加重葡萄糖穩(wěn)態(tài)損害增強視網(wǎng)膜血管改變。我們的臨床證據(jù)進一步證實了這些研究結(jié)果，顯示血清4-HNE升高與糖尿病的進展呈正相關(guān)。
糖尿病是一組以長期高血糖水平為特征的代謝紊亂癥。隨著全球發(fā)病率的增加，找出導(dǎo)致糖尿病高血糖的主要觸發(fā)因素變得越來越重要。與1型糖尿病(T1DM)不同，β細胞的自身免疫破壞清楚地描述了其機制，絕對胰島素缺乏使得生存需要外源性胰島素治療。2型糖尿病始于外周組織的胰島素抵抗（IR），與細胞質(zhì)量減少和細胞胰島素分泌能力受損有關(guān)。在IR的背后，一些危險因素可能通過細胞質(zhì)量的減少，從細胞凋亡，到去分化，并比2型糖尿病發(fā)病早10年。然而，這些高危因素是如何詳細參與其中的，它們是如何共同作用的，以及是否存在促進2型糖尿病胰島素抵抗的“核心因素”，仍需進一步探索。了解“因素”對葡萄糖發(fā)揮生物學(xué)作用的機制，可能有助于預(yù)防糖尿病，并確定有效的治療策略。
據(jù)我們所知，目前還沒有研究報道ALDH3A1是否能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。我們的斑馬魚研究強烈表明，在Aldh3a1缺失后，內(nèi)部4-HNE水平升高會導(dǎo)致高血糖，提供了一種與糖尿病相關(guān)的新酶。當(dāng)機體遭受高血糖時，4-HNE通常被認為是一種“護衛(wèi)”。因為高血糖從膜磷脂中釋放出非酶促過氧化的多不飽和脂肪酸(PUFA)，而PUFA的過氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物活性醛，其中4-HNE最為突出。在斑馬魚中，我們發(fā)現(xiàn)，由于Aldh3a1酶系統(tǒng)的缺失，超過4-HNE會抑制胰腺發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子Pdx1的表達，破壞胰腺原發(fā)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損。這就導(dǎo)致了一個假設(shè)，4-HNE只是一個標(biāo)記還是高血糖的真正制造者？為了回答這個問題，我們使用一種已知的降糖藥PK11195來評估降低血糖水平是否可以阻斷4-HNE的主要作用。4-HNE引起的視網(wǎng)膜血管生成血管改變可通過抗高血糖治療來挽救；強調(diào)4-HNE升高是調(diào)節(jié)高血糖水平的上游代謝物。這項研究并不是糖尿病的標(biāo)志物，而是確定了4-HNE，至少在斑馬魚中，是一種誘導(dǎo)高血糖的代謝因子。與斑馬魚的高血糖誘導(dǎo)劑相一致，4-HNE水平的升高可能是糖尿病和糖尿病并發(fā)癥患者的一個臨床特征。Lucia La Sala等人發(fā)現(xiàn)，T2DM患者的4-HNE水平明顯高于正常糖耐量患者。Morana Jaganjac等人觀察到，2型糖尿病的進展與脂肪細胞中4-HNE水平的升高相關(guān)。然而，4-HNE在2型糖尿病發(fā)病中的關(guān)鍵作用還需要進一步的研究。結(jié)果表明，4-HNE濃度升高可誘導(dǎo)大鼠-細胞凋亡和胰島素分泌受損，這可能是4-HNE與IR后的T2DM相關(guān)的可能機制。更重要的是，4-HNE作為脂質(zhì)過氧化的主要最終產(chǎn)物，被認為是氧化應(yīng)激的生物活性標(biāo)記物，并作為“活性氧（ROS）的第二信使”參與多種應(yīng)激相關(guān)疾病的氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。人體中4-HNE的積累表明脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激的存在，這兩者在一定意義上對T2DM的發(fā)生和發(fā)展起著基礎(chǔ)作用。
此外，在臨床背景下，2型糖尿病的進展與4-HNE過量之間的相關(guān)性程度尚不清楚。我們的臨床發(fā)現(xiàn)顯示，血清4-HNE水平與糖化血紅蛋白和空腹血糖相關(guān)，并提供了一些有意義的意義。首先，它表明人類在葡萄糖穩(wěn)態(tài)方面與斑馬魚具有相似的4-HNE解毒機制。利用Aldh3a1敲除斑馬魚是研究血糖積累對糖尿病器官損傷的合適疾病模型。此外，我們的研究結(jié)果建議新的臨床指標(biāo)對糖尿病評估：與以前的高危因素相比，篩查患者血清4-HNE升高，改變ALDH活動或ALDH3A1突變，和動態(tài)監(jiān)測變化，可能是有趣的尋找糖尿病前期的人狀態(tài)，以及預(yù)防糖尿病甚至并發(fā)癥的發(fā)展。最后，這項工作為糖尿病的治療提供了一個新的策略。傳統(tǒng)的治療依賴于降糖藥和胰島素增敏劑，大多數(shù)糖尿病患者需要終生服用藥物，以達到適當(dāng)?shù)难强刂?。使用ALDH活性增敏劑、肌肽等4-HNE清清劑治療糖尿病是否有效，甚至通過消除4-HNE毒性作用恢復(fù)胰腺功能，值得進一步研究。
值得注意的是，即使沒有任何高危因素，一些人也可能更容易由于多種遺傳易感性而患上糖尿病。雖然已經(jīng)鑒定出超過36個糖尿病相關(guān)基因，但只有大約10%的2型糖尿病遺傳力可以很好地解釋。據(jù)我們所知，沒有ALDH3A1突變的糖尿病報告。然而，本研究提供了關(guān)于功能失調(diào)的Aldh3a1如何損害葡萄糖穩(wěn)態(tài)的全面轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)篩選。在“易感人群”中研究ALDH3A1突變對糖尿病基因組研究具有重要意義。
總之，本研究為4-HNE濃度升高通過斑馬魚aldh3a1突變體胰腺功能障礙參與高血糖和糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生及其在糖尿病患者中的相關(guān)性提供了專利證據(jù)，為今后糖尿病的早期診斷篩查、病理生理和治療研究提供了新的方向。
材料和方法
所有患者均在海德堡大學(xué)醫(yī)院的糖尿病研究部門招募，并給予書面知情同意。招募和檢測是海德堡糖尿病和并發(fā)癥研究（HEIST-DiC）的一部分，該研究已獲當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)（倫理編號S-383/2016，ClinicalTrials.gov標(biāo)識符NCT03022721）。
所有關(guān)于動物的實驗程序均由當(dāng)?shù)卣?dāng)局、卡爾斯魯厄醫(yī)學(xué)注冊中心和曼海姆醫(yī)學(xué)院批準(zhǔn)（許可證編號：G-98/15、G-160/14和I-19/02），并按照批準(zhǔn)的指南進行。
斑馬魚飼養(yǎng)和斑馬魚品系
斑馬魚品系Tg（fli1：EGFP）、Tg（hb9：GFP）(也稱為Tg（mnx1：GFP）[56]和Tg（ins：nfsB-mCherry）在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境下進行飼養(yǎng)和分期。將胚胎/幼魚保存于28.5?C的E3培養(yǎng)基中，含/不含PTU（2.5ml，25ml），以抑制色素沉著。成年斑馬魚在光照13h/11h黑暗周期下飼養(yǎng)，早上喂活蝦，下午喂魚片食物。
Morpholinos
嗎啉包括SB-pdx1-Mo、SB-aldh3a1-Mo#1、SB-aldh3a1- Mo#2和Control-Mo（GENE工具，LLC）。所有嗎啉在0.1 M氯化鉀中稀釋至6 μg/μl。如前所述，將一納升的嗎啉注射到胚胎單細胞階段的卵黃囊中。
突變體生成
為了通過CRISPR/Cas9技術(shù)生成突變體，使用ZiFiT靶標(biāo)4.2設(shè)計了一個針對aldh3a1外顯子2的引導(dǎo)RNA（gRNA），并克隆到t7驅(qū)動的啟動子表達載體（pT7- gRNA；Ad基因）（Aldh3a1-CRISPR-for&rev，表S4）。利用pT3TSnCas9n載體（Addgene）進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得Cas9 mRNA。注射用mRNA的合成是通過使用mMESSAGE mMACHINE T3轉(zhuǎn)錄試劑盒和gRNA的MEGA短腳T7試劑盒，同時遵循制造商的協(xié)議（Invitrogen）。在單細胞階段注射1納升0.1 M含有g(shù)RNA（200 pg/nL）和Cas9 mRNA（200 pg/nL）的0.1 M KCl溶液。對F0魚進行了種系傳播和選擇性繁殖分析。通過PCR產(chǎn)物的Sanger測序（Aldh3a1-Genotyping#1.1&1.2）或凝膠電泳（Aldh3a1-Genotyping#1.3&1.4）進行基因分型（表S4）。突變通過色譜圖的評估和使用Yost工具進行分析。
幼魚胰腺和血管改變的顯微鏡觀察和分析
為了對胰腺結(jié)構(gòu)進行體內(nèi)分析，Tg（hb9：GFP）和Tg（ins：nfsB-mCherry）幼魚在72 hpf時用0.0003%三卡因麻醉。圖像是用倒置顯微鏡（徠卡DMI 6000 B）和相機（徠卡DFC420C）和徠卡LAS應(yīng)用套件3.8和4.13拍攝的。原發(fā)性胰腺和β細胞質(zhì)量尺寸分別在20x和8x處成像。使用ImageJ進行定量。
為了對斑馬魚軀干血管系統(tǒng)進行體內(nèi)成像，Tg（fli1：EGFP）幼魚在96 hpf時用0.0003%三卡因麻醉，側(cè)臥。圖像采用DM6000 B顯微鏡拍攝，徠卡TCS SP5 DS掃描儀，600 Hz，1024×512像素，1 μm厚的z堆棧。為了定量改變的干血管，我們跳過了每個斑馬魚幼魚的前5個ISVs，并計算了接下來的17對變化。新血管的發(fā)展被稱為“超分支”，節(jié)間血管的改變或錯過與其他血管的連接（認為異常和計數(shù)1點）或顯示輕微畸形（薄、厚或方向錯誤的；考慮部分異常，計數(shù)0.5點）被歸為“異常ISVs”并計數(shù)。
為了進行斑馬魚視網(wǎng)膜透明樣血管系統(tǒng)的體內(nèi)成像，Tg（fli1：EGFP）幼魚在120 hpf下用0.0003%三卡因麻醉，然后在4?C下用4% PFA/PBS固定過夜。固定的幼魚在雙蒸餾水（ddH2O）中洗滌3次20 min，在07?C的0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液（25200-056，Gibco）中孵育90 min，用0.1 M TRIS (Nr。用1M鹽酸溶液調(diào)整至pH值7.8。幼魚透明樣血管在立體鏡下解剖，并根據(jù)Jung的方案在PBS中顯示以進行可視化。共聚焦圖像的表型評估獲得使用共聚焦顯微鏡（DM6000 B）和掃描儀（徠卡TCS SP5 DS），使用20×0.7物鏡，1024×256像素，0.5 μm z步。用Image J在兩個不同位置測量IOC分支直徑，用新血管生成計數(shù)新血管，并在每個樣本的透明體圓周長內(nèi)稱為“芽”。
斑馬魚胚胎/幼魚的藥物治療
受精的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移到6孔板中，每孔約30個胚胎加入5毫升蛋水。在24 hpf時，用鋒利的鑷子去除斑馬魚胚胎的絨毛膜，并在蛋水中加入0,003%的PTU。對于4-HNE干預(yù)和挽救實驗，10 μM 4-HNE（393,204；西格瑪-奧爾德里奇），10 μM PK11195（C0424；西格瑪-奧爾德里奇），1 mM，5 mM或10 mM的L-肌肽（C9625；西格瑪-奧爾德里奇）治療從3 hpf開始，并持續(xù)到結(jié)束。對于ALDH抑制，0.25 μM或1 μM高糖醇（G8761-100MG；西格瑪-奧爾德里奇）和DEAB（D86256-100G；西格瑪-奧爾德里奇）處理在3 hpf開始，并持續(xù)到結(jié)束；每天更換培養(yǎng)基。
斑馬魚幼魚全身葡萄糖的測定
采集不同發(fā)育時間點的斑馬魚幼魚并快速冷凍。每組約20-25只幼魚在超聲勻漿器的葡萄糖檢測緩沖液中均質(zhì)，強度90%，15s 2次。葡萄糖含量根據(jù)制造商的說明（葡萄糖測定試劑盒，CBA086，Sigma-Aldrich）進行測定。
斑馬魚幼魚和患者的4-HNE測定
收集96 hpf中的斑馬魚幼魚并迅速冷凍。每組約40-50只幼魚用超聲超聲器，強度90%，15s 2次。用試劑盒中的樣品稀釋緩沖液稀釋1：20后，對患者血清進行檢測。
4-HNE的數(shù)量根據(jù)制造商的說明（4-羥基烯ELISA Kit，E4645，生物視覺）確定。
酶活性測定
在96 hpf時，每次測量約有50只斑馬魚幼魚用0.003%三卡因麻醉并迅速冷凍。ALDH活性在25?C下75mM Tris-HCl（pH 9.5）中測定，含有10mM DL-2-amino-1propanal、0.5mM NADP和2 mM MG/4 4-HNE/5 mM乙醛，通過測定340 nm下NADP的形成速率。用分光光度法測定glo1活性，監(jiān)測S-D-乳酰谷胱甘肽形成通過在235 nm處的吸光度變化。
MG、3-DG和乙二醛的測量
在96 hpf時，每次測量約有50只斑馬魚幼魚用0.003%三卡因麻醉并迅速冷凍。MG、3-DG和乙二醛的測定方法如前所述。
代謝組學(xué)分析
檢測是與海德堡生物研究中心的代謝組學(xué)核心技術(shù)平臺合作完成的。在96 hpf時，每次測量約有50只斑馬魚幼魚用0.003%三卡因麻醉并迅速冷凍。腺苷化合物、硫醇、游離氨基酸、脂肪酸和初級代謝物的測定如前所述。
逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)分析（RT-qPCR）
使用RNeasy Mini Kit按照制造商的協(xié)議（Qiagen）從TG（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚/成魚器官中分離總RNA。根據(jù)制造商的協(xié)議（Thermo科學(xué)公司），使用Maxima第一鏈cDNA合成試劑盒從1 μg RNA中進行第一鏈cDNA生成。斑馬魚的引物設(shè)計采用NCBI或羅氏通用探針文庫分析設(shè)計中心進行設(shè)計，引物列于表S5。所有樣品均使用Power SYBR?GoreerPCR主混合試劑盒在96孔反應(yīng)板上使用。qPCR反應(yīng)采用QuantStudio 3實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行。
RNA序列分析
在48 hpf時，從aldh3a1+/+和aldh3a1?/?的幼魚中分離到RNA。文庫的構(gòu)建和測序使用BGISEQ-500（北京基因組研究所，www.bgi.com，BGI）進行測序。基因表達分析由醫(yī)學(xué)研究中心（ZMF）的微陣列分析核心實驗室進行。簡而言之，主要程序是用R和生物導(dǎo)體使用NGS分析包系統(tǒng)pipeR。使用FastQC（巴布拉哈姆生物信息學(xué)）對原始測序reads進行質(zhì)量控制。使用trim_galore（版本0.6.4）刪除了低質(zhì)量的reads。將得到的reads與UCSC中的斑馬魚基因組版本danRer11進行比對，并使用卡利斯托版本0.46.1進行計數(shù)。使用limma包中的voom函數(shù)將計數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為log2-每百萬計數(shù)（logCPM）。差異表達分析采用limma軟件包進行，以α = 0.05的R.A假陽性率和FDR校正為顯著性水平。
蛋白質(zhì)序列比對
來自斑馬魚（X1WBM4_DANRE）、人類（AL3A1_HUMAN）和小鼠（AL3A1_MOUSE）的Aldh3a1蛋白的氨基酸序列來自UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.unip rot.org/）。為了進行比較，我們選擇了這些基因，并使用uniprot-自己的比對工具（http://www.uniprot.org/align/）進行比對。
軟件
對于斑馬魚aldh3a1外顯子/內(nèi)含子區(qū)域，氨基酸和其他示意圖生成，網(wǎng)站Ensembl（https://www.ens embl.org/），Biorender（https://biorender.com/），Smart (http://smart. servier.com/)和Biorender（https://www.benchling.com/）被使用。采用Leica LAS V3.8和V4.13軟件，定量分析主干血管系統(tǒng)、原發(fā)性胰腺和β細胞塊面積尺寸。使用徠卡的LAS AF Lite軟件進行截屏，Gimp進行圖像切割，ImageJ進行視網(wǎng)膜血管分析。采用“GCMS解決方案”軟件對GC/MS分析進行數(shù)據(jù)處理。
統(tǒng)計
實驗結(jié)果用均值和標(biāo)準(zhǔn)差（均值± SD）表示。不同組間的統(tǒng)計學(xué)意義采用Student’s-t檢驗或單因素方差分析（然后是事后Bonferroni，Sidak的多重比較）。臨床結(jié)果采用正態(tài)性檢驗后的連續(xù)變量比較采用簡單t檢驗，分類變量比較采用χ2檢驗。采用簡單線性分析方法計算糖化血紅蛋白、空腹血糖與4-HNE之間的相關(guān)性。采用GraphPad Prism 8.3.0進行分析，p值為0.05視為顯著性：**<0.05，***<0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
基金：該研究得到了德國基金會（CRC 1118和IRTG 1874/2）的資助。作者感謝國家留學(xué)基金委（CSC 201706280041）的支持。作者感謝伊麗莎白·洛德博士的技術(shù)援助，霍恩博士的斑馬魚維護，格諾特·波舍特博士和埃琳娜·海登賴希博士的代謝組實驗援助，伊麗莎白·克里曼克教授的患者血液采集幫助。凱倫·比貝克博士協(xié)助RT-qPCR，卡羅萊納·德拉·托雷博士協(xié)助RNA質(zhì)量控制。作者感謝卓越集群“細胞網(wǎng)絡(luò)”（海德堡大學(xué)）的代謝組學(xué)核心技術(shù)平臺和德國基金會（ZUK 40/2010-3009262）對基于UPLC的代謝物定量的支持。作者感謝曼海姆核心設(shè)施活細胞成像中心（DFG INST 91027/10-1FUGG）和斑馬魚核心設(shè)施曼海姆的支持。
原文網(wǎng)址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231720309289
注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻，以及補充圖、表可以點擊至原文查閱。
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