雜志：Journal of Bone and Mineral Researc
影響因子：6.2（2022）
年份：2019
通訊作者： Yangli Xie, Lin Chen
通訊作者單位：Laboratory of Wound Repair and Rehabilitation, State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Trauma Center, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Army Medical University, Chongqing, 400042, China
摘要
軟骨-毛發(fā)發(fā)育不全（CHH）是一種常染色體隱性干骺端軟骨發(fā)育不良，其特征是骨發(fā)育不良和許多其他高度可變的特征。負(fù)責(zé)CHH的基因是線粒體RNA加工核糖核酸內(nèi)切酶（RMRP）基因的RNA成分。目前，CHH患者的骨軟骨發(fā)育不良和骨骼外表現(xiàn)的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚；此外，目前還沒有可行的CHH動(dòng)物模型。我們建立了一個(gè)rmrp KO斑馬魚模型來研究CHH的發(fā)育機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)rmrp是咽弓的模式和塑造所必需的。軟骨內(nèi)骨骨化的異常是可變的，這取決于軟骨形成失調(diào)的程度。此外，rmrp突變通過失調(diào)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們還證明，rmrp突變上調(diào)了典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路；對(duì)Wnt/β-連環(huán)蛋白的藥理抑制可以部分緩解rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和增加椎骨礦化。我們的研究通過建立一個(gè)新的斑馬魚CHH模型，部分揭示了CHH的潛在機(jī)制，從而加深了我們對(duì)rmrp在骨骼發(fā)育中的作用的理解。
關(guān)鍵詞：軟骨毛發(fā)發(fā)育不全；RMRP；斑馬魚；骨骼發(fā)育；wnt/β-連環(huán)蛋白
背景
軟骨毛發(fā)發(fā)育不全（CHH）或mckusick型干骺端軟骨發(fā)育不良（MCD；OMIM 250250）是一種多效性常染色體隱性遺傳疾病。雖然CHH在一般人群中極其罕見，在世界范圍內(nèi)沒有精確的發(fā)病率，但計(jì)算出阿米什人和芬蘭人的攜帶者頻率分別高達(dá)1：19和1：76。CHH的臨床特征包括短肢侏儒癥和一系列骨骼外表現(xiàn)，如低毛癥、胃腸道（GI）功能障礙、免疫缺陷、貧血和惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)增加。CHH的表型變化很大。CHH最普遍的特征是不成比例的短肢矮小和短和增厚的長骨，通常在新生兒，偶爾在產(chǎn)前階段。管狀骨異常包括增寬、扇形和不規(guī)則硬化干骺端。通常，CHH患者的骨骺骨化中心在影像學(xué)上表現(xiàn)正常，骨密度基本正常。
CHH是由RMRP（線粒體RNA加工核糖核酸內(nèi)切酶的RNA成分）的純合子或復(fù)合雜合子突變引起的，RNA組成是核糖核蛋白復(fù)合核糖核酸酶線粒體RNA過程（RNase MRP）。RMRP是一種長鏈非編碼RNA（lncRNA），是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可引起遺傳性疾病的核非編碼RNA基因。到目前為止，已有133例CHH患者的突變被描述。在RMRP轉(zhuǎn)錄本中鑒定出90個(gè)，其他在RMRP啟動(dòng)子中。大多數(shù)突變發(fā)生在高度保守的區(qū)域。一些研究表明，RMRP突變導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度減少或不穩(wěn)定性。RNase MRP廣泛存在于真核生物中，并作為一種核糖核酸內(nèi)切酶，可以切割幾種RNA底物。在酵母中的研究表明，RNase MRP切割啟動(dòng)線粒體DNA復(fù)制的RNA，并通過分裂細(xì)胞周期蛋白b2 mRNA，在有絲分裂結(jié)束時(shí)的細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用。RMRP最廣為人知的功能是參與核糖體前RNA的加工，它促進(jìn)A3位點(diǎn)的切割，產(chǎn)生5.8 S rRNA的短形式。此外，RMRP可以與端粒酶相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）形成復(fù)合物，該RT發(fā)揮依賴RNA的RNA聚合酶活性，能夠產(chǎn)生雙鏈RMRP RNA，以預(yù)測依賴的方式加工成小干擾RNA。此外，RMRP RNA可以作為至少兩個(gè)其他短RNA RMRP- S1和RMRP-S2的生產(chǎn)池，它們作為miRNA具有強(qiáng)大的基因沉默活性，靶向與不同CHH表型直接相關(guān)的基因集。
迄今為止，已有幾項(xiàng)研究調(diào)查了CHH的發(fā)病機(jī)制。人類CHH白細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜顯示了幾種細(xì)胞因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的上調(diào)。CHH中核糖體處理的改變似乎與最終分化細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞周期進(jìn)程的改變有關(guān)，如淋巴細(xì)胞和軟骨細(xì)胞譜系?？死锼沟侔埠屯聹y試了不同突變的RNase MRP多蛋白特異性mRNA和rRNA的切割，顯示rRNA切割的減少與骨發(fā)育不良的程度之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，其中mRNA切割的減少與體外其他表型有關(guān)。最近，Mandy等人發(fā)現(xiàn)Rmrp RNA的表達(dá)在培養(yǎng)的ATDC5細(xì)胞的不同軟骨分化階段受到調(diào)控，提示Rmrp RNA可能是軟骨分化的重要調(diào)控因子。
目前，目前還沒有可行的CHH動(dòng)物模型。在酵母中，RMRP酵母同源物NME1功能的喪失是致命的，在小鼠E6.5之前，RMRP基因的純合子缺失是致命的。斑馬魚，由于其快速發(fā)育過程、后代數(shù)量多、外部發(fā)育、透明度和多種基因操作，是研究參與骨骼發(fā)育的基因功能的一個(gè)非常有吸引力的動(dòng)物模型。此外，斑馬魚的基因組與人類基因組的同源性約為70%：斑馬魚和哺乳動(dòng)物之間骨骼形成的分子基礎(chǔ)和關(guān)鍵調(diào)控因子似乎高度保守。最后，在骨骼特異性啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚株系的廣泛應(yīng)用，使哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中細(xì)胞和信號(hào)動(dòng)力學(xué)的體內(nèi)可視化難以解決。
在本研究中，我們建立了一個(gè)rmrp KO斑馬魚模型，以進(jìn)一步了解CHH的發(fā)育機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，rmrp突變通過失調(diào)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，破壞軟骨生成和骨骨化，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們還發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的上調(diào)參與了rmrp突變導(dǎo)致的異常軟骨生成和骨骨化。
斑馬魚株和轉(zhuǎn)基因系合成
采用AB遺傳背景的斑馬魚（Danio rerio）。轉(zhuǎn)基因株系Tg（col2a1a：EGFP）和Tg（col2a1a：mCherry）在我們實(shí)驗(yàn)室使用1.7 kb的col2a1a啟動(dòng)子生成。Tg（ostreix：EGFP）被贈(zèng)予；Tg（flk1：EGFP）之前已經(jīng)被描述。所有斑馬魚都被安置在半循環(huán)住房系統(tǒng)，并在恒溫（27°至28°）保持14：10小時(shí)的光暗周期。所有的斑馬魚品系都按照前面描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行飼養(yǎng)和維護(hù)。所有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和方案均經(jīng)抑郁醫(yī)院外科研究所機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。
RMRP的轉(zhuǎn)錄區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的多序列比對(duì)
RMRP核苷酸序列從Ensembl（http://www.ensembl.org）下載。將人類ENST0000 0363046.1、小鼠ENSMUST00000157463.1和斑馬魚ENSDART000000115550.2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄區(qū)比對(duì)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-300用于啟動(dòng)子區(qū)域比對(duì)。采用Clustal W軟件（www.clustal.org）進(jìn)行多序列比對(duì)。共識(shí)元素用BoxShade（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）突出顯示。人類RMRP和斑馬魚RMRP的二級(jí)結(jié)構(gòu)從Ensembl下載，結(jié)構(gòu)信息主要來自Rfam（https://rfam.xfam.org/）提供的協(xié)方差模型。
原位雜交和抗體染色
擴(kuò)增反義探針合成模板并克隆到pGEMT-easy載體（Promega，F(xiàn)itchburg，WI，USA）中。所有的探針序列可從相應(yīng)的作者的要求。地高辛標(biāo)記的探針通過體外轉(zhuǎn)錄生成（DIG RNA標(biāo)記試劑盒；羅氏分子診斷公司，布蘭奇堡，新澤西州，美國）；原位雜交如前所述進(jìn)行。圖像是使用立體發(fā)現(xiàn)20顯微鏡（卡爾蔡司，奧伯科琴，德國）拍攝的。全貼式抗體染色如前所述。胚胎首先與II型膠原蛋白抗體孵育（1：300）和Axin 2（1：300），然后與Alexa熒光偶聯(lián)的二抗（1：500；美國加州，卡爾斯巴德）孵育。
利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成rmrp突變體
如前所述，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向Rmrp的酶促位點(diǎn)，生成Rmrp突變體。培養(yǎng)攜帶缺失突變的奠基魚（F0）和相應(yīng)的F1胚胎。將雜合子rmrp突變的F1魚進(jìn)行雜交，鑒定具有表型的突變體。
Edu細(xì)胞增殖試驗(yàn)和TUNEL試驗(yàn)
胚胎在受精后3天（dpf）注射0.2m MEdu，并在28.5℃孵育1小時(shí)。胚胎用4%多聚甲醛在4℃下固定過夜后，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行Edu檢測。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測在3 dpf下進(jìn)行，使用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒TMR Red（羅氏12156792910），按照制造商的說明進(jìn)行。
實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)
根據(jù)制造商的協(xié)議，使用Trizol試劑（Invitrogen 15596-026）從整個(gè)胚胎（每組30至40個(gè)胚胎）中分離總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測方法如前所述。所有樣品重復(fù)測量3次，并歸一化為內(nèi)對(duì)照gapdh。退火溫度為58°C。本研究中使用的引物的序列信息將根據(jù)要求提供。
蛋白印跡分析
用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（Roche）裂解4 dpf時(shí)的斑馬魚胚胎。等量的蛋白質(zhì)樣品在12%的SDS-PAGE凝膠上溶解，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（微波波，伯靈頓，MA，美國）。然后用非磷酸（活性）β-連環(huán)蛋白一抗(1：1000；細(xì)胞信號(hào)技術(shù)8814 S；細(xì)胞信號(hào)技術(shù)，丹弗斯，MA，美國）和磷酸-β-連環(huán)蛋白（1：1000；細(xì)胞信號(hào)技術(shù)9561 S），然后用二抗。使用化學(xué)發(fā)光信號(hào)（Pierce NCI4106；皮爾斯，羅克福德，IL，美國）檢測信號(hào)。
骨骼染色和影像學(xué)檢查
標(biāo)記軟骨和骨骼的阿利新藍(lán)和軟骨素紅染色使用了Walker和同事的修改方案。體內(nèi)茜素紅染色，可以標(biāo)記礦化骨和腸道，斑馬魚與0.05%茜素紅（Sigma-Aldrich，圣路易斯，莫，美國）孵育1小時(shí)，然后用系統(tǒng)水洗滌3次。阿利新藍(lán)染色和椎體茜素紅染色使用SteREO Discovery 20顯微鏡成像。用抗體染色或其他活染色的胚胎用LSM880NLO共聚焦顯微鏡和20×水浸物鏡（Carl Zeiss）成像。使用ImageJ軟件（NIH，Bethesda，MD，USA；https://imagej.nih.gov/ij/）測量茜素紅活染色后礦化骨的相對(duì)面積。
藥物處理
XAV939購自Selleck化學(xué)公司（休斯頓，TX，美國），用DMSO溶解，得到10 mM的原液。WT斑馬魚和rmrp突變體分別用10μM XAV939或0.1% DMSO對(duì)照在受精后60-96小時(shí)（hpf）處理，研究咽弓軟骨的發(fā)育。此外，使用10μM XAV939或0.1% DMSO對(duì)照，從4 dpf到6 dpf，研究7 dpf時(shí)的骨骨化。使用ImageJ（NIH）測量舌角骨長度。
統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。誤差條表示SD。兩組之間的差異采用非配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)，并采用單向方差分析進(jìn)行多組（三組或三組以上）的比較。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad棱鏡（GraphPad軟件，拉霍亞，CA，美國）和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS，芝加哥，IL，USA）進(jìn)行。p值在p < 0.05、p < 0.01和p < 0.001時(shí)被認(rèn)為是顯著的。
斑馬魚rmrp在多個(gè)物種中高度保守
RMRP在多個(gè)物種中具有一些保守的序列區(qū)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，特別是在哺乳動(dòng)物物種中高度保守。為了確定斑馬魚rmrp的序列保守性，我們對(duì)人類、小鼠和斑馬魚中rmrp的轉(zhuǎn)錄區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了多個(gè)序列比對(duì)。RMRP的轉(zhuǎn)錄區(qū)域在斑馬魚與人類之間的序列相似性為59.9%（圖1A）。完全保守的區(qū)域位于63-82和242-259之間，它們在參與RNA裂解的蛋白質(zhì)復(fù)合物的酶促位點(diǎn)上提供了一個(gè)第三級(jí)元素。有趣的是，根據(jù)我們的比對(duì)數(shù)據(jù)，CHH患者中大多數(shù)突變的轉(zhuǎn)錄核苷酸在人類、小鼠和斑馬魚中高度保守（圖1A），這表明斑馬魚rmrp的轉(zhuǎn)錄區(qū)域高度保守。
我們還對(duì)RMRP的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TATA box、近端序列元件、八聚體元件和SP1結(jié)合位點(diǎn)，它們是RNA聚合酶III啟動(dòng)子元件，是高度保守的（圖1B）。TATA box和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的長度經(jīng)常被插入、重復(fù)和三倍改變，導(dǎo)致RMRP轉(zhuǎn)錄減少，在24 bp~26 bp保守。斑馬魚中rmrp的二級(jí)結(jié)構(gòu)也與人類的RMRP相似（圖1C）。此外，rmrp轉(zhuǎn)錄本的整體頸環(huán)結(jié)構(gòu)在物種之間保持不變。
我們還對(duì)斑馬魚、人類和小鼠中的RMRP基因進(jìn)行了共線性分析（圖1D）。我們發(fā)現(xiàn)rmrp周圍的基因（tesk1和ccdc149b）與人和小鼠rmrp周圍的基因（TESK1和CCDC107）具有同源性。在人類和小鼠RMRP基因中發(fā)現(xiàn)6個(gè)下游基因（CLTA、GNE、RNF38、MELK、PAX5、ZCCHC7）在斑馬魚RMRP上游的同一染色體上。這表明斑馬魚的rmrp基因與人類的RMRP和小鼠的Rmrp基因是同源的。總之，這些數(shù)據(jù)表明斑馬魚rmrp是高度保守的，可能在多個(gè)物種中發(fā)揮保守作用。
圖1 斑馬魚rmrp在多個(gè)物種中高度保守。(A)對(duì)人類（264 bp）、小鼠（271 bp）和斑馬魚（256 bp）的RMRP轉(zhuǎn)錄區(qū)域進(jìn)行多序列比對(duì)。已發(fā)表的與疾病相關(guān)的突變的核苷酸用紅色下劃線表示。（15）(B)RMRP啟動(dòng)子區(qū)域在-300~-1之間的多序列比對(duì)。下劃線分別突出顯示了SP1結(jié)合位點(diǎn)、八聚體元件、近端序列元件（PSE）和TATA box。對(duì)齊是基于ClustalW（www.clustal.org）對(duì)齊的；共識(shí)元素由(A)和(B)中的BoxShade（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）突出顯示(C)人類RMRP（集成條目ENST00000363046.1，左）和斑馬魚rmrp（集成條目ENSDART00000115550.2，右）的二級(jí)結(jié)構(gòu)，來自集成（http://www.ensembl.org）。結(jié)構(gòu)信息主要來自于Rfam（https://rfam.xfam.org/）提供的協(xié)方差模型。(D)對(duì)斑馬魚、人類和小鼠中RMRP基因的保守共時(shí)性分析。基因名稱旁邊的數(shù)字代表染色體上基因位置的巨堿基對(duì)（Mbp）。染色體片段用藍(lán)線和藍(lán)色虛線表示。
斑馬魚發(fā)育過程中rmrp的表達(dá)模式
我們采用全體原位雜交法檢測了rmrp的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，rmrp在母體和合子中表達(dá)（圖2）。Rmrp轉(zhuǎn)錄本在原腸形成前的早期胚胎階段廣泛分布（圖2A-C）,然后后期階段在頭部和軀體區(qū)域富集（圖2D-K）。Rmrp廣泛分布于包括腦和眼在內(nèi)的各個(gè)組織，從體期到頭區(qū)48 hpf（圖2d-k）。rmrp在分節(jié)階段表達(dá)較強(qiáng)，在后期逐漸下降（圖2D-K）。早在48 hpf時(shí)，在胸鰭芽（圖2J）和腸球原基（圖2K）中均檢測到rmrp的表達(dá)。從72 hpf到4 dpf，該表達(dá)更為顯著；在4 dpf時(shí)，rmrp在腸球和腸管中明顯表達(dá)（圖2U，W)。在48 hpf時(shí)在咽部袋中檢測到Rmrp轉(zhuǎn)錄物，然后在60 hpf時(shí)在下頜骨和舌骨弓軟骨中檢測到轉(zhuǎn)錄物（圖2M，N）。從72 hpf到4 dpf，rmrp在鰓弓1到5軟骨的軟骨細(xì)胞中逐漸表達(dá)，但在頭部廣泛表達(dá)無明顯影響（圖2R，V）。我們使用rmrp sense RNA探針作為陰性對(duì)照(補(bǔ)充圖。S1).這些觀察結(jié)果表明，rmrp可能在包括軟骨在內(nèi)的各種組織的發(fā)育中發(fā)揮作用。
圖2 通過全貼裝原位雜交檢測野生型斑馬魚中rmrp的表達(dá)模式。（A-C）Rmrp在單細(xì)胞期(A)、雙細(xì)胞期(B)和芽期(C).廣泛表達(dá)（D，E）8體(D)期和18體期胚胎的側(cè)視圖(E)。（F-H）受精后24小時(shí)（hpf）胚胎(F)和腦區(qū)(G)和體區(qū)(H)的放大放大圖。（I-K）48hpf胚胎的側(cè)視圖(I)和頭部區(qū)域背側(cè)視圖(J)和側(cè)視圖(K)。（L-O）60hpf胚胎的側(cè)視圖（-）和頭部區(qū)域側(cè)視圖(M)、腹側(cè)視圖(N)和背側(cè)視圖(O)。（P-S）72hpf胚胎側(cè)視圖(P)，頭部區(qū)域側(cè)視圖(Q)和腹側(cè)視圖(R)，體區(qū)放大圖(S)。（T-W）受精后4天（dpf）胚胎側(cè)視圖(T)，頭部區(qū)域側(cè)視圖(U)和腹側(cè)視圖(V)，體區(qū)高倍放大圖(W)。n = 30個(gè)胚胎為A-W。巴=鰓弓；Br =腦；H=舌骨弓；IB =腸球；IBP =腸球原基；IT =腸管；M=下頜骨。
斑馬魚中rmrp敲除會(huì)破壞下頜發(fā)育
為了建立斑馬魚CHH模型并研究rmrp在發(fā)育中的作用，我們對(duì)KO rmrp基因采用了CRISPR/Cas9基因組編輯方法。我們首先設(shè)計(jì)了兩個(gè)針對(duì)酶位點(diǎn)的目標(biāo)序列，這是位于rmrp63-82bp的最保守的區(qū)域，在人類CHH中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)已知致病單核苷酸突變的位置。通過對(duì)F0代的KO突變體進(jìn)行測序，我們發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)2具有較高的靶向效率（圖3A）。我們將這些F0突變體繁殖到F2代，得到了一個(gè)穩(wěn)定的純合子突變系。該突變系在rmrp的一個(gè)高度保守的區(qū)域缺失了一個(gè)13bp的缺失，包括一些酶的位點(diǎn)序列（圖3B）。既往研究表明，RMRP轉(zhuǎn)錄區(qū)突變導(dǎo)致RMRP結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致RMRP RNA水平降低，這是CHH患者的一個(gè)關(guān)鍵分子特征。我們進(jìn)行了RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)rmrp?/?斑馬魚中rmrp的表達(dá)水平顯著降低（圖3C）。此外，整體原位雜交顯示，在rmrp?/?斑馬魚中，rmrp的表達(dá)很少（圖3D）。這些結(jié)果表明，斑馬魚rmrp保守區(qū)域的突變也可能導(dǎo)致rmrp的不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致表達(dá)降低。
我們分析了rmrp KO斑馬魚的大體表型。rmrp雜合子突變胚胎與WT同胞一樣正常。純合子突變胚在72 hpf左右前均未出現(xiàn)明顯的形態(tài)缺陷，此時(shí)頜骨逐漸形成。在3 dpf時(shí)的光學(xué)顯微鏡下，rmrp?/?幼蟲的下頜明顯縮小，很容易被識(shí)別出來，并且比野生型斑馬魚的眼睛稍小一些（圖3E）。到6 dpf時(shí)，rmrp?/?胚胎的下頜缺陷更明顯，眼睛也更小。此外，突變體不能形成魚鰾，頭部較小，并伴有心包水腫。突變體幼蟲的胃腸道也出現(xiàn)發(fā)育不全（無褶皺的小腸；圖3E)。在9 dpf時(shí)，上述表型變得更加嚴(yán)重，但突變體的體長略長于其WT同胞的體長（圖3E，F(xiàn)）。由于其多重發(fā)育畸形，rmrp?/?突變體在12 dpf到14 dpf內(nèi)死亡。
圖3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建rmrp KO斑馬魚下頜發(fā)育破壞。(A)KOrmrp基因的Cas9靶位點(diǎn)2在GI F0生成中具有較高的靶向效率。(B)顯示rmrp突變系缺失13 bp，用紅色虛線表示。GGG（紅色）為PAM序列。(C) RT-qPCR結(jié)果顯示，rmrp?/?斑馬魚中rmrp的表達(dá)水平顯著降低。取值為平均±標(biāo)準(zhǔn)差。***p < 0.001，n = 3個(gè)獨(dú)立的樣本組。采用全貼裝原位雜交法檢測(D)rmrp?/?斑馬魚中(D) Rmrp的表達(dá)。值得注意的是，很少有rmrp表達(dá)，從18體細(xì)胞到受精后4天逐漸減少（dpf）。n = 30個(gè)胚胎。(E)光鏡檢測WT和rmrp KO斑馬魚在3dpf~9dpf之間的總表型。側(cè)視圖的放大倍數(shù)在右面板上。箭頭表示下頜骨的縮小。(F)rmrp?/?的胚胎長度測量顯示，在9 dpf時(shí)，它們明顯長于WT的兄弟姐妹。取值為平均±標(biāo)準(zhǔn)差。***p < 0.001, n = 10.比例尺=，D為200μm，E為400 μm。
rmrp調(diào)節(jié)咽弓的模式和塑造
由于軟骨缺損是CHH的一個(gè)典型特征，我們評(píng)估了斑馬魚顱面骨骼的軟骨模式。阿利新藍(lán)和茜素紅染色顯示，rmrp?/?胚胎的下頜明顯縮小是由5 dpf時(shí)咽部弓軟骨的發(fā)育缺陷引起的（圖4A）。rmrp?/?胚胎表現(xiàn)出明顯的倒置或不完全發(fā)育的神經(jīng)鰓角，且神經(jīng)鰓弓發(fā)育遲緩。在rmrp突變體中，頸鰓-5骨和附著的咽部牙齒均表現(xiàn)出缺陷形態(tài)發(fā)生和延遲礦化（圖4A）。此外，Meckel軟骨和腭軟骨有輕微的形態(tài)異常，可能是由于突變體舌骨角的變化引起的（圖4A）。
為了更密切地觀察下頜軟骨和軟骨發(fā)育不良的動(dòng)態(tài)發(fā)育，我們在軟骨細(xì)胞報(bào)告細(xì)胞系Tg（col2a1a：EGFP）的背景下生成了rmrp突變體。在3 dpf時(shí)，軟骨細(xì)胞像硬幣一樣堆疊，橫跨WT軟骨中通常排列成單細(xì)胞寬的一排的軟骨。然而，在rmrp突變體中，軟骨細(xì)胞呈圓形，有多層細(xì)胞紊亂，col2a1a標(biāo)記的熒光信號(hào)擴(kuò)散，因此，很難辨別軟骨細(xì)胞的形態(tài)（圖4B）。在此階段，與野生型斑馬魚相比，rmrp突變體的角軟骨扭曲，角軟骨角變鈍（圖4B）。然而，神經(jīng)顱內(nèi)的篩板沒有明顯變化（圖4B)。在6 dpf時(shí)，可以觀察到軟骨細(xì)胞形態(tài)，但rmrp突變體中Meckel和宮頸軟骨的軟骨細(xì)胞排列仍然紊亂。特別是神經(jīng)膜軟骨有明顯的凹陷，基底膜軟骨有發(fā)育缺陷（圖4B）。與野生型斑馬魚相比，角骨軟骨角明顯增加，角骨長度減?。▓D4C，D）。
我們通過全體原位雜交技術(shù)檢測了軟骨形成相關(guān)基因的表達(dá)。在咽部軟骨的rmrp突變體中，軟骨細(xì)胞標(biāo)記物sox9a和col2a1a在60 hpf時(shí)的表達(dá)延遲，但它們在篩板中的表達(dá)沒有受到影響（圖4E）。在72 hpf時(shí)，sox9a和col2a1a的表達(dá)水平顯著升高，且宮頸軟骨角更鈍（圖4E）。在4 dpf時(shí)，rmrp突變體的col2a1a水平仍然較高；與WT基底軟骨相比，咽部軟骨畸形更嚴(yán)重，基底軟骨仍然沒有col2a1a的表達(dá)（圖4E)。以col2a1a和sox9a的Sense RNA探針作為陰性對(duì)照(補(bǔ)充圖 S2A)。總之，我們的數(shù)據(jù)表明，rmrp調(diào)控咽部弓的模式和塑造，這表明，rmrp缺失的斑馬魚再現(xiàn)了CHH相關(guān)的軟骨表型。
圖4 rmrp調(diào)節(jié)咽部弓的模式和成形。（A）WT斑馬魚和rmrp突變體的(A)阿利新藍(lán)和茜素紅骨架染色。(B)共聚焦圖像顯示W(wǎng)T斑馬魚和轉(zhuǎn)基因背景（col2a1a：EGFP）rmrp突變體從受精后3天（dpf）到6 dpf的下頜軟骨發(fā)育。WT斑馬魚和rmrp突變體在6 dpf時(shí)的角軟骨角(C)和角軟骨長度(D)的定量分析。取值為平均±標(biāo)準(zhǔn)差。**p < 0.01, n = 5.(E)受精后60小時(shí)的sox9a（hpf）和72hpf（上）以及60 hpf、72 hpf和4dpf（下）的col2a1a的全安裝原位雜交。WT斑馬魚，n = 30；rmrp突變體，n = 10。=基底；Cb =頸鰓；=頸；篩板；=低辛；=Meckel軟骨；Pq =腭。比例尺：A和E為200 μm；B為50 μm。
及時(shí)的骨化需要rmrp
據(jù)報(bào)道，部分CHH患者存在骨化異常。為了研究rmrp突變對(duì)斑馬魚骨形成的影響，我們采用茜素紅活染色法以及轉(zhuǎn)基因株系Tg（osterix：EGFP），它標(biāo)記成骨細(xì)胞以檢查頭骨的骨化。從6 dpf到9 dpf，共聚焦顯微鏡顯示W(wǎng)T斑馬魚頭骨膜內(nèi)骨和軟骨內(nèi)骨均逐漸骨化；然而在rmrp突變體中，膜內(nèi)骨的蓋、鰓骨射線和消化道骨化延遲（圖5A)。rmrp突變體在9 dpf時(shí)的膜內(nèi)骨骨化程度與WT斑馬魚在6 dpf時(shí)的程度大致相同，特別是鰓環(huán)的礦化區(qū)域，但突變體的鰓骨射線仍然很小（圖5A，B）。有趣的是，轉(zhuǎn)基因株系Tg（osterix：EGFP）的茜素紅染色顯示，在9 dpf時(shí)，WT和突變斑馬魚的神經(jīng)顱骨篩板成骨細(xì)胞分化和礦化沒有顯著差異(補(bǔ)充圖 S3)。這些數(shù)據(jù)表明，rmrp突變影響內(nèi)臟顱骨膜內(nèi)骨的礦化，而不影響神經(jīng)顱骨的礦化。在6 dpf時(shí)，WT斑馬魚的軟骨、頦骨、關(guān)節(jié)后軟骨、鰓下軟骨和頸鰓膜-5軟骨的軟骨內(nèi)骨發(fā)生骨化，但在rmrp突變體中，頦骨、關(guān)節(jié)后軟骨和5軟骨的周骨化略有延遲，尤其是在頸骨軟骨，而鰓下軟骨的面體骨化不受影響（圖5A）。
為了區(qū)分軟骨周圍成骨的差異是否由軟骨形成異常引起，我們使用茜素紅活染色（圖5D）和雙轉(zhuǎn)基因系Tg（osterix:EGFP）；Tg（col2a1a：mCherry）（圖5E）在6dpf，我們發(fā)現(xiàn)軟骨源性發(fā)育不良的嚴(yán)重程度與軟骨周骨化缺陷的程度一致。角骨軟骨畸形和軟骨周圍骨化缺陷最為嚴(yán)重，而鰓下軟骨發(fā)育正常，軟骨周圍骨化正常甚至略有加速（圖5D，E）。在9 dpf時(shí)，與野生型斑馬魚相比，突變體的軟骨周骨化沒有明顯延遲（圖5C），相反，鰓下軟骨軟骨周骨化增強(qiáng)，礦化骨環(huán)有更多的成骨細(xì)胞（圖5A）。同樣，茜素紅染色也觀察到類似的結(jié)果(補(bǔ)充圖。S4A)。以上結(jié)果表明，rmrp突變體的延遲軟骨內(nèi)成骨是繼發(fā)于軟骨發(fā)育不良，當(dāng)軟骨形成正常發(fā)展時(shí)，軟骨內(nèi)成骨可能會(huì)加速。
此外，我們還使用茜素紅染色法檢測了椎體的礦化情況（圖5F）。從5 dpf到9 dpf，我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變體中椎體的礦化速度加快，礦化椎體的數(shù)量顯著增加（圖5F，G）。茜素紅染色也觀察到類似的結(jié)果(補(bǔ)充圖。S4B).這些結(jié)果表明，rmrp突變促進(jìn)了椎體骨化。
rmrp基因敲除會(huì)影響腸道和顱內(nèi)血管的發(fā)育
CHH患者的一個(gè)標(biāo)志性表型是胃腸道缺乏癥。這一臨床特征與先天性巨結(jié)腸樣疾病相似，即腸內(nèi)神經(jīng)元的缺乏導(dǎo)致腸蠕動(dòng)和消化不良。因此，我們研究了腸道的發(fā)育過程。通過使用茜素紅染色，我們發(fā)現(xiàn)突變體的腸道變小，褶皺減少（圖5F）。腸道H&E染色顯示，WT斑馬魚的腸上皮細(xì)胞形成指狀腸絨毛；而rmrp突變體的腸上皮細(xì)胞數(shù)量減少，腸絨毛缺失(補(bǔ)充圖 S5)。我們還使用標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的Tg（flk1：EGFP）魚系檢測了rmrp突變體的顱內(nèi)血管的發(fā)育。有趣的是，從3 dpf到8 dpf，突變體在顱血管發(fā)育中表現(xiàn)出顯著的異常(補(bǔ)充圖S6A)。利用Tg（col2a1a：mCherry）和Tg（flk1：EGFP）雙轉(zhuǎn)基因株系，我們發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)血管附著在軟骨表面，表現(xiàn)出與咽部軟骨發(fā)育不良相同的畸形模式(補(bǔ)充圖 S6B).這些數(shù)據(jù)表明，軟骨和血管的異常發(fā)育可能會(huì)相互影響。
圖5 rmrp可及時(shí)調(diào)節(jié)骨骨化。(A)WT斑馬魚和rmrp突變體在Tg（EGFP：EGFP）背景下的共聚焦成像，受精后6天用茜素紅活染色（dpf；上）和9dpf（下）。(B)WT斑馬魚和rmrp突變體在6 dpf和9dpp、WT斑馬魚和rmrp突變體的n = 8胚胎周期周期的相對(duì)礦化面積的定量。(C)WT斑馬魚和rmrp突變體在9 dpf，n = 10處的角膜相對(duì)面周骨化區(qū)域的定量。(D)WT斑馬魚和rmrp突變體在Tg（col2a1a：EGFP）背景下的共聚焦成像，在6 dpf時(shí)用茜素紅活染色。箭頭表示周面骨化。(E)WT斑馬魚和rmrp突變體與Tg（col2a1a：mCherry）雙轉(zhuǎn)基因株系中6 dpf的共聚焦成像。箭頭表示軟骨骨環(huán)中的成骨細(xì)胞。(F)茜素紅活體染色，從5 dpf到9 dpf。(G)WT斑馬魚和rmrp突變體從5 dpf到9 dpf的礦化椎體數(shù)量。
rmrp突變可抑制受影響組織的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡
為調(diào)查rmrp突變體細(xì)胞增殖是否受阻，我們進(jìn)行Edu合并試驗(yàn)，在3dpf和WT相比，發(fā)現(xiàn)rmrp突變體中Edu陽性細(xì)胞的數(shù)量在頭部的咽和眼睛區(qū)域顯著減少（圖6A，B）?？紤]到之前的研究表明rmrp突變可能改變周期蛋白依賴的細(xì)胞周期調(diào)控，我們檢測了幾個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ccng1、ccnd1和cdkn2a/b在rmrp突變中大幅增加（補(bǔ)充圖 S7A）。
我們接下來驗(yàn)證了rmrp突變體中的細(xì)胞凋亡是否受到影響。使用TUNEL實(shí)驗(yàn)，與WT相比，我們檢測到在3 dpf時(shí)的突變體有更多的頭部凋亡細(xì)胞，包括咽部區(qū)域和眼睛（圖6C，D）。我們通過RT-qPCR對(duì)一組凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)在3 dpf時(shí)，rmrp突變體中tp53、mdm2和caspase8的水平大幅增加（補(bǔ)充圖 S7B）。原位雜交證實(shí)，rmrp突變體的咽部、眼睛和腸道中tp53和mdm2水平較高（圖6E），陰性對(duì)照未顯示雜交信號(hào)（補(bǔ)充圖 S2B）。我們的數(shù)據(jù)表明，rmrp缺失可能在咽弓、眼睛和腸道中觸發(fā)外部和內(nèi)在的凋亡途徑。
圖6 rmrp突變可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。(A) Edu檢測和Col2a1a的免疫熒光染色（綠色）顯示，受精后WT斑馬魚和突變體頭部區(qū)域3天（dpf）的細(xì)胞增殖減少。(B)WT斑馬魚和rmrp突變體(A)、n = 8胚胎各顯微鏡下Edu陽性細(xì)胞數(shù)量的定量，***p < 0.001。(C) TUNEL檢測顯示，在3 dpf時(shí)，rmrp突變體的頭部區(qū)域有更多的凋亡細(xì)胞。(D)WT斑馬魚和rmrp突變體(C)、n = 8胚胎各顯微鏡下TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量的定量，***p < 0.001。(E)在3 dpf時(shí)，通過原位雜交檢測tp53（左）和mdm2（右）的表達(dá)水平。箭頭表示咽部軟骨，箭頭表示腸。（WT斑馬魚，n = 30；rmrp突變體，n = 10）。A和C的比例尺為= 100μm，E為200μm。
rmrp突變上調(diào)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路
典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在軟骨發(fā)育和骨形成中起著重要作用。一些研究表明，Wnt信號(hào)參與了斑馬魚的顱面發(fā)育。據(jù)報(bào)道，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路增強(qiáng)了結(jié)腸癌細(xì)胞中rmrp的表達(dá)。因此，我們檢測了rmrp突變體和WT斑馬魚中積累的β-連環(huán)蛋白的水平。對(duì)4 dpf時(shí)的整個(gè)胚胎提取物進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示，rmrp突變體中激活的-β-連環(huán)蛋白顯著上調(diào)，而磷酸化的-β-連環(huán)蛋白沒有顯著變化（圖7A）。此外，RT-qPCR結(jié)果顯示，在4 dpf時(shí)rmrp突變體與野生型斑馬魚相比，一組已知的Wnt/β-連環(huán)蛋白靶基因，包括ccnd1、axin2、c-myc和chordin的水平也顯著升高（圖7C）。免疫熒光檢測顯示，rmrp突變體的角骨軟骨中Axin2水平升高（圖7B）。此外，原位雜交顯示，rmrp突變體咽部區(qū)ccnd1水平也升高（圖7E），陰性對(duì)照沒有雜交信號(hào)(補(bǔ)充圖 S2C)。這些結(jié)果表明，在rmrp突變體中，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在rmrp突變體中，wnt5b和wnt2bb的RNA水平顯著升高，而dvl2水平略有升高。相比之下，apc和csnk1e（它們編碼的蛋白形成β-連環(huán)蛋白破壞復(fù)合物）的水平均略有下降（圖7F），但ctnnb1的RNA水平?jīng)]有變化（圖7D）。
這些結(jié)果表明，rmrp突變可能抑制了β-連環(huán)蛋白的降解，從而促進(jìn)了Wnt/β-連環(huán)蛋白的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖7 rmrp突變上調(diào)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路。(A)WT和突變斑馬魚受精后4天（dpf）蛋白提取物（dpf）檢測非磷酸化β-連環(huán)蛋白（激活的β-連環(huán)蛋白）和磷酸化β-連環(huán)蛋白，β-actin作為加載對(duì)照。(B)WT斑馬魚和突變體在4 dpf時(shí)咽部軟骨的Axin2和Col2a1a的雙免疫熒光染色。白色箭頭表示角舌骨軟骨。RT-qPCR分析Wnt/β-連環(huán)蛋白靶基因ccnd1、軸蛋白2、c-myc和弦蛋白(C)的表達(dá)水平升高，但ctnnb1的(D).（ns）無明顯變化(E)在受精后3天，通過原位雜交檢測ccnd1的表達(dá)水平（dpf）。黑色箭頭表示咽部軟骨。（WT斑馬魚，n = 30；rmrp突變體，n = 10）。(F) RT-qPCR分析wnt5b、wnt2bb、dvl2、apc和csnk1e的表達(dá)水平，n3組獨(dú)立樣本，*p < 0.05、***p < 0.001，無顯著性（ns）。比例尺=為50μm，E為200μm。
Wnt抑制部分減輕了rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和增加椎骨礦化
然后，我們詢問了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的藥理抑制是否可以挽救由rmrp突變引起的軟骨生成發(fā)育不良和礦化失調(diào)。我們使用了一種β-連環(huán)蛋白抑制劑XAV939，它通過刺激β-連環(huán)蛋白的降解來抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在咽弓軟骨從60 hpf到96 hpf的發(fā)育過程中，我們使用了10μM的XAV939或DMSO對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn)，與DMSO處理的突變體相比，XAV939處理的突變體的下頜凹陷在4 dpf時(shí)得到了緩解（圖8A）。共聚焦顯微鏡顯示，XAV939處理的突變體部分減輕了軟骨生成發(fā)育不良，特別是角骨軟骨發(fā)育不良（圖8B）。XAV939處理的突變體舌骨角的角度和長度與野生型斑馬魚更接近（圖8C）。
此外，我們對(duì)10μM XAV939或DMSO對(duì)照處理4-6dpf，以研究它們對(duì)7 dpf骨骨化的影響。我們發(fā)現(xiàn)，與DMSO處理的突變體相比，XAV939處理的突變體的下鰓軟骨礦化骨環(huán)處的成骨細(xì)胞數(shù)量減少（圖8D），表明促進(jìn)軟骨膜骨化加速部分緩解。此外，與DMSO處理的突變體相比，XAV939處理的突變體的礦化椎體數(shù)量明顯減少，與WT斑馬魚相似（圖8E，F(xiàn)）。然而，在XAV939處理的突變體中，顱骨延遲的膜內(nèi)骨礦化并沒有得到挽救（圖8D）。這些結(jié)果表明，rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和椎骨礦化增加與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)，而抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路可部分緩解。
圖8 抑制Wnt可以部分緩解rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和增加椎骨礦化。(A)在野生型斑馬魚和rmrp突變體中，用10μM XAV939（右）或DMSO（左）處理受精后60小時(shí)（hpf）到96 hpf后，在受精后4天通過光鏡檢測到頭部區(qū)域的側(cè)視圖（dpf）。箭頭表示，在xav939處理的突變體中，凹陷的下頜部分獲救。(B)共聚焦圖像顯示，在10μM XAV939轉(zhuǎn)基因Tg（col2a1a：EGFP）背景（下）或DMSO（上）處理60 hpf到96 hpf后，WT斑馬魚和rmrp突變體的4 dpf。Ch =角骨軟骨。(C)(B).中野生型斑馬魚和rmrp突變體的宮頸長度定量n = 5.(D)在10μM XAV939（右）或DMSO（左）處理4 dpf后，Tg（EGFP）轉(zhuǎn)基因背景下7 dpf的顱骨成骨細(xì)胞側(cè)視圖。白色箭頭表示鰓下軟骨骨項(xiàng)圈中的成骨細(xì)胞。(E)從4 dpf到XAV939（下）或DMSO（上）處理7 dpf后，茜素紅活染色7 dpf椎骨礦化側(cè)視圖。(F)量化(E)中礦化椎體的數(shù)量，n = 10。取值為平均±標(biāo)準(zhǔn)差。**p < 0.05，***p < 0.001，無顯著性（ns）。A、D、E的比例尺為= 200μm，B為50μm。
討論
在本研究中，我們使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過敲除斑馬魚中的RMRP同源物rmrp，生成了CHH的斑馬魚模型。我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變體顯示軟骨生成破壞和骨骨化，這在一定程度上與CHH患者的臨床表現(xiàn)相似。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，其分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制可能與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因表達(dá)失調(diào)所引起的抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)rmrp突變上調(diào)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)，抑制Wnt信號(hào)可以部分緩解rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和椎骨礦化增加。
侏儒癥和短而增厚的長骨伴扇形和中期增寬是CHH患者的標(biāo)志。我們試圖通過檢測rmrp KO斑馬魚的軟骨形成來揭示CHH患者軟骨發(fā)育不良的機(jī)制。斑馬魚沒有四肢和長骨；然而，斑馬魚的顱面骨是通過軟骨內(nèi)成骨化和膜內(nèi)骨化形成的，就像人類一樣。舌角骨是由類似于哺乳動(dòng)物骨的軟骨內(nèi)成骨形成的，它們也具有相同的骨骺和骨骺生長板組成。先前的研究表明，導(dǎo)致人類軟骨發(fā)育不良的基因突變可導(dǎo)致顱面骨的軟骨發(fā)育不良，如斑馬魚的角頜骨軟骨。因此，我們研究了顱面發(fā)育，發(fā)現(xiàn)了rmrp突變體的咽弓軟骨發(fā)育缺陷。特別是角骨長度減少，頸骨弓凹陷和遲鈍。此外，在角骨中，軟骨細(xì)胞以多層細(xì)胞分布，在rmrp突變體中分布，排列無序，而WT軟骨細(xì)胞像硬幣一樣排列成一個(gè)細(xì)胞寬的行。這些結(jié)果與觀察到的CHH患者柱狀組織缺陷和中期增寬相一致。
通常，CHH患者的骨骺骨化中心在影像學(xué)上表現(xiàn)正常，骨密度基本正常。然而，一些CHH患者表現(xiàn)為長骨延遲骨化和小梁形成，或隨著骨齡的增加股骨骨化或手骨化晚期。CHH患者的可變骨化確實(shí)令人困惑，目前尚不清楚它是否只存在于嚴(yán)重受影響的患者和繼發(fā)于軟骨發(fā)育不良。我們在斑馬魚中的研究表明，rmrp突變體的軟骨內(nèi)成骨可能因軟骨形成缺陷的程度而不同。rmrp突變體的宮頸軟骨顯示嚴(yán)重的軟骨發(fā)育不良和延遲軟骨內(nèi)骨化，而鰓下軟骨相對(duì)正常，軟骨周骨化，礦化骨環(huán)處有更多的成骨細(xì)胞。此外，rmrp突變抑制了顱骨的膜內(nèi)骨化，同時(shí)顯著促進(jìn)了椎骨的礦化。這些數(shù)據(jù)表明，rmrp調(diào)控斑馬魚早期發(fā)育階段的骨化或礦化，雖然我們需要在未來的工作中使用一種新的策略來評(píng)估rmrp突變后成年期的骨化和礦化變化。
先前來自酵母的研究表明，rmrp突變體在有絲分裂結(jié)束時(shí)通過降解細(xì)胞周期蛋白B2 mRNA來延緩細(xì)胞周期的進(jìn)程。類似地，一項(xiàng)來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外研究表明，RMRP突變通過損害核糖體組裝和改變細(xì)胞周期蛋白依賴的細(xì)胞周期調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞生長下降。因此，我們檢測了rmrp突變體在受影響組織中的增殖變化，發(fā)現(xiàn)Edu標(biāo)記細(xì)胞減少。此外，我們發(fā)現(xiàn)在rmrp突變體中，ccng1、ccnd1和cdkn2a/b的表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明，斑馬魚中rmrp突變體的細(xì)胞增殖下降可能是這些周期相關(guān)基因表達(dá)變化的結(jié)果。由于酵母RNase MRP的RNA或蛋白質(zhì)成分的基因缺失已經(jīng)證明RNase MRP復(fù)合物對(duì)細(xì)胞生存能力是至關(guān)重要的。我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變體的細(xì)胞凋亡增加，并且一組凋亡相關(guān)基因如tp53、mdm2和caspase8的表達(dá)水平大幅增加。這些數(shù)據(jù)表明，rmrp缺失可能觸發(fā)咽弓、眼睛和腸道內(nèi)的內(nèi)在或外在的凋亡途徑。事實(shí)上，E3泛素連接酶MDM2是p53蛋白的負(fù)調(diào)控因子。Mdm2已被鑒定為p53相互作用蛋白，可抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)p53的快速降解。我們一致發(fā)現(xiàn)，在rmrp突變體中，少數(shù)tp53轉(zhuǎn)錄本顯著減少（數(shù)據(jù)未顯示）。有趣的是，之前的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白G1具有生長抑制活性，在體內(nèi)外均能與Mdm2和p53相互作用。這些結(jié)果表明，rmrp可能通過調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)分子的表達(dá)控制細(xì)胞的增殖和凋亡，但rmrp如何調(diào)控這些基因的表達(dá)，以及這些基因如何協(xié)同調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，還需要更多的研究。
為了探索rmrp調(diào)控骨軟骨形成的機(jī)制，我們檢測了參與骨骼發(fā)育的幾個(gè)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路上調(diào)。藥理抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白可部分挽救軟骨發(fā)育不良，減輕椎骨礦化程度的增加。典型的Wnt信號(hào)在骨生物學(xué)中得到了廣泛的研究，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)在骨骼形成過程中間充質(zhì)前體細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞譜系具有重要作用。異常典型Wnt信號(hào)通路增強(qiáng)骨化并抑制軟骨細(xì)胞的形成，而在成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致分泌成骨細(xì)胞的骨基質(zhì)的過早分化，但β-連環(huán)蛋白在早期頭部間充質(zhì)中的穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致顱骨的丟失。同樣，我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變抑制了顱骨的膜內(nèi)骨化，這可能是由于Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的增加影響了間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化而引起的。此外，rmrp KO促進(jìn)鰓下軟骨的軟骨周礦化和軟骨周-成骨細(xì)胞分化，并加速椎骨礦化，這與rmrp突變斑馬魚中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的增加相一致。
先前的研究表明，WNT-3A能夠通過激活β-連環(huán)蛋白來驅(qū)動(dòng)腫瘤中的RMRP轉(zhuǎn)錄。最近，Mandy和同事還發(fā)現(xiàn)，WNT-3A和WNT-5A可以使成軟骨細(xì)胞系中的Rmrp啟動(dòng)子活性分別增加45%和26%。有趣的是，在rmrp突變體中，我們發(fā)現(xiàn)wnt5b和wnt2bb的RNA水平隨著Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的上調(diào)而升高。一種可能的解釋是，Wnt RNA水平的升高可能是由于rmrp的減少引起的反饋機(jī)制，而Wnt的增加將進(jìn)一步上調(diào)Wnt信號(hào)通路。我們還發(fā)現(xiàn)，形成β-連環(huán)蛋白破壞復(fù)合物的編碼蛋白apc和csnk1e的RNA水平略有下降，提示rmrp突變可能導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的降解受到抑制。然而，lncRNA rmrp如何穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白并上調(diào)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路仍不明確，需要進(jìn)一步的研究。
CHH患者有一些骨骼外的表現(xiàn)，如胃腸道功能障礙、免疫缺陷、貧血和惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加。我們發(fā)現(xiàn)，rmrp突變體的腸道上皮細(xì)胞數(shù)量和腸絨毛數(shù)量減少，腸道變小，提示腸道發(fā)育缺陷或變性。由于CHH的胃腸道缺乏可能與腸道內(nèi)腸道神經(jīng)元的缺乏有關(guān)，因此建議進(jìn)一步研究腸道表型，包括檢測rmrp突變體中的腸道神經(jīng)元。
我們研究的一個(gè)局限性是，rmrp?/?突變體在12 dpf到14 dpf內(nèi)死亡，因此，我們只能分析早期發(fā)育階段的表型。為了更好地模擬CHH患者的表型，進(jìn)一步研究CHH的發(fā)病機(jī)制，我們可以建立具有相對(duì)較低的rmrp功能障礙水平的斑馬魚突變體，或注射rmrp mRNA來挽救早期發(fā)育缺陷的表型，將突變體提高到成年?？傊?，我們建立了一個(gè)類似于CHH患者軟骨發(fā)育不良和其他表型的CHH斑馬魚模型，并研究了rmrp突變導(dǎo)致表型的潛在細(xì)胞和分子機(jī)制。我們提供的證據(jù)表明，rmrp突變體上調(diào)了典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，而抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路可以部分緩解rmrp突變體的表型。我們的斑馬魚CHH模型將有助于更好地理解其潛在的發(fā)病機(jī)制，從而有助于探索CHH可能的治療途徑。此外，它也可能有助于提供更廣泛的對(duì)其他表型重疊核糖體病的治療的見解。
基金：本研究由國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81830075,81772306）支持。
原文：Sun X, Zhang R, Liu M, Chen H, Chen L, Luo F, Zhang D, Huang J, Li F, Ni Z, Qi H, Su N, Jin M, Yang J, Tan Q, Du X, Chen B, Huang H, Chen S, Yin L, Xu X, Deng C, Luo L, Xie Y, Chen L. Rmrp Mutation Disrupts Chondrogenesis and Bone Ossification in Zebrafish Model of Cartilage-Hair Hypoplasia via Enhanced Wnt/β-Catenin Signaling. J Bone Miner Res. 2019 Nov;34(11):2101-2116. doi: 10.1002/jbmr.3820. Epub 2019 Sep 4. PMID: 31237961.
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