雜志：International Journal of Molecular Sciences
通訊作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院兒童保健科，國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，上海市萬源路 399號(hào)，中國(guó)，201102
摘要
對(duì)感覺輸入的過度反應(yīng)是自閉癥譜系障礙(ASD)的一種常見且使人衰弱的癥狀，但潛在的神經(jīng)異常尚不清楚。在我們的臨床隊(duì)列篩查中，3例攜帶新發(fā)SHANK2突變的患者中有2例也表現(xiàn)出對(duì)視覺、聽覺和觸覺刺激的高敏感性，因此我們通過生成穩(wěn)定的shank2b缺陷斑馬魚模型(shank2b?/?)來研究SHANK2缺陷是否會(huì)導(dǎo)致感覺異常和其他ASD樣表型。成年shank2b?/?斑馬魚表現(xiàn)出社會(huì)偏好和親屬偏好降低，行為刻板印象增強(qiáng)，而幼魚在黑暗到光明的過渡過程中表現(xiàn)出對(duì)聽覺噪音的超敏感和異常多動(dòng)。因此，該模型概括了以往許多遺傳ASD模型的核心發(fā)育和行為表型。γ-氨基丁酸(GABA)受體亞基mRNA和蛋白的表達(dá)水平也在shank2b?/?斑馬魚中降低，這些動(dòng)物對(duì)藥物誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作表現(xiàn)出更大的敏感性。我們的研究結(jié)果表明，GABAergic功能障礙是ASD感覺超反應(yīng)的主要原因，并強(qiáng)調(diào)了在早期神經(jīng)發(fā)育過程中針對(duì)感覺處理中斷進(jìn)行干預(yù)的必要性，以防止疾病進(jìn)展。關(guān)鍵詞：斑馬魚；自閉癥譜系障礙；shank2；行為；GABAR。
介紹
自閉癥譜系障礙(ASD)是神經(jīng)發(fā)育綜合征的總稱，其特征是社交互動(dòng)和溝通缺陷、刻板重復(fù)行為、興趣限制和各種感覺異常。ASD的非典型感覺處理可能表現(xiàn)為對(duì)環(huán)境的特定感官方面的超敏、低敏或異常興趣，這種異常在高達(dá)90%的自閉癥個(gè)體中都存在。此外，這些異常影響每一種感覺形態(tài)(視覺、嗅覺、味覺、聽覺、本體感覺、觸覺和平衡)。非典型的視覺處理已經(jīng)在人類嬰兒中被觀察到，這些嬰兒早在6個(gè)月大的時(shí)候就患上了自閉癥，這比核心自閉癥表型(如聯(lián)合注意力障礙)(14-18個(gè)月)要早得多。此外，先前的研究已經(jīng)報(bào)道了自閉癥兒童關(guān)節(jié)注意力較低與缺乏對(duì)社會(huì)和非社會(huì)感官刺激的定向之間的聯(lián)系。嬰兒的感覺癥狀不僅先于而且預(yù)示著兒童時(shí)期的社交缺陷、重復(fù)行為和最終的ASD診斷。因此，感知癥狀可以作為ASD的早期診斷生物標(biāo)志物，為潛在的病理生物學(xué)提供線索，并為治療干預(yù)提供新的靶點(diǎn)。許多基因都與自閉癥有關(guān)，包括那些調(diào)節(jié)突觸傳遞的基因。其中包括SHANK2，它在谷氨酸能突觸上編碼一種主要的支架蛋白(SHANK2/ProSAP1)，這對(duì)突觸后密度(PSD)的組裝和完整性至關(guān)重要。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了18例神經(jīng)發(fā)育障礙患者攜帶人類SHANK2基因的新生變異，我們?cè)谂R床篩查隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)了另外3名患者存在SHANK2基因的新變異體。此外，其中2例患者表現(xiàn)出智力缺陷和對(duì)感官刺激的高度敏感性，如對(duì)突然聲音的過度反射反應(yīng)和對(duì)外部視覺刺激的被動(dòng)尋求。與臨床觀察一致，Shank2基因敲除小鼠也表現(xiàn)出對(duì)疼痛刺激的低敏感性。因此，我們推測(cè)自閉癥患者的SHANK2功能喪失可能與異常的感覺加工有關(guān)，特別是聽覺和視覺通路。然而，確切的分子機(jī)制仍有待闡明。這些ASD相關(guān)的感覺缺陷和核心癥狀行為歸因于抑制性γ-氨基丁酸(GABA)信號(hào)缺乏導(dǎo)致興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞不平衡。自閉癥患者GABAergic功能障礙的證據(jù)包括:自閉癥患者死后腦組織GABA受體亞單位表達(dá)不足，自閉癥與GABAergic基因等位變異之間的聯(lián)系，以及在許多其他不同的自閉癥動(dòng)物模型中GABAergic傳播缺陷。此外，最近的一項(xiàng)人類研究發(fā)現(xiàn)，自閉癥患者缺乏雙眼競(jìng)爭(zhēng)，這依賴于皮質(zhì)GABAergic信號(hào)。也有證據(jù)表明自閉癥的觸覺和聽覺處理缺陷與GABAergic功能障礙有關(guān)。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，GABAergic信號(hào)的改變可能導(dǎo)致自閉癥患者的異常感覺知覺。斑馬魚是研究包括ASD在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病在遺傳、發(fā)育和行為水平上的有力工具。在這里，我們報(bào)道了一個(gè)shank2突變斑馬魚系的產(chǎn)生，這為shank2缺陷在ASD的感覺處理和行為異常中的作用提供了強(qiáng)有力的支持。此外，我們報(bào)道這些動(dòng)物表現(xiàn)出GABA受體在大腦中的表達(dá)減少，對(duì)藥物引起的癲癇發(fā)作的敏感性增強(qiáng)，表明GABAergic信號(hào)傳導(dǎo)不足。
養(yǎng)魚及飼養(yǎng)
Tubingen(Tu)株斑馬魚飼養(yǎng)在中國(guó)上海復(fù)旦大學(xué)兒童醫(yī)院斑馬魚研究所。幼魚和成魚都在28.5℃的再循環(huán)系統(tǒng)中保持在14小時(shí)/10小時(shí)的晝夜節(jié)律周期下。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指導(dǎo)原則》進(jìn)行，并獲得復(fù)旦大學(xué)兒童醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)培養(yǎng)shank2b缺陷斑馬魚
通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(基因ID: shank2b NC_007136.7)確定斑馬魚shank2b基因和外顯子/內(nèi)含子邊界，并使用先前報(bào)道的CRISPR/Cas9編輯產(chǎn)生shank2b突變。shank2b的位點(diǎn)特異性單導(dǎo)RNA (sgRNA)被設(shè)計(jì)為針對(duì)第10外顯子序列5'-GGATCGGAGCAGCACTCGCG-3'，并使用MAXIscript?T7試劑盒(AM1314M, Invitrogen, Waltham, MA, USA)通過體外轉(zhuǎn)錄合成。然后用微型注射器將150:600 pg的sgRNA: cas9核酸酶(En Gen?spy cas9 NLS #M0646, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)注射到單細(xì)胞期受精的WT斑馬魚胚胎(F0)中。注射后的胚胎培養(yǎng)72 h，然后制備基因組DNA，使用補(bǔ)充表S1和Sanger測(cè)序中列出的引物檢查誘變效率。然后分析鑒定出的突變，尋找可用于基因分型的獨(dú)特限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn)。通過與WT斑馬魚的一系列異交繁殖后代，并對(duì)每一代進(jìn)行基因分型。最終，將這些動(dòng)物進(jìn)行雜交以獲得純合子缺陷shank2b?/?突變體。
RT-qPCR
通過RT-qPCR分析胚胎在24hpf、48hpf、3dpf和5dpf時(shí)基因表達(dá)的變化。所有的分析包括三個(gè)或四個(gè)獨(dú)立的胚胎池，每個(gè)胚胎池25個(gè)胚胎。采集受精后3周的幼魚和受精后2個(gè)月的成魚腦(3個(gè)獨(dú)立腦池，每池10尾)。采集成年雄性斑馬魚的大腦、心臟、肝-膽-脾、皮膚-肌肉和精索組織，以及成年雌性斑馬魚的卵巢組織(每種組織類型3個(gè)池，每個(gè)池5條魚)，并在干冰上速凍。使用MiniBEST通用RNA提取試劑盒(編號(hào)9767,Takara, Japan)按照制造商的方案從采集的組織和整個(gè)胚胎中提取總RNA，并按照制造商的說明使用帶有g(shù)DNA橡皮(Perfect Real Time) (RR047A, Takara, Japan)的primer - script?RT試劑試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Applied Biosystems?7500系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))和TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (RR820A, Takara，日本)進(jìn)行RT-qPCR，根據(jù)制造商的方案估計(jì)shank2b, shank2a和GABA受體亞基的mRNA表達(dá)水平。采用delta CT法將表達(dá)水平歸一化為Rpl13α作為內(nèi)控。RT-qPCR引物序列見補(bǔ)充表S1。所有的測(cè)量都是在至少三個(gè)獨(dú)立采集的組織池或整個(gè)胚胎上進(jìn)行的。
WB
HUABIO利用兩種蛋白共享的肽抗原(CRSLSMPDTSEDIPP-amide，對(duì)應(yīng)shank2的860 ~ 873個(gè)氨基酸)生成了一種定制抗體識(shí)別斑馬魚shank2a和shank2b (RB1661)。對(duì)于Western blotting，從4.5 mpf WT和shank2b?/?斑馬魚的大腦中分離總蛋白，通過SDS-PAGE(每凝膠道50μg)分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白或7%脫脂奶粉在室溫下封閉膜2小時(shí)，用抗GABARα親和純化的一抗(Abcam, ab211131, 1:1000)在4℃下孵育過夜，用含有0.1% tbn -20 (TBST)的TBS洗滌，用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1:5000)在室溫下孵育1小時(shí)。在TBST中洗滌三次后，用ECL試劑(BeyoECL Plus, P0018M)孵育，并暴露于柯達(dá)x射線膠片(Tanon 5200)。通過ImageJ軟件(NIH, Bethesda, MD, USA)分析蛋白質(zhì)的灰度值，并歸一化為GAPDH(1:5000)作為上膠對(duì)照。
幼魚對(duì)光和黑暗的反應(yīng)
使用Zebrabox系統(tǒng)(ViewPoint Life Sciences, Lyons,France)將7英尺高的斑馬魚幼魚單獨(dú)放置在24孔板的孔中，對(duì)活動(dòng)進(jìn)行視頻記錄。采集視頻前，給每只幼魚45 min適應(yīng)光照環(huán)境。隨后，將幼蟲暴露在5分鐘的連續(xù)照明下，然后進(jìn)行一個(gè)暗/光循環(huán)(5分鐘暗和5分鐘明，圖2K)。光照期光照強(qiáng)度為100%，暗期光照強(qiáng)度為0%。使用視點(diǎn)跟蹤系統(tǒng)和定制軟件每30秒記錄一次行駛的時(shí)間和距離。為了進(jìn)行分析，我們?cè)诿靠诰闹行漠嬕粋€(gè)圓圈，將井劃分為等面積的內(nèi)、外區(qū)域(圖2K)，并將其定義為：幼魚趨觸性=在中心區(qū)域移動(dòng)的距離/在整個(gè)區(qū)域移動(dòng)的距離在13 dpf時(shí)收集野生型和shank2b?/?幼魚，按照先前發(fā)表的方法評(píng)估ASR。簡(jiǎn)單地說，將幼蟲單獨(dú)放置在24孔板的孔中，并在配備紅外照明器的斑馬箱內(nèi)暴露于寬帶噪聲中，以便在黑暗中成像。寬帶噪聲是由計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的，并通過放置在室內(nèi)但沒有物理連接的兩個(gè)商用揚(yáng)聲器播放。視頻片段以每秒25幀(fps)的速度拍攝，并分成1-s的時(shí)間窗來評(píng)估ASR。經(jīng)過60分鐘的適應(yīng)期后，斑馬魚在三個(gè)單獨(dú)的ASR實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中包括5分鐘的環(huán)境聲音調(diào)節(jié)和15秒的突然大聲噪音刺激(圖3I)。將各組在每次突然聲音暴露前1分鐘和15秒內(nèi)的活動(dòng)計(jì)數(shù)量化，并根據(jù)以下公式計(jì)算ASR:ASR測(cè)試中的活動(dòng)變化=15s噪音階段的平均活動(dòng)(后)- 60s噪音前(前)的平均活動(dòng)
視覺運(yùn)動(dòng)行為測(cè)驗(yàn)
將13 dpf的幼魚單獨(dú)移栽到24孔板的孔中，分析從光到暗和從暗到光的轉(zhuǎn)換過程中的視覺運(yùn)動(dòng)行為。簡(jiǎn)而言之，視頻采集和跟蹤的規(guī)格與ASR試驗(yàn)中的規(guī)格相同。為了分析明暗轉(zhuǎn)換期間的行為變化，將魚在連續(xù)最大白光照射下適應(yīng)觀察室1小時(shí)(適應(yīng)階段)。然后，進(jìn)行3次熄燈周期(5分鐘照明，隨后是黑暗)(補(bǔ)充圖S3A)。為了分析暗光轉(zhuǎn)換過程中的行為變化，我們將魚在黑暗的觀察室中馴化了1小時(shí)(適應(yīng)期)。然后，進(jìn)行3次光照循環(huán)(黑暗5分鐘，光照15秒)(圖3A)。根據(jù)以下公式分析WT和shank2b突變體的活性變化:活性變化(從亮到暗的轉(zhuǎn)變)=暗后15 s檢測(cè)到的活性?光照前60 s檢測(cè)到的活性活動(dòng)變化(暗轉(zhuǎn)亮)=光照后15 s檢測(cè)到的活動(dòng)?光照前60 s檢測(cè)到的活動(dòng)為了評(píng)估行為改變和癲癇易感性作為E/I失衡的指標(biāo)，我們測(cè)量了9只dpf幼魚對(duì)GABAA受體拮抗劑PTZ的劑量反應(yīng)。野生型和shank2b?/?幼魚分別放置在24孔板的孔中，其中含有標(biāo)準(zhǔn)胚水和不同濃度的PTZ (P6500, Sigma-Aldrich, Zwijndrecht，荷蘭)預(yù)溶解于蒸餾水中。簡(jiǎn)單地說，建立了四個(gè)處理組:wt-標(biāo)準(zhǔn)水、WT-PTZ、shank2b-/-標(biāo)準(zhǔn)水和shank2b-/- PTZ。將PTZ先用蒸餾水溶解，再用亞甲基藍(lán)稀釋體系水(0.15 mg/L亞甲基藍(lán)、8.01 mg/L NaCl、5.04 mg/L KCl、5.50 mg/L Na2HPO4、0.44 mg/L KH2PO4、1.30 mg/L CaCl2、1.00 mg/L MgSO4和4.20 mg/L NaHCO3)溶解，得到工作溶液。隨后，將500μL PTZ工作溶液快速加入每孔500μL標(biāo)準(zhǔn)蛋水中，使最終體積達(dá)到1 mL/孔，含有1,2.5,5或7.5 mM PTZ。然后將盤子放在一個(gè)定制改造的斑馬魚箱中，以記錄斑馬魚幼魚活動(dòng)的視頻。經(jīng)過5分鐘的光照適應(yīng)期后，記錄45分鐘的自發(fā)活動(dòng)。然后將動(dòng)物暴露在一個(gè)10分鐘的光-暗循環(huán)中(5分鐘光照后5分鐘黑暗)，以檢查PTZ影響下對(duì)光照條件變化的反應(yīng)。通過比較從亮到暗轉(zhuǎn)換前后一分鐘內(nèi)所走的距離來分析反應(yīng)。包括馴化期在內(nèi)，每次試驗(yàn)共60 min(補(bǔ)充圖S4A)。我們使用了一種新的行為測(cè)試來確定7.5 mM PTZ是否在WT和9 dpf突變魚中引起了最大的差異反應(yīng)，因?yàn)樗趕hank2b突變體中引起了異常活性。簡(jiǎn)而言之，將9 dpf的shank2b?/?和WT幼魚分別移栽到含有1ml標(biāo)準(zhǔn)胚水的24孔板的孔中，并使用上述范例記錄活性。隨后，去除500μL蛋水，將500μL蛋水中的PTZ加入到孔中，得到最終的PTZ濃度為7.5 mM。我們使用重復(fù)的光暗激發(fā)實(shí)驗(yàn)來誘導(dǎo)PTZ誘導(dǎo)的反應(yīng)(圖4C)。通過將每個(gè)WT和shank2b突變魚的ptz后活性歸一化到基線來分析反應(yīng)。
曠場(chǎng)試驗(yàn)
成年斑馬魚的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)在2-4 mpf下進(jìn)行了適應(yīng)性開闊場(chǎng)范式測(cè)試(圖2H)。視頻是在一個(gè)30 × 30 × 30厘米的不透明水箱中拍攝的，水箱中裝滿了系統(tǒng)水。每只雄性斑馬魚在30分鐘的記錄期前在水箱中習(xí)慣5分鐘。每隔30秒使用Zebralab軟件(ViewPoint Life Sciences, Lissieu, Calvados, Lower Normandy Region, Lyons, France)分析一次運(yùn)動(dòng)時(shí)間和行進(jìn)距離。對(duì)于刻板行為的分析，不考慮基因型和治療史的實(shí)驗(yàn)者每分鐘從魚軌跡的轉(zhuǎn)換視覺路線中對(duì)游泳模式進(jìn)行評(píng)分，并統(tǒng)計(jì)小圈圈和繞墻兩種刻板游泳模式的頻率(圖2F)。成年斑馬魚的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)在2-4 mpf條件下在開放場(chǎng)模式下進(jìn)行測(cè)試(圖2H)。視頻是在一個(gè)30 × 30 × 30厘米的不透明水箱中拍攝的，水箱中裝滿了系統(tǒng)水，使用懸掛在上方的攝像機(jī)。在30分鐘的測(cè)試之前，每只雄斑馬魚在水箱中習(xí)慣5分鐘。利用Zebralab軟件，每隔30秒采集30分鐘錄像中的時(shí)間和距離進(jìn)行分析。對(duì)于刻板行為，要求實(shí)驗(yàn)者在雙盲控制下，對(duì)斑馬魚軌跡視覺路線每分鐘內(nèi)的游泳模式進(jìn)行評(píng)分，并分別統(tǒng)計(jì)四種刻板游泳模式片段的次數(shù)，即小圈圈和圍墻(圖2F)。趨近性(Thigmotaxis)是成年斑馬魚的一種經(jīng)過充分驗(yàn)證的焦慮癥狀，其評(píng)分為:趨近性=周邊區(qū)域移動(dòng)的距離/整個(gè)區(qū)域移動(dòng)的距離
三腔社會(huì)偏好測(cè)驗(yàn)
社會(huì)偏好測(cè)試在一個(gè)透明的交配池(尺寸為21 × 11 × 7.5 cm)中進(jìn)行，該交配池由兩個(gè)透明隔板分成三個(gè)腔室。將6只大小相似的雄性同種野鼠放入一個(gè)外室，而另一個(gè)外室不被占用(圖2A)。然后，受試者雄性斑馬魚(WT或突變體)在3.5 mpf下被放置在中間的腔室中，并給予5分鐘自由進(jìn)入整個(gè)裝置的時(shí)間。錄制30分鐘的視頻。社會(huì)偏好行為被量化為與同類群體相鄰的距離或時(shí)間。距離比為在與同形腔室相鄰的同形扇區(qū)內(nèi)走過的距離除以走過的總距離，時(shí)間比為在與同形腔室相鄰的同形扇區(qū)內(nèi)度過的時(shí)間除以總試驗(yàn)時(shí)間。為了進(jìn)一步分析shank2b?/?斑馬魚的社會(huì)性，我們?cè)谕凰渲羞M(jìn)行了親緣偏好測(cè)試。簡(jiǎn)單地說，三只成年近親斑馬魚被放置在左外室，三只成年非近親斑馬魚被放置在右外室(圖2C)。然后，將被試雄性斑馬魚(WT或突變體)置于3.5 mpf的中間室中。社會(huì)偏好是通過社會(huì)偏好指數(shù)(SPI)來評(píng)估的，其中:SPI=在特定區(qū)域的距離或時(shí)間-在空區(qū)域或非親屬區(qū)域的距離或時(shí)間/兩段距離或時(shí)間
統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)進(jìn)行處理。采用單側(cè)t檢驗(yàn)、Mann-Whitney檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)確定差異的顯著性。
結(jié)果
shank2缺陷斑馬魚的產(chǎn)生和形態(tài)計(jì)量學(xué)特征斑馬魚有兩個(gè)shank2類似物，在發(fā)育過程中表達(dá)，并在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中繼續(xù)豐富(補(bǔ)充圖S1A,B)。Shank2a和shank2b蛋白與人類蛋白的同源性分別為46.63%和60.58%(補(bǔ)充表S2)，并且包含相同的主要功能域(圖1A，補(bǔ)充表S3和S4)。此外，來自多個(gè)物種的蛋白質(zhì)序列比較顯示，脊椎動(dòng)物中SHANK2具有高度的進(jìn)化保守性(補(bǔ)充圖S1C)。為了檢驗(yàn)shank2的功能，我們使用CRISPR/Cas9靶向shank2b基因的第10個(gè)外顯子，產(chǎn)生了一個(gè)shank2b缺陷的斑馬魚品系，產(chǎn)生了一個(gè)14bp的缺失(圖1A，補(bǔ)充圖S1D)。由此產(chǎn)生的幀移位在外顯子13上產(chǎn)生一個(gè)過早的停止密碼子，破壞下游PSD-95/Discs large/ZO-1 (PDZ)和無菌α基序(SAM)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(圖1A)。為了評(píng)估突變的shank2轉(zhuǎn)錄本是否受到無義介導(dǎo)的衰變的影響，我們檢測(cè)了斑馬魚大腦中shank2b mRNA的表達(dá)。定量RT-PCR (RT-qPCR)顯示，與野生型(WT)相比，純合突變體中shank2b mRNA的表達(dá)總體減少(圖1B)，而shank2a mRNA的表達(dá)在基因型之間沒有差異(圖1C)。與WTs相比，心臟、肝-膽-脾、皮膚肌肉和性腺中shank2b mRNA的相對(duì)豐度也顯著降低，表明通過無義介導(dǎo)的衰變丟失了突變轉(zhuǎn)錄本(補(bǔ)充圖S1E)。我們觀察到WT和純合子shank2b?/?成魚的大體形態(tài)沒有差異(補(bǔ)充表S6和S7)。與WTs相比，受精后58 h (hpf)的shank2b?/?斑馬魚幼魚顯示出較小的頭部表型和較短的體長(zhǎng)(補(bǔ)充圖S2A-D)，但幾個(gè)頭部測(cè)量參數(shù)與體長(zhǎng)的比率是正常的(補(bǔ)充圖S2E,F)，并且成年突變魚的所有大腦區(qū)域都保存完好(補(bǔ)充圖S2G)。
圖1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成斑馬魚shank2b突變體。(A)斑馬魚shank2b基因及蛋白結(jié)構(gòu)。蛋白結(jié)構(gòu)域(ANK，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域;SH3, Src同源3域;PDZ、PSD-95/光盤大/ZO-1域;SAM(無菌α基序結(jié)構(gòu)域)與相應(yīng)的外顯子對(duì)齊。CRISPR/Cas9基因編輯的斑馬魚shank2b基因組DNA第10外顯子靶位圖和14bp缺失突變斑馬魚野生型(WT)和shank2b突變蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。14 bp的缺失導(dǎo)致在第13外顯子上出現(xiàn)一個(gè)終止密碼子，并在PDZ和SAM結(jié)構(gòu)域前過早終止。(B)與WT魚相比，在受精后4.5個(gè)月(mpf)， shank2b?/?成年雄性斑馬魚大腦中shank2b mRNA的表達(dá)減少(WT n = 4, shank2b?/? n = 4， **** p < 0.0001，學(xué)生t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(C) WT和shank2b?/?成年(4.5 mpf)雄斑馬魚腦內(nèi)shank2a mRNA的表達(dá)不受影響(WT n = 3, shank2b?/? n = 4, ns, p = 0.1957, 學(xué)生t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。
成年和幼體shank2b?/?斑馬魚的自閉癥樣行為
人類遺傳學(xué)研究表明SHANK2與自閉癥有關(guān)，之前的嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)報(bào)道了兩種不同的Shank2突變小鼠的自閉癥樣行為，以及Shank2?e24小鼠的社交和認(rèn)知行為受損。我們進(jìn)行了一系列行為測(cè)試，以評(píng)估shank2b?/?斑馬魚是否也表現(xiàn)出類似于人類SHANK2突變相關(guān)的ASD樣表型。我們首先使用三室測(cè)試來測(cè)試社會(huì)偏好行為。如圖2B所示，與WTs相比，中央室的成年shank2b?/?突變體在同一扇區(qū)中花費(fèi)的時(shí)間更短，游的距離更短。此外，相對(duì)于另一個(gè)外腔的非親緣?mèng)~，突變體對(duì)一個(gè)外腔中的親緣?mèng)~沒有表現(xiàn)出偏好(即，它們不會(huì)花更多的時(shí)間在毗鄰腔的區(qū)域游泳)，這與WTs的顯著親緣?mèng)~偏好形成鮮明對(duì)比(圖2D)。此外，shank2b?/?斑馬魚比WT斑馬魚花更少的時(shí)間和更短的距離平行于同種魚(圖2E)。這些結(jié)果表明，shank2b缺乏導(dǎo)致斑馬魚的社會(huì)偏好低。同樣與ASD樣表型一致的是，成年shank2b?/?斑馬魚在開闊的環(huán)境中花更多的時(shí)間從事重復(fù)和刻板的游泳行為，尤其是刻板的墻壁游泳(墻壁)(圖2G)。突變體也表現(xiàn)出更大的小圈游動(dòng)頻率，盡管與WTs的差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2G)。成年shank2b?/?斑馬魚在開闊區(qū)域的整體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)也明顯大于WTs(圖2I)。此外，成年shank2b?/?斑馬魚在新魚缸外圍區(qū)域行走的總距離比例(百分比)(thigmotaxis)顯著低于成年shank2b?/?斑馬魚(圖2J)，表明它們有更高的特質(zhì)焦慮。同樣，與年齡匹配的WTs相比，受精后7天(dpf)的斑馬魚幼蟲在水箱外圍相對(duì)于中心的游泳距離比例更大(圖2L,M)。與WT相比，shank2b?/?幼魚在暗光周期的第一個(gè)黑暗期(D1)的中心距離比顯著降低，在第一個(gè)光明期(L1)的中心距離比也顯著降低。在連續(xù)光照下，7 dpf時(shí)，shank2b?/?幼魚的趨動(dòng)性也更強(qiáng)(L0)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明shank2b缺陷會(huì)導(dǎo)致焦慮樣行為表型的增強(qiáng)。
圖2 shank2b?/?缺陷斑馬魚表現(xiàn)出自閉癥樣行為。(A)成年雄性斑馬魚社會(huì)偏好測(cè)試示意圖。(B)與WT相比，shank2b?/?斑馬魚對(duì)同種特異性的偏好顯著降低(時(shí)間比，** p = 0.0063;距離比，** p = 0.0057;WT, n = 12, shank2b?/?，n = 18，學(xué)生t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(C)成年雄性斑馬魚親緣偏好測(cè)試示意圖。(D) shank2b?/?斑馬魚明顯傾向于花時(shí)間探索非親緣部分以與紅魚互動(dòng)(n = 15， * p = 0.0278，配對(duì)t檢驗(yàn))，而WT斑馬魚更傾向于同種魚(n = 11， * p = 0.0498，配對(duì)t檢驗(yàn))。(E)此外，與WT斑馬魚相比，突變體親緣偏好指數(shù)顯著降低(時(shí)間比，** p = 0.0018;距離比，*** p = 0.007;學(xué)生t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(F)斑馬魚的刻板游泳模式表現(xiàn)為“小圈子”和“壁式”。(G)經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)，4強(qiáng)條件下，shank2b?/?斑馬魚的“小圓”刻板行為頻次增加(p = 0.0941)，“墻”刻板行為頻次顯著增加(* p = 0.0284)。(H)露天試驗(yàn)示意圖。(I)與WT斑馬魚相比，shank2b突變體在2mpf下的速度(以本試驗(yàn)30 min內(nèi)每秒移動(dòng)的平均距離來量化)有所增加(WT n = 20, shank2b?/?= 22，**** p < 0.0001, Student’s t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(J)在thigmotaxis測(cè)試中，個(gè)體WT和shank2b?/?斑馬魚在2 mpf下的代表性痕跡。shank2b?/?斑馬魚傾向于停留在中心區(qū)域，從而使thmomotaxis的距離比顯著降低(WT n = 18, shank2b?/?= 22，* p = 0.0104, Student’s t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(K)光暗實(shí)驗(yàn)設(shè)置，用于分析受精后7天(dpf)幼魚。(L)橫軸表示明暗交替的時(shí)間段。縱軸表示在中心環(huán)中移動(dòng)的距離的比率。(M)光照條件下，7 dpf下的shank2b?/?幼魚在L0期顯著減少，在L1期有減少的趨勢(shì)。結(jié)果表明，與WT幼魚相比，黑暗條件下(D1)也顯著降低。L0(左)，** p = 0.0036;D1(中)，** p = 0.0033;L1, p = 0.0663。WT幼魚n = 36, shank2b?/?幼魚n = 34。學(xué)生t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。
shank2b?/?幼魚對(duì)視覺和聽覺刺激的異常反應(yīng)
據(jù)報(bào)道，SHANK2缺乏的人有不典型的感覺處理能力。為了確定shank2b幼魚是否表現(xiàn)出類似的感覺加工異常，我們比較了突變體和WT幼魚對(duì)光-暗或暗-光轉(zhuǎn)換的視覺運(yùn)動(dòng)反應(yīng)(VMRs)和對(duì)高強(qiáng)度聲音刺激的驚嚇反應(yīng)。斑馬魚幼體通常在突然的光-暗過渡(黑暗刺激)下表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的活動(dòng)(補(bǔ)充圖S3B-D)，而在突然的暗-光過渡(光刺激)下表現(xiàn)出短暫的活動(dòng)減弱(圖3B-D)。然而，當(dāng)暴露于突然的光刺激時(shí)，13dpf shank2b?/?幼魚的活性沒有顯著變化，而不是預(yù)期的活性降低，一些動(dòng)物在第二次或第三次黑暗到光明的轉(zhuǎn)變中表現(xiàn)出活性增加(圖3E-G)?？傮w而言，WT和shank2b?/?突變體幼魚在從暗到光的轉(zhuǎn)變過程中存在顯著的活性差異(圖3H)。相比之下，兩種基因型都表現(xiàn)出對(duì)光-暗過渡的響應(yīng)活性增加(補(bǔ)充圖S3E-G)，并且在三個(gè)光-暗過渡周期中，基因型之間的這種變化幅度沒有顯著差異(補(bǔ)充圖S3H)。斑馬魚幼體通常會(huì)對(duì)突然的寬帶噪聲做出反應(yīng)，其運(yùn)動(dòng)活動(dòng)會(huì)急劇增加(圖3J,K)，這類似于在嚙齒動(dòng)物和人類中觀察到的聲驚嚇反應(yīng)(ASR)。此外，與其他動(dòng)物的ASR一致，13 dpf的WT幼魚對(duì)重復(fù)的刺激表現(xiàn)出一定程度的習(xí)慣。然而，與WTs相比，突變體在第一次刺激下表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的活性，表明基線ASR敏感性更高，與WTs相比，突變體對(duì)第二次刺激的反應(yīng)更大(圖3M,N)，表明習(xí)慣化程度降低。突變體對(duì)第三種刺激的ASR在數(shù)值上也大于WTs，但差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3P)。
圖3 shank2b幼魚對(duì)視覺和聽覺刺激的異常反應(yīng)。(A) 13 dpf光刺激下斑馬魚幼體VMR運(yùn)動(dòng)活動(dòng)跟蹤方案和行為設(shè)置。實(shí)驗(yàn)包括連續(xù)黑暗條件下60 min的適應(yīng)期和20 min 45 s的三次VMR測(cè)試期。VMR實(shí)驗(yàn)包括5分鐘的黑暗適應(yīng)和15秒的突然光刺激。(B-D) 13 dpf時(shí)WT幼魚對(duì)突然光刺激的反應(yīng)正常下降(第一次光刺激，*** p = 0.0006;第二次光刺激，**** p < 0.0001;第三光刺激，**** p < 0.0001。n = 23，配對(duì)t檢驗(yàn))，(E-G)，而shank2b?/?模型在暗-光過渡期間表現(xiàn)出完全不同的反應(yīng)，其特征是活動(dòng)動(dòng)態(tài)輕微增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第一次光刺激，ns p = 0.3395;第二次光刺激，ns p = 0.7621;第三光刺激，ns p = 0.3446。N = 24，配對(duì)t檢驗(yàn))。(H)柱狀圖比較WT和shank2b突變體在每次光刺激前1分鐘和后15秒檢測(cè)到的活性。WT和shank2b幼魚從黑暗到光明的每一次轉(zhuǎn)變都誘導(dǎo)了活性變化的顯著差異(第一次光刺激，** p = 0.0029;第二次光刺激，**** p < 0.0001;第三光刺激，**** p < 0.0001。WT, n = 23, shank2b?/?n = 24, Student’s t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(1) 13 dpf條件下斑馬魚幼體AMR對(duì)大噪聲刺激的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)跟蹤方案和行為設(shè)置。試驗(yàn)包括60 min的預(yù)試期和20 min 45 s的正試期，由3個(gè)AMR試驗(yàn)組成。AMR實(shí)驗(yàn)包括5分鐘的環(huán)境聲調(diào)節(jié)和15秒的突然噪音刺激。(J-L) WT幼魚在13 dpf時(shí)，在兩次ASR試驗(yàn)后，第三次噪聲刺激誘導(dǎo)的活性顯著增強(qiáng)(第一次噪聲刺激，ns p = 0.8148;第二噪聲刺激，ns p = 0.8905;第三噪聲刺激，** p = 0.0028。N = 20，配對(duì)t檢驗(yàn))。(M-O)第一次和第二次噪聲刺激誘導(dǎo)shank2b?/?幼魚活性顯著增加(第一次噪聲刺激，**** p < 0.0001;第二噪聲刺激，*** p = 0.0003;第三噪聲刺激，ns, p = 0.1257。N = 20，配對(duì)t檢驗(yàn))。(P)柱狀圖比較了WT和shank2b突變體每次大噪聲刺激前1分鐘和后15秒檢測(cè)到的活動(dòng)。同樣，在前兩次突然噪聲刺激下，shank2b幼魚在13 dpf時(shí)的速度變化比WT幼魚更劇烈(第一次噪聲刺激，p = 0.0638;第二噪聲刺激，* p = 0.0369;第三個(gè)暗噪聲，ns p = 0.1645。WT n = 20, shank2b?/? n = 20, 學(xué)生t檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。
shank2b?/?斑馬魚的GABAergic缺陷
ASD小鼠模型中的非典型感覺反應(yīng)與GABAergic中間神經(jīng)元發(fā)育的改變有關(guān)。為了研究GABAergic神經(jīng)元發(fā)育或信號(hào)傳導(dǎo)的改變是否也發(fā)生在shank2b突變體中，我們比較了成年WT和shank2b?/?突變體之間GABA受體亞基的mRNA水平。事實(shí)上，RT-qPCR顯示，與WTs相比，shank2b?/?斑馬魚中g(shù)abra1、gabra2a、gabra4、gabra5、gabra6b、gabrb2a、gabrg1和gabard的mRNA表達(dá)水平顯著降低(圖4A)。此外，突變體中GABAA受體α1蛋白的表達(dá)也顯著降低，提示GABAergic系統(tǒng)功能障礙，并伴隨興奮/抑制平衡的興奮性轉(zhuǎn)移(圖4B)。為了進(jìn)一步證明這種轉(zhuǎn)變，我們檢測(cè)了WT和突變體幼蟲對(duì)GABAA受體拮抗劑戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作的易感性，PTZ廣泛用于嚙齒動(dòng)物模型和斑馬魚的癲癇發(fā)作。ptz誘發(fā)的癲癇發(fā)作表現(xiàn)為預(yù)期運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的抑制，隨著從亮到暗的突然轉(zhuǎn)變而增加。shank2b突變體對(duì)ptz誘導(dǎo)的行為改變表現(xiàn)出更大的敏感性，這與GABA受體信號(hào)缺陷導(dǎo)致的興奮/抑制平衡的興奮性轉(zhuǎn)變相一致(補(bǔ)充圖S4B-D,H,I)。此外，與年齡匹配的WT幼魚相比，PTZ處理在9 dpf時(shí)誘導(dǎo)shank2b?/?幼蟲在明暗過渡期間的活性變化明顯更多(圖4D-G)?？偟膩碚f，我們的研究結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明神經(jīng)發(fā)育GABAergic信號(hào)缺陷是shank2b突變的ASD樣行為異常的基礎(chǔ)。
圖4 shank2b突變體顯示GABAergic缺陷。(A) RT‐qPCR顯示GABAR亞基在成魚shank2b?/?腦組織中的表達(dá)水平發(fā)生改變。Gabra1， ** p = 0.003;Gabra2a， * p = 0.0394;Gabra3 ns p = 0.0993;Gabra3 ns p = 0.0660;Gabra4， * p = 0.0341;Gabra5， * p = 0.0371;Gabrg2 ns p = 0.0730;Gabra6a ns p = 0.3488;Gabra6b， * p = 0.0138;Gabrb1 ns p = 0.1258;Gabrb2a， ** p = 0.0083;Gabrg1， ** p = 0.005;gabard， * p = 0.0318;每組N = 3-4。學(xué)生t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(B)成魚shank2b?/?腦組織中GABAA受體α1蛋白的Western blot分析。* p = 0.0313, WT n = 3,shank2b?/?n = 4, 學(xué)生t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(C)戊四唑(PTZ)處理行為實(shí)驗(yàn)程序。(D)實(shí)驗(yàn)由光暗轉(zhuǎn)換期間的基礎(chǔ)活性變化和7.5 mM ptz誘導(dǎo)的基礎(chǔ)活性變化組成。(E) 9 dpf時(shí)WT幼魚在光暗轉(zhuǎn)換過程中表現(xiàn)出活力的動(dòng)態(tài)增加(WT + v (vector) light vs. WT + v dark， ** p = 0.0022，;N = 17，配對(duì)t檢驗(yàn))。值得注意的是，PTZ濃度為7.5 mM的WT幼魚在9 dpf時(shí)沒有導(dǎo)致活性下降(WT + PTZ光vs WT + PTZ暗，ns, p = 0.3869, n = 17，配對(duì)t檢驗(yàn))。(F)然而，7.5 mM PTZ誘導(dǎo)shank2b突變體活性下降(shank2b?/?+ V光vs. shank2b?/?+ V暗，*** p = 0.0005;shank2b?/?+ PTZ光vs. shank2b?/?+ PTZ暗，* p = 0.0157;N = 16，配對(duì)t檢驗(yàn))。(G)有趣的是,活動(dòng)改變shank2b幼魚9 dpf 7.5毫米PTZ治療后多活動(dòng)改變PTZ治療前(shank2b?/??基線與shank2b?/?+ PTZ, * * * p = 0.0006, n = 16,配對(duì)t檢驗(yàn)),甚至大于WT幼蟲后的活動(dòng)改變對(duì)待PTZ (WT + PTZ與shank2b?/?+ PTZ, * * p = 0.0096 WT + PTZ n = 17日shank2b?/?+ PTZ / n = 16 t測(cè)試)。值得注意的是，9 dpf的WT幼魚在7.5 mM PTZ處理前后明暗轉(zhuǎn)換期間的活性變化無顯著差異(WT-baseline vs. WT + PTZ, ns p = 0.0961, n = 17，配對(duì)t檢驗(yàn))。
人類遺傳學(xué)研究表明，SHANK2與廣泛的神經(jīng)發(fā)育狀況有關(guān)，包括自閉癥癥狀、智力殘疾、多動(dòng)和焦慮。在我們的臨床隊(duì)列篩選中，三分之二攜帶SHANK2突變的患者也表現(xiàn)出對(duì)視覺、聽覺和觸覺刺激的超敏感性，但很少有SHANK2缺陷感覺表型的描述。異常的感覺反應(yīng)性現(xiàn)在被認(rèn)為是ASD的一個(gè)診斷特征，但在之前已知的18例攜帶從頭SHANK2變異的患者中，只有1例接受了非典型感覺處理的詳細(xì)檢查。目前的研究擴(kuò)大了shank2缺陷動(dòng)物模型所表現(xiàn)出的潛在行為表型的范圍。此外，這種表型特征與人類SHANK2相關(guān)疾病的臨床特征譜大致一致。這些shank2b突變斑馬魚在野外過度活躍，在連續(xù)光照下表現(xiàn)出焦慮樣表型，社會(huì)偏好和親屬偏好降低，刻板印象增強(qiáng)。此外，shank2b突變體顯示GABA受體亞基mrna和α1亞基蛋白的表達(dá)水平降低，對(duì)藥物性癲癇發(fā)作的敏感性增加。有趣的是，一些參與GABAergic信號(hào)的分子已經(jīng)被認(rèn)為與自閉癥的感覺癥狀有關(guān)。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，shank2b?/?斑馬魚是一個(gè)有價(jià)值的模型，用于解剖人類ASD的病理生理，ASD的感覺異?？赡苤辽俨糠衷从贕ABA受體活性降低。研究表明，改變?cè)摰鞍撞煌瑓^(qū)域的兩系Shank2敲除小鼠表現(xiàn)出相似的自閉癥行為表型，這與第三系Shank2?ex24敲除小鼠表現(xiàn)出的雙相相關(guān)躁狂樣行為不同。一般來說，所有三種常規(guī)和其他條件Shank2缺陷小鼠模型都顯示出明顯的神經(jīng)精神樣表型，除了對(duì)疼痛刺激不敏感外，沒有感覺異常。在這里，我們?cè)诎唏R魚中創(chuàng)建了shank2b?/?模型來測(cè)試自閉癥和感覺處理問題的共同相關(guān)性。通過兩個(gè)基于光刺激的任務(wù)和一個(gè)基于噪聲刺激的任務(wù)，詳細(xì)檢查了與shank2b缺陷相關(guān)的潛在感覺加工缺陷，所有這些任務(wù)都表明，與WT幼魚相比，突變幼蟲的刺激敏感性增強(qiáng)。突變體表現(xiàn)出夸張的聲驚嚇反應(yīng)和減少的ASR習(xí)慣，以及對(duì)從黑暗到光明的突然轉(zhuǎn)變的相對(duì)過度活躍的反應(yīng)。我們目前的行為研究表明，這種視覺反應(yīng)過度活躍有助于減少親屬偏好。同樣，在ASD和相關(guān)神經(jīng)發(fā)育障礙的幾種小鼠模型中也觀察到視覺過敏，包括Mecp2、Fmr1、Shank3、Gabrb3和Cntnap2突變/缺陷的系。這些異常的感覺行為支持斑馬魚模型在研究人類SHANK2相關(guān)ASD中的面部有效性。這些與ASD相關(guān)的感覺異常和其他癥狀行為可能是由于抑制性GABA神經(jīng)傳遞不足導(dǎo)致突觸興奮和抑制之間的不平衡。反過來，GABAergic功能障礙可能是突觸形成、信號(hào)傳導(dǎo)和分子組織所必需的基因突變的下游后果，因?yàn)橐恍y帶ASD突變的小鼠系顯示出抑制信號(hào)被破壞。例如，缺失自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因接觸蛋白相關(guān)蛋白2 (Cntnap2)會(huì)減少小鼠皮質(zhì)中GABAergic中間神經(jīng)元的數(shù)量，包括快速尖峰的小蛋白免疫陽(yáng)性中間神經(jīng)元。斑馬魚cnnap2ab突變體也表現(xiàn)出GABAergic神經(jīng)元數(shù)量的減少，特別是小白蛋白陽(yáng)性(PV+)中間神經(jīng)元。在缺乏Shank3的小鼠中，體感覺皮層(S1)和杏仁核基底外側(cè)(BLA)的PV+中間神經(jīng)元減少。雖然Shank家族蛋白在興奮性突觸后密度中富集，但大量研究也表明其廣泛表達(dá)于GABAergic神經(jīng)元，包括pv陽(yáng)性中間神經(jīng)元。例如，Shank1基因敲除小鼠的PV免疫反應(yīng)性也降低，Shank2基因敲除小鼠的GABAergic神經(jīng)傳遞受損。中間神經(jīng)元在感覺加工過程中起著至關(guān)重要的作用，上述shank基因缺失與中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABAergic功能障礙之間的關(guān)聯(lián)表明，shank2和其他家族成員在多個(gè)感覺系統(tǒng)中作為調(diào)節(jié)GABAergic信號(hào)傳導(dǎo)的生物網(wǎng)絡(luò)的一部分，導(dǎo)致ASD中觀察到的感覺加工異常。在我們的研究中，這些突變魚不僅表現(xiàn)出與人類一致的感覺表型，而且GABA受體的表達(dá)水平降低，對(duì)ptz誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作的敏感性增加。RT-qPCR分析顯示，gabra1、gabra2a、gabra4、gabra5、gabra6b、gabrb2a、gabrg1和gabard等亞基基因mRNA表達(dá)水平降低，GABAA受體亞基包括gabrg1、GABRA2、gabra4和gabra5與自閉癥有關(guān)。GABAA受體α1蛋白的表達(dá)水平在shank2b?/?斑馬魚中也顯著降低，而GABAA受體α1蛋白在嚙齒動(dòng)物視覺皮層發(fā)育的可塑性關(guān)鍵期起著關(guān)鍵作用。這些GABAA受體基因和蛋白質(zhì)缺陷與光照下的多動(dòng)癥以及對(duì)ptz誘發(fā)的癲癇發(fā)作的敏感性增加有關(guān)，表明突變斑馬魚大腦中抑制驅(qū)動(dòng)的喪失。GABAA受體活性通過刺激神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、遷移和分化、神經(jīng)突生長(zhǎng)和突觸發(fā)生，對(duì)神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要。此外，GABAergic中間神經(jīng)元幫助建立感覺皮層的感受野組織。此外，目前有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，GABAA受體基因和GABA中間神經(jīng)元中其他相對(duì)高水平表達(dá)的基因在特發(fā)性ASD中的異常表達(dá)模式。因此，我們認(rèn)為shank2有助于斑馬魚GABAergic網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育，而在發(fā)育過程中shank2表達(dá)的缺失會(huì)導(dǎo)致一生中感覺系統(tǒng)組織和感覺加工的異常，進(jìn)而導(dǎo)致其他類似ASD的行為表型。重復(fù)和保守的shank2a和shank2b相似，在整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有很高的序列同一性(補(bǔ)充表S5)，而shank2a的進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域的缺失可以被檢測(cè)到(補(bǔ)充圖S5和S6)。相比之下，人類SHANK2的幾個(gè)重要蛋白——ANK、PDZ和SAMC末端區(qū)域在shank2b中比shank2a保守度更高(補(bǔ)充表S3和S4)。因此，shank2b更適合作為人類SHANK2的模型。然而，基于shank2a和shank2b轉(zhuǎn)錄本在斑馬魚大腦中的表達(dá)，我們也推測(cè)這兩個(gè)相似物可能對(duì)斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的形成很重要。比較shank2a?/?、shank2b?/?和shank3&b雙純合模型的表型將是一件有趣的事情。本研究的另一個(gè)局限性是，我們沒有直接分析GABAergic的中間神經(jīng)元發(fā)育，也沒有檢查GABA激動(dòng)劑是否減輕了shank2b突變體的行為異常。此外，shank3&b缺陷斑馬魚模型更適合全面揭示shank2調(diào)控斑馬魚GABAergic網(wǎng)絡(luò)發(fā)育和行為的分子機(jī)制。總之，我們?cè)谝环N新的shank2b缺陷斑馬魚模型中揭示了與GABAergic系統(tǒng)功能障礙相關(guān)的ASD樣行為和感覺缺陷(圖5)。該模型是解剖人類SHANK2相關(guān)疾病的病理生理學(xué)的有價(jià)值的工具，可能有助于開發(fā)新的治療伴有異常感覺加工的ASD的方法。
圖5 shank2缺失斑馬魚模型中GABAergic系統(tǒng)調(diào)控的潛在機(jī)制
基金：這項(xiàng)研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金(2021NSFC: 82171540 和 82101945)、上海衛(wèi)健委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No.82171540 和 82101945)；shslczdzk02903)和國(guó)家自然科學(xué)基金(2017NSFC: 61733011)的支持。
原文：Wang Y, Liu C, Deng J, et al. Behavioral and Sensory Deficits Associated with Dysfunction of GABAergic System in a Novel shank2-Deficient Zebrafish Model[J]. International journal of molecular sciences, 2023, 24(3): 2208.
原文地址：https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2208
注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。
