雜志：PLOS Biology | https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000585 January 6, 2020
影響因子：9.8（2022）
年份：2019
通訊作者：caghan.kizil
通訊作者單位：德國(guó)Helmholtz協(xié)會(huì)神經(jīng)退行性疾病研究中心，德累斯頓
摘要
背景：最近有人提出，為大腦提供新的神經(jīng)元可以對(duì)抗阿爾茨海默病(AD)。這一具有挑釁性的想法需要在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試，從而研究疾病誘導(dǎo)的神經(jīng)元再生的分子基礎(chǔ)。我們之前發(fā)現(xiàn)斑馬魚可以刺激AD患者的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)可塑性和神經(jīng)發(fā)生，這有助于了解在患病哺乳動(dòng)物大腦中開(kāi)發(fā)新神經(jīng)元的機(jī)制。方法和結(jié)果：在這里，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白毒性誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-4 (IL4)通過(guò)抑制色氨酸代謝和減少血清素的產(chǎn)生促進(jìn)NSC增殖和神經(jīng)發(fā)生。血清素通過(guò)下調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在腦室周圍神經(jīng)元中的表達(dá)抑制NSC增殖。在斑馬魚中，BDNF通過(guò)激活b細(xì)胞(NFkB)信號(hào)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體A (NGFRA)/核因子“kappa-輕鏈增強(qiáng)子”增強(qiáng)NSC的可塑性和神經(jīng)發(fā)生，但在嚙齒動(dòng)物中沒(méi)有。結(jié)論：總的來(lái)說(shuō)，我們的結(jié)果表明，在斑馬魚AD后，復(fù)雜的神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞相互作用調(diào)節(jié)再生神經(jīng)發(fā)生。關(guān)鍵詞：AD;色氨酸代謝;血清素;NSC;斑馬魚
前言
阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)包括突觸變性、神經(jīng)元死亡、慢性炎癥、血管功能受損和神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)可塑性降低等多種病理改變。在AD患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中觀察到的認(rèn)知能力下降主要是由神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)完整性降低引起的。傳統(tǒng)上，拯救認(rèn)知能力下降和神經(jīng)元死亡的努力主要集中在神經(jīng)元室和旨在防止神經(jīng)元的死亡，但這并沒(méi)有在臨床上取得預(yù)期的成功。提出了另一種方法，通過(guò)增加新神經(jīng)元的產(chǎn)生來(lái)補(bǔ)充神經(jīng)元室的治療，以提供患病電路的彈性和強(qiáng)度。然而，人類大腦中的神經(jīng)發(fā)生是相當(dāng)有爭(zhēng)議的。盡管許多報(bào)告記錄了人類成人神經(jīng)發(fā)生的存在，并且一些研究表明促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生可能是緩解認(rèn)知能力下降的可行選擇，但AD患者神經(jīng)發(fā)生結(jié)局的潛在益處需要進(jìn)一步調(diào)查和關(guān)鍵測(cè)試。此外，在AD條件下，哺乳動(dòng)物NSCs的增殖能力顯著降低，為了使神經(jīng)發(fā)生成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行選擇，哺乳動(dòng)物NSCs必須首先具有可塑性。因此，研究在AD過(guò)程中NSCs如何增殖和神經(jīng)源性可以為該疾病的治療提供重要的臨床影響;然而，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞增強(qiáng)其增殖反應(yīng)的機(jī)制知之甚少。最近，我們建立了一個(gè)斑馬魚模型，該模型可以概括人類AD的癥狀，如神經(jīng)元死亡、突觸變性、慢性炎癥和認(rèn)知能力下降。有趣的是，與人類相比，斑馬魚的大腦可以通過(guò)一種先前未被發(fā)現(xiàn)的涉及白細(xì)胞介素-4 (IL4)的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)NSC的增殖和神經(jīng)發(fā)生。死亡神經(jīng)元分泌的IL4激活小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而激活NSC增殖。我們還發(fā)現(xiàn)，在AD的體外3D還原模型中，IL4可以逆轉(zhuǎn)NSC的病理作用。然而，IL4在淀粉樣蛋白毒性后調(diào)控NSC增殖和神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。在這篇論文中，使用單細(xì)胞測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)了一種先前未被記錄的IL4依賴機(jī)制，該機(jī)制調(diào)節(jié)成年斑魚大腦中的NSC可塑性，通過(guò)該機(jī)制，IL4調(diào)節(jié)血清素的產(chǎn)生，從而抑制NSCs并置于腦室周圍神經(jīng)元中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)BDNF需要通過(guò)其受體神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體A (NGFRA)激活NSC的可塑性、NSCs的增殖和神經(jīng)發(fā)生，而NGFRA的阻斷會(huì)降低NSC的增殖?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的研究結(jié)果確定了IL4通過(guò)斑馬魚大腦神經(jīng)元中BDNF的血清素依賴性表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)NSC可塑性的機(jī)制，并證明了NSCs基于受體表達(dá)的功能異質(zhì)性。我們的研究結(jié)果將為NSCs的神經(jīng)免疫調(diào)控、NSC增殖的神經(jīng)元控制以及NSC亞型對(duì)斑馬魚不同信號(hào)的差異反應(yīng)提供概念基礎(chǔ)。這種理解可能有助于通過(guò)增加神經(jīng)發(fā)生來(lái)開(kāi)發(fā)AD的新療法。
道德聲明
所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照德國(guó)薩克森州管理辦公室(landesdirecktion Sachsen)的Referate 25/26 (Veterin?rwesen, Pharmazie, und GMP)和德累斯頓工業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)(Kommission f<e:1> r Tierversuche)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可進(jìn)行。根據(jù)指南和歐盟指令2010/63第33條和附件III(許可證編號(hào):TVV-35/2016和TVV-52/2015)維護(hù)和處理斑馬魚。小鼠實(shí)驗(yàn)中，APP/PS1小鼠按既定方案飼養(yǎng)繁殖(許可號(hào):TVV 87/2016)。
動(dòng)物處理和飼養(yǎng)
在斑馬魚研究中，使用6- 8月齡野生型AB株、Tg(her4.1:GFP)和Tg(NFkB GFP)兩種性別的魚。在每組實(shí)驗(yàn)中，將同一窩魚隨機(jī)分配到不同的實(shí)驗(yàn)組。小鼠實(shí)驗(yàn)采用12個(gè)月大的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型幼鼠(僅限雄性)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)θN裝(全胚胎或解剖腦)和成人腦切片進(jìn)行原位雜交和抗體標(biāo)記。
成年斑馬魚的肽合成、腦室顯微注射
a - β42的合成采用標(biāo)準(zhǔn)的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc) (Merck, Darmstadt, Germany)化學(xué)，以2-(1h -苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲基六氟磷酸(HBTU) (Merck, Darmstadt, Germany)作為偶聯(lián)劑，在自動(dòng)化固相肽合成儀上進(jìn)行，如先前詳細(xì)描述的。如前所述，在成年斑馬魚腦中進(jìn)行腦室顯微注射(CVMI)。簡(jiǎn)而言之，斑馬魚首先被麻醉，直到眼球運(yùn)動(dòng)停止。使用30g的針尖在視神經(jīng)頂蓋上方的顱骨上做了一個(gè)小切口，但沒(méi)有損傷腦組織。裝有注射溶液的玻璃毛細(xì)管(WPI, Saratosa, FL)通過(guò)切口插入，使玻璃毛細(xì)管的尖端朝向端腦。如前所述，使用最佳微注射器參數(shù)進(jìn)行注射。PBS (1 μl)， Aβ42 (1 μl, 20 μl)， IL4 (1 μl, 10 μg/ml, ThermoFisher Scientific, Darmstadt, Germany)， BDNF (1 μl, 100ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN)， 5-HT (1 μl, 100 μl, Merck, Darmstadt, Germany)， ngfra mori注射pholino (Iul, 10uM)。更多信息見(jiàn)S1表。
BrdU治療
將實(shí)驗(yàn)斑馬魚浸入新鮮配制的10 mM BrdU (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)溶液中，每天以2和3 dpi浸泡8小時(shí)。在所有BrdU-chase實(shí)驗(yàn)中，在14 dpi時(shí)處死魚，并對(duì)腦樣本進(jìn)行組織學(xué)準(zhǔn)備。
斑馬魚組織制備，免疫組化和ISH
在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)殺死斑馬魚，解剖頭部，使用2%多聚甲醛在4℃下進(jìn)行過(guò)夜固定(Merck, Darmstadt, Germany)。為了冷凍保護(hù)和脫鈣，將頭在20%蔗糖(Merck, Darmstadt, Germany) / 20%乙二胺四乙酸(EDTA, Merck, Darmstadt, Germany)溶液中4℃孵育過(guò)夜。第二天，將頭包埋在20%蔗糖(Merck, Darmstadt, Germany) /7.5%明膠(Merck, Darmstadt, Germany)的冷凍保護(hù)劑切片樹(shù)脂中，在80°C下保存。這些樣品使用低溫恒溫器冷凍切片成12um厚的切片，并收集到玻璃載玻片上，然后在-20°C保存對(duì)于免疫組化，切片在室溫下干燥，然后在含0.03% Triton X-100 (Merck, Darmstadt, Germany) (PBSTx)的PBS中洗滌。然后將載玻片與所需的一抗在4°C下孵育過(guò)夜。次日，用PBSTx洗滌3次載玻片，在室溫下用合適的二抗孵育2小時(shí)。然后用aquamount (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany)清洗幾次載玻片。TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，使用ApopTag Red原位凋亡檢測(cè)試劑盒(Merck, Darmstadt, Germany)。對(duì)于ISH，使用DIG RNA標(biāo)記試劑盒(Roche, Basel, Switzerland)從以下基因轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建的克隆中生成地高igenin (DIG, Roche, Basel, Switzerland)標(biāo)記探針:htrlaa, htrlab, htrld, bdnf, ntrk2a, ngfra。斑馬魚組織制備、冷凍切片、免疫組化和ISH的詳細(xì)方案先前已被描述。有關(guān)試劑的進(jìn)一步信息見(jiàn)S1表。
實(shí)時(shí)定量PCR
從每個(gè)實(shí)驗(yàn)的成年斑馬魚端腦中分離總RNA 1 dpi后分組。使用Superscript IV VILO Master混合試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)根據(jù)制造商的要求，從每組中提取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 er的指示。實(shí)時(shí)PCR在CFX96 real-time System (BIORAD， Hercules, CA)， 10 μl反應(yīng)體積包含SYBR Green I Master mix(羅氏， 巴塞爾，瑞士)，1um引物和cDNA。qPCR數(shù)據(jù)分析采用rela- pcr法 使用β -肌動(dòng)蛋白作為管家基因的保護(hù)性基因表達(dá)方法。所用引物的列表 qPCR的方法見(jiàn)S1表。
成年小鼠腦內(nèi)注射BDNF
在小鼠實(shí)驗(yàn)中，將100 ng BDNF (1 μl, 100μg/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN)注射到成年小鼠的一個(gè)腦半球，另一個(gè)腦半球注射1 ul PBS作為對(duì)照。注射過(guò)程按照先前制定的方案進(jìn)行[96]。將小鼠置于誘導(dǎo)室中，用氧和異氟烷(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)混合流麻醉。在動(dòng)物平躺后，氣體流向立體定向框架的鼻錐。然后迅速將小鼠置于鼻錐上，以持續(xù)供應(yīng)異氟烷和氧氣。耳柵被固定以固定頭部。手術(shù)前皮下注射鎮(zhèn)痛劑，以減少麻醉恢復(fù)后可能出現(xiàn)的疼痛。在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，動(dòng)物被放置在預(yù)熱的熱墊上，以防止體溫過(guò)低。為了防止角膜脫水和進(jìn)一步致盲，用保護(hù)軟膏覆蓋眼睛。手術(shù)中使用的所有工具均使用乙醇和/或Microzide (Sigma-Aldrich, Darmstadt，德國(guó))消毒。以布雷格瑪為參照點(diǎn)，在大腦兩側(cè)確定注射到DG的坐標(biāo)，并在顱骨上仔細(xì)鉆孔。然后緩慢插入毛細(xì)管至距顱骨水平1,900 um深度，并以200 nl/min的速度注入1 μl BDNF (100ug/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN)。注射后將毛細(xì)血管保持在體內(nèi)5分鐘以防止后濺，然后緩慢縮回。在另一個(gè)半球進(jìn)行相同的程序，注射1ul PBS。然后釋放耳條，用PBS浸濕皮膚以恢復(fù)彈性并縫合。然后用消毒液(聚維酮，Sigma，達(dá)姆施塔特，德國(guó))處理傷口。將小鼠置于單獨(dú)的籠子中，在紅燈下與水和預(yù)先浸泡的食物(使動(dòng)物更容易在手術(shù)后咬人)。術(shù)后24小時(shí)再次注射鎮(zhèn)痛藥。注射后48小時(shí)處死小鼠，取腦并進(jìn)一步處理。
小鼠組織準(zhǔn)備和染色
取腦時(shí)，成年小鼠經(jīng)腹腔注射a 氯胺酮(Bio-Techne GmbH，威斯巴登，德國(guó))和Xylazine (Sigma- Aldrich, Darmstadt，德國(guó))(0.25 mL / 25 g體重)，然后心內(nèi)注射 用0.9% NaCl(默克，達(dá)姆施塔特，德國(guó))灌注，然后是冷新鮮制備的4% PFA(磷酸鹽緩沖液[pH 7.4])。術(shù)后取灌注腦，4%固定 在4?C條件下將PFA浸泡24小時(shí)，然后用PBS洗滌3次。對(duì)于組織的冷凍保存， 固定的大腦進(jìn)一步在30%蔗糖中孵育過(guò)夜(默克，達(dá)姆施塔特，德國(guó)) 在4?C的PBS溶液中。用微電極制備了40 μm厚度的自由漂浮切片 采用徠卡SM2010R, Nussloch，德國(guó))，連續(xù)收集6個(gè)系列 24孔板中的低溫保存液。然后將切片保存在- 20?C下進(jìn)行進(jìn)一步保存 實(shí)驗(yàn)。在IHC前，將自由漂浮的切片在PBS中洗滌3次，封閉 10%驢或山羊血清(Abcam，劍橋，英國(guó))與0.2% Triton X-100(默克，達(dá)姆- 在4?C條件下孵育過(guò)夜 用0.2% Triton X-100在3%驢或山羊血清(Abcam，劍橋，英國(guó))中確定稀釋的所需一抗。切片在1小時(shí)內(nèi)清洗3次 在室溫下用正確的二抗試劑再孵育4小時(shí) 符合所需的熒光團(tuán)。經(jīng)過(guò)短時(shí)間洗滌后，樣品在DAPI (Invi- trogen, Carlsbad, CA)在PBS(1:5 000)中稀釋10分鐘。另設(shè)3個(gè)洗滌步驟 然后將樣品安裝在帶電玻片上(SuperFrostTM，默克， 達(dá)姆施塔特,德國(guó))。安裝好后，將玻片晾干，用蓋玻片覆蓋 使用Aqua Mount。有關(guān)試劑的進(jìn)一步信息見(jiàn)S1表。
成像和量化
使用ZEN軟件(Carl Zeiss, Jena, Germany)在配有apoome或Zeiss Axiolmager Z1 (Oberkochen, Germany)的蔡司熒光顯微鏡上獲取圖像，并使用ZEN (Carl Zeiss, Jena, Germany)或ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)軟件進(jìn)行分析。定量以雙盲方式進(jìn)行。斑馬魚的體視定量是通過(guò)人工計(jì)數(shù)從端腦(尾側(cè)嗅球到吻側(cè)視頂蓋)整個(gè)部分的三分之一進(jìn)行的。使用ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)軟件的3D對(duì)象計(jì)數(shù)器模塊對(duì)血清素能密度進(jìn)行定量。除非另有說(shuō)明，在所有ISH和IHC染色中，至少使用4只動(dòng)物，每只動(dòng)物至少使用5至12個(gè)組織學(xué)切片進(jìn)行體視學(xué)分析。
統(tǒng)計(jì)分析
所有試驗(yàn)至少進(jìn)行2次重復(fù)。對(duì)于兩個(gè)特定實(shí)驗(yàn)組的比較，采用雙尾Student t檢驗(yàn)。使用Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。圖中的誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。*(p< 0.05)， (p< 0.01)， (p< 0.001)表示顯著性，n.s.(無(wú)顯著性，p>0.05)。沒(méi)有樣本集被排除在分析之外，除非組織學(xué)切片在采集過(guò)程中嚴(yán)重受損(占分析的所有切片少于4%)。
細(xì)胞解離，分選，全轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞測(cè)序
使用冰冷的PBS對(duì)端腦進(jìn)行解剖，使用神經(jīng)組織解離試劑盒(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)按照制造商的說(shuō)明并按照前面的描述[30]進(jìn)行細(xì)胞解離。按照描述[20,30]對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序。對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序，分離的細(xì)胞通過(guò)40微米的細(xì)胞過(guò)濾器?；钚灾甘緞?碘化丙啶，默克，達(dá)姆施塔特，德國(guó))和綠色熒光蛋白對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行分選。將細(xì)胞懸液裝入10X Chromium系統(tǒng)(10X Genomics, Pleasanton, CA)[97]。10X庫(kù)是按照制造商的說(shuō)明準(zhǔn)備的。原始測(cè)序數(shù)據(jù)由10X genomics提供的默認(rèn)選項(xiàng)的cell ranger軟件處理。這些reads與斑馬魚參考轉(zhuǎn)錄組(ENSEMBL Zv10, release 91)對(duì)齊。Seurat (https://satijalab.org/seurat/)[98]使用分析矩陣作為下游數(shù)據(jù)分析的輸入。按照描述進(jìn)行分析。
數(shù)據(jù)分析
由Seurat Read10X函數(shù)用于生成矩陣。包含超過(guò)1000個(gè) 15,000個(gè)UMI基因和500 ~ 2,500個(gè)獨(dú)特基因被納入研究。多單元和線粒體基因超過(guò)6%的細(xì)胞被從進(jìn)一步分析中移除。在少于5個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因也從分析中被移除。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理 采用“LogNormalize”方法，并用“scale”進(jìn)行縮放。因子= 1e4”?？勺兓?使用FindVariableGenes檢測(cè)。每個(gè)樣本中最易變的前1000個(gè)基因是 合并，對(duì)變異基因進(jìn)行典型相關(guān)分析(CCA)。一個(gè)使用RunMultiCCA函數(shù)，使用num.ccs = 30創(chuàng)建合并的Seurat對(duì)象。的 典型相關(guān)強(qiáng)度使用num.dims = 1:30計(jì)算。減少是每由還原形成的。Type = " cca "， dims。使用= 1:30。使用模糊對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)齊。Align = 1:30。使用排列整齊的CCA和1:30的亮度，以分辨率發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán) 1.0. 使用tSNE函數(shù)在2D上顯示簇。我們確定了主要的細(xì)胞群和 神經(jīng)元和pc亞群如所述。
通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)、途徑分析和相互作用映射來(lái)識(shí)別細(xì)胞類型
我們使用所有錯(cuò)誤檢測(cè)率(FDR) <0.1的標(biāo)記基因進(jìn)行基因本體(GO)分析和kegg通路分析，使用GOStats(1.7.4)和GSEABase(1.40.1)作為閾值，p< 0.05。為了確定deg，我們使用FindMarkers函數(shù)，使用所有樣本中至少有3個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞簇。對(duì)于顯著表達(dá)的基因，采用p <0.05。利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)血清素單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定。確定3個(gè)樣本(PBS、AB42和IL4如前所述每個(gè)細(xì)胞的前5個(gè)標(biāo)記基因。這些基因被用來(lái)訓(xùn)練隨機(jī)森林算法(https://cran.r-project.org/web/packages/randomForest/index.html)從現(xiàn)有樣本中學(xué)習(xí)細(xì)胞類型。對(duì)5-HT處理后的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)測(cè)。如前所述，我們鑒定了標(biāo)記基因、deg和相互作用圖譜[34]。我們還進(jìn)行了Seurat (https://satijalab.org/seurat/)分析，并確定無(wú)論使用何種方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)論都是一致的(S5圖)。為了識(shí)別特定細(xì)胞類型中的deg，我們?cè)趓 -對(duì)象中添加了新的“標(biāo)識(shí)”如下:處理(PBS, AB42, IL4, 5HT或AB42/IL4細(xì)胞一起)_主要細(xì)胞類型(Im, PC, NN, OPC/ODI或OPC/OD_2) _受體名稱。每次處理后，使用Seurat中的FindMarkers功能鑒定每個(gè)細(xì)胞中的deg。p<0.05, lavg_logFC >0.25個(gè)為顯著表達(dá)基因;如前所述，過(guò)多代表的Go術(shù)語(yǔ)和KEGG通路使用p< 0.05。從deg中選擇htrld陽(yáng)性細(xì)胞，絕對(duì)對(duì)數(shù)倍變化標(biāo)準(zhǔn)>0.25。
電生理學(xué)
成年斑馬魚在冷凍的細(xì)胞外溶液中進(jìn)行冷麻醉。頭骨被移除了，以便進(jìn)入大腦。仔細(xì)解剖腦組織并轉(zhuǎn)移到記錄室，連續(xù)灌注細(xì)胞外溶液，其中含有135.2 mM NaCl (Merck, Darmstadt, Germany)、2.9 mM KCI (Merck, Darmstadt, Germany)、2.1 mM CaCl2 (Merck, Darmstadt, Germany)、10 mM HEPES (Merck, Darmstadt, Germany)和10 mM葡萄糖(pH 7.8;290 mOsm(默克，達(dá)姆施塔特，德國(guó))。對(duì)于her4.1:GFP細(xì)胞在電壓鉗模式下的細(xì)胞內(nèi)全細(xì)胞記錄，電極(電阻，3-5 MΩ)從硼硅酸鹽玻璃(外徑，1.5 mm;內(nèi)徑:0.87 mm;Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Germany)，在微移液器(Sutter Instruments, Novato, CA)上填充細(xì)胞內(nèi)溶液，其中含有120 mM k -葡萄糖酸鹽(Merck, Darmstadt, Germany)， 5 mM KCI (Merck, Darmstadt, Germany)， 10 mM HEPES (Merck, Darmstadt, Germany)， 4 mM MgATP (Merck, Darmstadt, Germany)， 0.3 mM NaGTP和10 mM na -磷酸肌酸(pH 7.4;275 mOsm，默克，達(dá)姆施塔特，德國(guó))。在顯微鏡下觀察gfp陽(yáng)性細(xì)胞;Luigs & Neumann, Ratingen, Germany)配備了CCD相機(jī)(Lumenera)，然后專門針對(duì)他們。在施加恒定正壓的情況下，使用電動(dòng)微機(jī)械(Luigs & Neumann, Ratingen, Germany)將細(xì)胞內(nèi)膜片鉗電極推進(jìn)到細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)用MultiClamp 700B細(xì)胞內(nèi)放大器(Molecular Devices, San Jose, CA)放大。在整個(gè)錄音過(guò)程中，所有細(xì)胞都夾緊在70 mV。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(23°C±1°C)下進(jìn)行。血清素(100 μ m;在所有記錄的生理溶液中加入Sigma-Aldrich，達(dá)姆施塔特，德國(guó))，使用AxoGraph(版本X 1.5.4;AxoGraph Scientific，悉尼，澳大利亞)或Clampfit(版本10.6;Molecular Devices, San Jose, CA)。
結(jié)果
為了確定IL4對(duì)成年斑馬魚大腦NSC可塑性的影響，我們通過(guò)腦室顯微注射給予IL4，在注射后1天(dpi)解剖端腦，從GFP陰性細(xì)胞中分離her4.1:綠色熒光蛋白(GFP)陽(yáng)性的NSCs，并在對(duì)照組和注射IL4的大腦中對(duì)這兩種細(xì)胞群進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析(圖1A,S1數(shù)據(jù))。當(dāng)我們比較gfp陰性細(xì)胞群中包含非nsc細(xì)胞類型(包括神經(jīng)元和免疫細(xì)胞)的基因表達(dá)譜時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)IL4增加了285個(gè)基因的表達(dá)，下調(diào)了1435個(gè)基因的表達(dá)(圖1B, S1數(shù)據(jù))。為了確定受IL4影響的途徑，我們進(jìn)行了京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析，并觀察到其中一個(gè)顯著調(diào)節(jié)的途徑是色氨酸代謝(圖1C, S1圖)。具體來(lái)說(shuō)，我們觀察到從色氨酸產(chǎn)生血清素的酶是下調(diào)(圖1D, S2數(shù)據(jù))，表明IL4可能會(huì)減少血清素(5-HT)的產(chǎn)生。為了測(cè)試淀粉樣β42 (Aβ42，誘導(dǎo)IL4表達(dá)和異位IL4是否會(huì)降低成年斑馬魚大腦中5-HT的可用性，我們對(duì)5-HT進(jìn)行了免疫組化(圖1E)，并觀察到Aβ42和IL4顯著降低了成年斑馬魚端腦在1 dpi時(shí)的5-HT免疫反應(yīng)性(圖1F)，這是由于tph2酶的表達(dá)減少，tph2酶是一種負(fù)責(zé)產(chǎn)生血清素的酶(圖1G)。我們發(fā)現(xiàn)Aβ42或IL4不會(huì)誘導(dǎo)5-HT細(xì)胞死亡，因?yàn)樵贏β42或IL4處理后，存在于上縫區(qū)的5-羥色胺能細(xì)胞的細(xì)胞體是完整的，而不是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)陽(yáng)性(S2圖)。這些結(jié)果表明，a - β42和IL4抑制血清素的產(chǎn)生而不是神經(jīng)支配。此外，IL4的作用是特定于血清素能系統(tǒng)的，因?yàn)樵谖覀兊纳疃葴y(cè)序分析中，我們沒(méi)有觀察到其他神經(jīng)遞質(zhì)通路(如多巴胺、組胺或去甲腎上腺素)的KEGG分析的變化(S2數(shù)據(jù))。
圖1 IL4調(diào)節(jié)色氨酸代謝。(A)實(shí)驗(yàn)管路整體示意圖 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序IL4處理。(B) DEGs的MA-plot。(C) DEGs的GO-term分析。(D)修改色氨酸代謝的kegg通路觀點(diǎn)綠色表示被IL4下調(diào)的酶。(E) IHC 5-HT在對(duì)照組(左)，a β42注射組(中)，il4注射組(右)。單通道圖像顯示5-HT。紅色的 插圖是箭頭區(qū)域的高倍圖像。(Dm:背側(cè)-內(nèi)側(cè))(F) 5-HT-span區(qū)域的量化 E. (G) qRT-PCR結(jié)果tph1a, tph1b和tph2在對(duì)照組，淀粉樣蛋白注射，和 il4注射斑馬魚大腦。用于正常化的β -肌動(dòng)蛋白。N = 3只動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)。比例尺相等 100μM。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。參見(jiàn)S1圖和S2圖。支持參見(jiàn)S2數(shù)據(jù)和S7數(shù)據(jù) 信息。一個(gè)β42,amyloid-beta42;DEG，差異表達(dá)基因;ECM，細(xì)胞外基質(zhì);FC, fold change; FDR:錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率;GFP，綠色熒光蛋白;GO，基因本體;包含IHC,免疫組織化學(xué);KEGG, 京都基因與基因組百科全書;IL4 interleukin-4;MA: Bland-Altman平均圖;存在, 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng);5 -羥色胺。
圖S1 IL4處理后的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析(A)樣本相關(guān) 定位熱圖和主成分分析。(B, C) KEGG富集通路列表(B) (D)生物過(guò)程的GO術(shù)語(yǔ)。(E)分子功能的GO項(xiàng)。(F)色氨酸代謝的詳細(xì)情況。綠色:下調(diào)酶，紅色:上調(diào)酶 IL4后的酶。與圖1相關(guān)。支持信息請(qǐng)參見(jiàn)S1數(shù)據(jù)和S2數(shù)據(jù)。去, 基因本體論;IL4 interleukin-4;KEGG，京都基因和基因組百科全書。
圖S2 淀粉樣蛋白或IL4不會(huì)導(dǎo)致5-HT神經(jīng)元死亡(A-C) 5-HT免疫染色 在成年斑馬魚大腦尾部區(qū)域:中縫上(A, A′)，松果體柄(B)和 (d)下丘腦室旁器官(PVO)的5-HT和TUNEL染色 對(duì)照(D, E)， a β42注射(F, G)和il4注射(H, I)斑馬魚大腦。(D、F、H) PVO區(qū); (E, G, I)上中縫。(F1, F2)面板f中盒子的高倍放大圖像(G1) 面板g中盒子的放大倍率較高，比例尺為50 μM。與圖1相關(guān)。一個(gè)β42歲 amyloid-beta42;IL4 interleukin-4;PVO，室旁器官;TUNEL，末端脫氧核糖核酸 氯基轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記法;5 -羥色胺。由于a - β42/IL4增強(qiáng)了成年斑馬魚大腦中NSC的增殖，并且它們下調(diào)5-HT(圖1E和1F)，我們假設(shè)5-HT可能對(duì)NSC的可塑性產(chǎn)生負(fù)面影響。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們將5-HT注射到成年斑馬魚大腦中，并分析了1dpi時(shí)NSCs (S100鈣結(jié)合蛋白B (S100β)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)雙陽(yáng)性細(xì)胞)的增殖情況(圖2A-2C)。我們觀察到注射5-HT后NSC增殖顯著減少(減少32%)(圖2C)。這種減少對(duì)NSCs的神經(jīng)發(fā)生有影響，因?yàn)閷?duì)5-溴-2 ' -脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記的新生神經(jīng)元在14 dpi PBS(圖2D)或5-HT(圖2E)下的分析顯示，5-HT使神經(jīng)發(fā)生結(jié)果降低了12%(圖2F)。為了驗(yàn)證我們的結(jié)果，我們使用了一種轉(zhuǎn)基因報(bào)告系，用her4.1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP標(biāo)記NSCs，并注射a β42、IL4或5-HT，然后以1 dpi的速度注射GFP和PCNA的免疫組織化學(xué)(IHC)(圖2G)。與我們之前的結(jié)果一致，a - β42和IL4注射分別使NSC增殖增加了35%和42%，而5-HT使增殖祖細(xì)胞的數(shù)量減少了18%(圖2H)，這表明5-HT對(duì)斑馬魚端腦NSC可塑性有負(fù)面影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證a - β42或IL4是否可以逆轉(zhuǎn)5-HT的負(fù)面作用，我們將a - β42和IL4共同注射5-HT，觀察到a - β42或IL4可以消除5-HT對(duì)NSC增殖的抑制作用(S3圖)，這表明5-HT信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)NSCs中的IL4具有拮抗作用。我們之前的研究結(jié)果表明，一部分NSCs表達(dá)IL4受體，因此可以直接受到IL4的調(diào)節(jié)。因此，我們的目的是研究5-HT是否會(huì)影響相同的NSCs亞群，還是會(huì)影響不同的人群。圖2I和2J)和5-HT的神經(jīng)支配(圖2I和2K)。我們觀察到，NSCs位于腦室周圍區(qū)(PVZ)神經(jīng)元的頂端，位于腦組織中5-羥色胺能神經(jīng)支配的近端前(圖2I)，這表明5-HT對(duì)NSCs的影響可能是間接的。如果這一假設(shè)成立，NSCs將不表達(dá)5-HT受體。為了確定哪些細(xì)胞表達(dá)5-HT受體，我們對(duì)5-HT受體(htr基因)進(jìn)行了原位雜交(ISH)，并觀察到在7個(gè)5-羥色胺受體基因和這些基因的總共21個(gè)亞型中(S2數(shù)據(jù))，只有htr1a和htr1d在成年斑馬魚端腦中發(fā)出ISH信號(hào)(圖2L-2M′)。我們觀察到5 -羥色胺受體基因在祖細(xì)胞中不表達(dá)(S3圖)，支持先前的發(fā)現(xiàn)，并表明5 -羥色胺不直接作用于NSCs。為了進(jìn)一步研究這一假設(shè)，我們對(duì)9個(gè)her4.1: gfp陽(yáng)性的NSCs和7個(gè)相鄰的her4.1: gfp陰性的細(xì)胞(神經(jīng)元;S3圖)。我們發(fā)現(xiàn)，在9個(gè)記錄的NSCs中(其中3個(gè)存在河豚毒素[TTX])，沒(méi)有一個(gè)對(duì)血清素有反應(yīng)(S3圖)。對(duì)于神經(jīng)元，我們記錄了8個(gè)(2個(gè)在TTX存在下)，其中7個(gè)對(duì)其有反應(yīng)這進(jìn)一步證實(shí)了5 -羥色胺確實(shí)影響了成年斑馬魚大腦中的腦室周圍神經(jīng)元，而不是NSCs。如果5-HT作用于心室周圍神經(jīng)元，5-HT將激活其下游效應(yīng)物磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK)。pERK+核的定量分析也證實(shí)5-HT升高pERK+細(xì)胞核與Aβ42/il - 4相反(圖2O)，表明5-HT直接影響心室周圍神經(jīng)元，而不影響NSCs(圖2P)。
圖S3 Aβ42和IL4拮抗5-HT對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞可塑性的間接作用 (A - d)對(duì)照組(A)、5-HT注射組(B)、5-HT + Aβ42注射組(5-HT + Aβ42) S100β和PCNA免疫組化染色 (C)和5-HT + il4注射(D)斑馬魚大腦。(E)增殖膠質(zhì)細(xì)胞的定量 在任何情況下。(F) her4.1+細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞中所有5 -羥色胺受體的讀碼數(shù) (pc)在成年斑馬魚端腦作為圖形表征而衍生 深度測(cè)序結(jié)果。膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物gfap和s100作為陽(yáng)性對(duì)照。(G)伊什 htr1aa、htr1ab和htr1d組合。注意祖細(xì)胞/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)血清素 受體。(H) 1個(gè)月大的her4.1的電生理:GFP斑馬魚端腦。綠色熒光蛋白 用電極修補(bǔ)+細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞(NSCs)，觀察5-HT對(duì)細(xì)胞膜的影響 測(cè)量極化情況。神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)5-HT沒(méi)有反應(yīng)，而腦室周圍神經(jīng)元對(duì)5-HT有反應(yīng) 是gfp陰性的。n比;9用于電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。比例尺為100 μM。與圖2相關(guān)。支持信息請(qǐng)參見(jiàn)S7數(shù)據(jù)。一個(gè)β42,amyloid-beta42;包含IHC方面, nohistochemistry;IL4 interleukin-4;NSC，神經(jīng)干細(xì)胞;PC，祖細(xì)胞;PCNA, prolif - 增殖細(xì)胞核抗原;S100β,5 -羥色胺。
圖2 5-羥色胺通過(guò)腦室周圍神經(jīng)元的HTR1信號(hào)間接調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的可塑性。(A, B) 對(duì)照(A)和5- ht注射(B)大腦中S100β和PCNA的免疫組化。(C)增殖膠質(zhì)細(xì)胞的定量 (D, E) BrdU處理后14 dpi時(shí)新生神經(jīng)元的BrdU和HuC/D的IHC 2和3 dpi (D)和BDNF注射(E)。(F)新生神經(jīng)元定量。(G) GFP的免疫組化(由膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)) 啟動(dòng)子her4.1)和PCNA在對(duì)照組，il4注射，a β42注射和5- ht注射腦。(H)量化 her4.1驅(qū)動(dòng)的GFP和5-HT的panel g (I-K) IHC條件下增殖的膠質(zhì)細(xì)胞。合成圖像(I)和 her4.1的單熒光通道:GFP (J)和5-HT (K) (M) htr1d的ISH (M′:M框區(qū)域的特寫圖像)。(N) pERK和htr1d的IHC 在對(duì)照和5- ht注射的大腦中，her4.1驅(qū)動(dòng)的GFP(O) perk陽(yáng)性腦室周圍神經(jīng)元的定量。(P) 5-HT間接調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞可塑性的工作假說(shuō)。N = 4只動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)。規(guī)模的酒吧 等于100 μM。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。支持信息參見(jiàn)S7數(shù)據(jù)。一個(gè)β42歲 amyloid-beta42;BDNF，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;BrdU, 5-bromo-2脫氧尿苷;Dpi，注射后天數(shù); GFP，綠色熒光蛋白;HTR1, 5-羥色胺受體1;HuC/D, ELAV(胚胎致死，異常) 視覺(jué)，果蠅)樣3/4;包含IHC,免疫組織化學(xué);IL4 interleukin-4;原位雜交(ISH);NSC,神經(jīng) 干細(xì)胞;活躍,磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶;PCNA，增殖細(xì)胞核抗原;PVZ, 運(yùn)動(dòng)前區(qū);S100β， S100鈣結(jié)合蛋白B;5 -羥色胺。為了通過(guò)hrt1+細(xì)胞確定5-HT和NSC可塑性之間的機(jī)制聯(lián)系(圖2P)，我們?cè)趯?duì)照和5-HT處理的成年斑馬魚端腦中進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，通過(guò)無(wú)偏聚類，確定細(xì)胞類型和差異基因表達(dá)分析，使用我們最近開(kāi)發(fā)的方法(S4A圖;S3數(shù)據(jù))。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制分析(S4B圖)，我們獲得了t分布隨機(jī)鄰居嵌入(tSNE)簇，其溶解為4種主要細(xì)胞類型:神經(jīng)元(eno2,gap43, map1aa, sypb陽(yáng)性)，膠質(zhì)細(xì)胞(gfap, her4.1, msi1, s100b陽(yáng)性)，少突膠質(zhì)細(xì)胞(aplnrb, olig2陽(yáng)性)和免疫細(xì)胞(pfn, lcp1陽(yáng)性;S4C-S4E圖)。熱圖揭示了在這些細(xì)胞中主要表達(dá)的標(biāo)記基因(S4D圖)。為了確定對(duì)5-HT有反應(yīng)的細(xì)胞，我們繪制了表達(dá)htr1的細(xì)胞，并觀察到htr1的表達(dá)僅限于神經(jīng)元(S4F圖)。這種表達(dá)模式與htr1基因的ISH結(jié)果一致(圖2M, S3G圖)，并且與il4r不重疊。表達(dá)1的細(xì)胞完全是膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞([30]和S4F圖)。為了確定5- ht反應(yīng)細(xì)胞影響膠質(zhì)細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)分析管道，我們從其余的htr1d+細(xì)胞中解剖，并在對(duì)照組和5-HT處理的大腦之間進(jìn)行差異表達(dá)分析(圖3A;S4G圖)。我們發(fā)現(xiàn)，5-HT處理后，3166個(gè)基因在htr1d+細(xì)胞中表達(dá)水平發(fā)生變化(圖3B,S4數(shù)據(jù))。我們假設(shè)htr1d+神經(jīng)元和NSCs之間可能通過(guò)旁分泌配體-受體串?dāng)_進(jìn)行調(diào)節(jié)。我們發(fā)現(xiàn)，在htr1d+細(xì)胞中，40種配體的表達(dá)水平發(fā)生了變化(圖3C)，其中3種配體在5-HT和IL4/ Aβ42處理后表達(dá)水平也發(fā)生了變化(圖3D，數(shù)據(jù)來(lái)自[34])。其中bdnf表達(dá)上調(diào)幅度最大(圖3D)。從單細(xì)胞分析中，我們發(fā)現(xiàn)bdnf主要在神經(jīng)元簇中表達(dá)(神經(jīng)元中90%，膠質(zhì)細(xì)胞中8%;圖3E, S4H圖)，而其受體ntrk2主要在神經(jīng)元中表達(dá)(68%的神經(jīng)元和28%的膠質(zhì);圖3E, S4H圖)，另一種BDNF受體ngfra主要是膠質(zhì)細(xì)胞(膠質(zhì)細(xì)胞93%，神經(jīng)元5%;圖3 e;S4H圖)。因此，我們假設(shè)成年斑馬魚腦中bdnf表達(dá)的5-HT依賴性調(diào)控可能通過(guò)ntrk2和ngfra向膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)出信號(hào)。
圖3 成年斑馬魚大腦5-羥色胺治療后的單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析(一) 單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析的工作流程示意圖(B) htr1d表達(dá)的DEGs分布圖 細(xì)胞經(jīng)5-HT處理后。(C)從圖b中選擇的配體(D)在5-HT和 IL4 /β42治療。(E) bdnf及其受體ntrk2和ngfra的特征圖。(F) NSCs/ pc的空間分布 如Cosacak等人之前于2019年所述。(G)淀粉樣蛋白中BDNF的計(jì)算機(jī)模擬相互作用圖 IL4與對(duì)照組以及5-HT與對(duì)照組的比較。(H) NGFRA在計(jì)算機(jī)模擬中的相互作用圖 Aβ42與對(duì)照組、IL4與對(duì)照組以及5-HT與對(duì)照組的比較。在面板G和H中，黑色箭頭: 與治療無(wú)變化的相互作用，青色箭頭:與治療失去相互作用，品紅箭頭:相互作用 隨著治療而獲得/出現(xiàn)。另見(jiàn)S4圖和S5圖。支持信息見(jiàn)S3數(shù)據(jù)和S4數(shù)據(jù)。一個(gè)β42,amyloid-beta42;BDNF，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;CVMI，腦室微量注射;度, 差異表達(dá)基因;GFP，綠色熒光蛋白;IL4 interleukin-4;NGFRA，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體 一個(gè);NSC，神經(jīng)干細(xì)胞;PC，祖細(xì)胞;5 -羥色胺。
圖S4 5 -羥色胺后成年斑馬魚端腦的單細(xì)胞測(cè)序分析 治療。(A)單細(xì)胞測(cè)序的工作流程示意圖。(B)質(zhì)量控制指標(biāo) 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù):主成分分析的VLN圖，可變基因 圖、基因數(shù)(nGene)分布圖、reads數(shù)(nUMI)分布圖、線粒體基因% (%mito)分布圖、%mito、nGene、%GFP分布圖(從排序 her4.1-GFP細(xì)胞)。(C)主要tSNE特征圖表明主要細(xì)胞簇具有典型 標(biāo)記物:sypb和gap43為神經(jīng)元，olig2和aplnrb為少突膠質(zhì)細(xì)胞，gfap和her4為 免疫細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)，pfn1和lcp1。(D)神經(jīng)元前40個(gè)標(biāo)記基因的初步熱圖， 膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。(E)主要細(xì)胞簇的分類 基于標(biāo)記的身份。(F) htr1和il4r表達(dá)特征圖。注意htr1-posi- 陽(yáng)性細(xì)胞是神經(jīng)元，而il4r陽(yáng)性細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞。(G)分離htr1-express-的策略 來(lái)自tSNE圖和隨后的差異表達(dá)分析的ing細(xì)胞。(H)的VLN圖 Bdnf, ngfra和ntrk2在主要細(xì)胞類型和表達(dá)水平比率的餅狀圖。有關(guān) 圖3所示。支持信息請(qǐng)參見(jiàn)S3數(shù)據(jù)。GFP，綠色熒光蛋白;tSNE t-Distrib - 非隨機(jī)鄰域嵌入;VLN，小提琴圖。為了進(jìn)一步研究通過(guò)Ntrk2或Ngfra傳遞的BDNF信號(hào)是否會(huì)影響NSCs，我們使用了我們最近開(kāi)發(fā)的計(jì)算機(jī)相互作用圖分析。根據(jù)這一分析，如果BDNF在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞(祖細(xì)胞)之間有潛在的相互作用，我們將看到這些細(xì)胞之間的硅相互作用。ntrk2或ngfra可以構(gòu)成神經(jīng)元簇和膠質(zhì)簇之間的串?dāng)_，我們將能夠看到相互作用(參見(jiàn)Cosacak及其同事了解相互作用映射的細(xì)節(jié))。為了進(jìn)行相互作用分析，我們使用了成年斑馬魚端腦NSCs的空間組織圖(圖3F)，根據(jù)我們之前的發(fā)現(xiàn)(Cosacak和同事)，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法區(qū)分了細(xì)胞類型，并將3種處理與對(duì)照組(IL4與對(duì)照組，淀粉樣蛋白與對(duì)照組，5-HT與對(duì)照組)進(jìn)行了比較;圖3G和3H;S5圖)。對(duì)于作圖，我們使用了以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn):(1)我們要么將bdnf作為起點(diǎn)(即，表達(dá)bdnf的細(xì)胞與表達(dá)任何bdnf受體的細(xì)胞匹配，要么將bdnf受體ntrk2和ngfra作為起點(diǎn)[即，只有表達(dá)ntrk2或ngfra的細(xì)胞與表達(dá)這些受體的任何配體的細(xì)胞匹配(圖3H為ngfra,S6A為ntrk2)]);(2)將潛在的相互作用繪制為箭頭，從表達(dá)bdnf的簇開(kāi)始到表達(dá)bdnf受體的簇(圖3G)，或者從表達(dá)其配體的簇開(kāi)始到表達(dá)bdnf受體的簇(圖3H)，并且根據(jù)任何處理后相互作用的變化，我們對(duì)相互作用進(jìn)行了顏色編碼(黑色箭頭表示相互作用未被處理改變，青色箭頭表示相互作用相互作用在治療后消失，洋紅色箭頭表示在特定治療后出現(xiàn)的相互作用)。圖3F和Cosacak及其同事屬于指向它們的箭頭數(shù)量最多的集群(圖3G)。有趣的是，大多數(shù)潛在的相互作用是在淀粉樣蛋白或IL4處理后新產(chǎn)生的，而這些相互作用主要在5-HT處理后消失(圖3G，綠色圓圈)，這表明bdnf對(duì)祖細(xì)胞(NSCs)的調(diào)節(jié)可以在淀粉樣蛋白或IL4處理后促進(jìn)，并被5-HT抑制，這與我們的假設(shè)是一致的。此外，為了支持我們的發(fā)現(xiàn)，我們對(duì)bdnf受體ntrk2和ngfra進(jìn)行了獨(dú)立的作圖分析。我們構(gòu)建了這些受體的相互作用圖，發(fā)現(xiàn)ngfra可能是成年斑馬魚端腦bdnf信號(hào)的主要受體，因?yàn)?個(gè)NSC簇(PC0和PC2)處于相互作用圖的中心，具有許多潛在的相互作用(圖3H, S4圖)，而ntrk2相互作用圖僅提供了與另一個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞簇的少量相互作用(S4圖，S6A圖)。我們觀察到IL4激活了許多通往NSC簇的相互作用途徑，而5-HT幾乎減少了NSCs與其他細(xì)胞之間的所有相互作用(圖3H)。這些硅分析表明，IL4促進(jìn)神經(jīng)元和NSCs之間的相互作用，而5-HT抑制這種相互作用。
圖S5 從頭聚類與Seurat和機(jī)器學(xué)習(xí)范式的比較。細(xì)胞在樣本(A)、隨機(jī)森林預(yù)測(cè)的細(xì)胞簇(B)和細(xì)胞中以顏色編碼 使用Seurat (C)對(duì)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行聚類分析。使用 與我們之前確定的神經(jīng)元和祖細(xì)胞集群([34])相同，我們使用隨機(jī)森林和 機(jī)器學(xué)習(xí)(B)。通過(guò)使用Seurat (C)，也可以推斷出de 新生。細(xì)胞簇和它們的頂級(jí)標(biāo)記基因是相同的，而一些細(xì)胞簇 (例如，神經(jīng)元)可以根據(jù)所使用的算法進(jìn)一步細(xì)分。顏色編碼 中間面板中使用的顏色與[34]中使用的顏色相同。pc的顏色也被用于 Seurat分析(A). Aβ42和5-HT組有少數(shù)細(xì)胞在其他組中不存在(con- 1) control和IL4)。這些細(xì)胞表達(dá)嗅球標(biāo)記，是嗅球內(nèi)細(xì)胞的污染 樣品制備。它們與我們分析的所有組分開(kāi)聚類，沒(méi)有影響 分析的生物學(xué)結(jié)局。與圖3相關(guān)。支持信息請(qǐng)參見(jiàn)S3數(shù)據(jù) 。一個(gè)β42,amyloid-beta42;IL4 interleukin-4;PC，祖細(xì)胞;5 -羥色胺。
圖S6 5 -羥色胺抑制和BDNF增強(qiáng)斑馬魚NSCs中的NFkB信號(hào)傳導(dǎo) (A)淀粉樣蛋白與對(duì)照的NTRK2、IL4與對(duì)照的計(jì)算機(jī)模擬相互作用圖 5-HT與對(duì)照的比較黑色箭頭:與治療無(wú)變化的相互作用，青色 箭頭:與治療的交互作用消失，洋紅色箭頭:與治療的交互作用獲得/出現(xiàn) 治療。(B) ntrk2在斑馬魚大腦中的ISH。(B′)特寫圖片。注意 pvz，而不是含有NSCs的vz。(C) Ntrk2蛋白在斑馬魚大腦的免疫組化，sup 移植ISH結(jié)果和pvz中Ntrk2的存在。(D, E)對(duì)照組pAkt的免疫組化(D)和 bdnf注射(E)大腦。BDNF激活pvz的pAkt，但不激活vz。(F) ngfra在成人中的ISH 斑馬魚telecephalon。(G) S100β， nfkb驅(qū)動(dòng)的GFP和PCNA的IHC在對(duì)照組，淀粉樣蛋白- 腦內(nèi)注射il4、5- ht和bdnf。大板下小板 圖像顯示單個(gè)熒光通道。(H)相對(duì)數(shù)量的量化 增殖的NSCs具有活躍的NFkB信號(hào)。比例尺為100 μM。數(shù)據(jù)是表示的 以平均值±SEM發(fā)送。與圖4相關(guān)。支持信息請(qǐng)參見(jiàn)S7數(shù)據(jù)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子, 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;GFP，綠色熒光蛋白;包含IHC immunohistochemis - 試著;IL4 interleukin-4;原位雜交(ISH);NFkB，核因子κ輕鏈- 激活b細(xì)胞的增強(qiáng)子;NSC，神經(jīng)干細(xì)胞;NTRK2，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)酪氨酸激酶 受體，2型;pAkt，磷酸化蛋白激酶B;PCNA，增殖細(xì)胞核抗體 創(chuàng);Pvz，腦室周圍區(qū);S100β， S100鈣結(jié)合蛋白B;Vz，心室區(qū); 5 -羥色胺。
為了驗(yàn)證我們對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)相互作用圖譜的計(jì)算機(jī)分析，并研究bdnf表達(dá)的變化，我們對(duì)對(duì)照組(圖4A)、注射5- ht(圖4B)和注射il - 4的大腦(圖4C)進(jìn)行了ISH。bdnf在對(duì)照腦中的表達(dá)位于靠近NSCs的PVZ區(qū)，這證實(shí)了我們的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。注射5-HT幾乎消除了bdnf的表達(dá)(圖4B)，而IL4則增強(qiáng)了bdnf的表達(dá)(圖4C)，這表明5-HT通過(guò)減少bdnf信號(hào)傳導(dǎo)抑制NSC的可塑性。鑒于5-HT抑制bdnf表達(dá)和NSC增殖，而IL4促進(jìn)bdnf表達(dá)和NSC增殖，我們假設(shè)bdnf也可以通過(guò)增加細(xì)胞增殖來(lái)增強(qiáng)NSC的可塑性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們將BDNF注射到成年斑馬魚大腦中(圖4D和4E)，并觀察到BDNF確實(shí)在1 dpi時(shí)使增殖的NSCs數(shù)量增加了27%(圖4E)。BDNF對(duì)NSCs增殖的增強(qiáng)也轉(zhuǎn)化為神經(jīng)發(fā)生的增加，因?yàn)榕c對(duì)照組注射的斑馬魚大腦相比，注射BDNF的大腦產(chǎn)生了更多的神經(jīng)元(增加了19%)(圖4F和4G)，這表明BDNF增強(qiáng)了成年斑馬魚大腦中的NSC可塑性。如果BDNF直接作用于NSCs，其受體必須存在于靶細(xì)胞中。ntrk2和ngfra進(jìn)行了ISH。我們觀察到ntrk2mRNA主要在端腦腦室周圍區(qū)域表達(dá)(圖4H和S6B)，這得到了NTRK2蛋白免疫組化染色(S6C圖)的支持。相反，ngfra主要在NSCs所在的心室區(qū)表達(dá)(圖4I, S6圖)。這些發(fā)現(xiàn)與我們的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)完全吻合(圖3E, S4H圖)，表明ngfra是NSCs中bdnf的主要受體，而ntrk2是神經(jīng)元中的主要受體。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將BDNF注射到成年斑馬魚大腦中，并確定了NTRK2和NGFRA信號(hào)通路的下游效應(yīng)物。為了確定對(duì)BDNF/NTRK2信號(hào)響應(yīng)的細(xì)胞，我們檢測(cè)了磷酸化蛋白激酶B (pAkt)的下游效應(yīng)物，并觀察到BDNF注射后，pAkt幾乎完全存在于心室周圍細(xì)胞和實(shí)質(zhì)神經(jīng)元中(與心室外細(xì)胞的強(qiáng)度和數(shù)量相比，心室區(qū)域的少數(shù)斑點(diǎn)占pAkt信號(hào)的0.1%以下;S6D和S6E圖)。相反，與對(duì)照組相比，BDNF注射增加了NFkB報(bào)告基因的活性，這是NSCs所在的心室區(qū)域NGFR信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)因子(圖4J-4M3)。此外，與我們之前的結(jié)果一致，我們觀察到在1 dpi時(shí)，BDNF注射后NFkB信號(hào)傳導(dǎo)和NFkB陽(yáng)性增殖NSCs (S100β /PCNA/NFkB: gfp三陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)量增加了47%，Aβ42注射后增加了28%，IL4注射后增加了25%，而5-HT注射后減少了10% (S6圖)。這些結(jié)果表明，ngfr介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)是成年斑馬魚大腦NSCs中5- ht依賴性BDNF活性的主要途徑。如果我們的假設(shè)成立，BDNF通過(guò)NGFRA和NFkB信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)NSC增殖，那么BDNF注射后敲低NGFRA受體可以抑制BDNF對(duì)NSC增殖的增加以及NFkB信號(hào)傳導(dǎo)的增加。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們使用morpholino寡核苷酸敲低ngfra，并測(cè)定NSCs的增殖程度(圖5A-5A5)。與對(duì)照組相比，BDNF使NSC增殖增加38%;對(duì)照morpholino沒(méi)有改變這種增加(仍然增加37%)，而ngframorpholino則減少(減少到13%)BDNF注射后NSC增殖增加(圖5B)。
圖4 5-羥色胺調(diào)節(jié)腦室周圍bdnf的表達(dá)和NSCs的NFkB信號(hào)傳導(dǎo)。(A - c)對(duì)照(A)， 5- ht注射(B)和il4注射的bdnf的ISH (C)的大腦。紅色矩形被放大到主面板的右側(cè)。注意5-HT后bdnf的表達(dá)顯著降低。(D, D′)PCNA和S100β的免疫組化 在對(duì)照(D)和bdnf注射(D)的大腦中。(E) BDNF注射后增殖膠質(zhì)細(xì)胞的定量。(F)對(duì)照組和對(duì)照組的BrdU和HuC/D的免疫組化 BDNF-injected大腦。(G)在PBS和BDNF注射后第2天和第3天，在BrdU處理后14 dpi的新生神經(jīng)元定量。(H) ntrk2的ISH 表達(dá)于腦室周圍神經(jīng)元，而不表達(dá)于腦室z區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞。(I)在vz中表達(dá)的ngfra的ISH。(J) S100β、nfkb驅(qū)動(dòng)的GFP和PCNA的IHC 在控制大腦中。大面板的右側(cè)是單熒光通道。(K)無(wú)DAPI的J面板內(nèi)側(cè)區(qū)域高倍放大。(K1-K3) 在bdnf注射的大腦中，S100β， nfkb驅(qū)動(dòng)的GFP和PCNA的面板k (L) IHC的單一熒光通道。大面板的右邊是單- 熒光通道。(M)不使用DAPI的L面板內(nèi)側(cè)區(qū)域高倍放大。(M1-M3)面板m單熒光通道比例尺相等 100μM。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。參見(jiàn)S4-S10圖。支持信息請(qǐng)參見(jiàn)S7數(shù)據(jù)。BDNF，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;BrdU, 5-bromo-2的脫氧尿苷;Dpi，注射后天數(shù);GFP，綠色熒光蛋白;HuC/D, ELAV(胚胎致死性，視力異常，果蠅)樣3/4;包含IHC, 免疫組織化學(xué);IL4 interleukin-4;原位雜交(ISH);NFkB，活化b細(xì)胞的核因子κ輕鏈增強(qiáng)子;NSC，神經(jīng)干細(xì)胞; PCNA，增殖核細(xì)胞抗原;Pvz，腦室周圍區(qū);S100β， S100鈣結(jié)合蛋白B;Vz，心室區(qū);5 -羥色胺。
圖5 Ngfr信號(hào)調(diào)節(jié)NSC可塑性不依賴于Il4ra信號(hào)。(A-A5)免疫組織化學(xué)檢測(cè)S100β和PCNA 對(duì)照(A)、對(duì)照嗎啉注射(A1)、ngfra嗎啉注射(A2)、BDNF注射(A3)、BDNF +對(duì)照 嗎啉注射(A4)和嗎啉注射BDNF + ngfra (A5)腦。(B)相對(duì)人的量化 增殖的膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。(C)神經(jīng)膠質(zhì)tSNE圖中ngfra和ilr4表達(dá)的共同表達(dá)。(D)度 IL4處理后ngfra陽(yáng)性和il4r陽(yáng)性神經(jīng)干細(xì)胞的圖。(E)餅圖分布的獨(dú)特性 度。值得注意的是，重疊基因只占所有DEGs的13.6%。(F, G) S100β、nfkb驅(qū)動(dòng)的GFP、 和PCNA在BDNF +嗎啉注射對(duì)照(F-F3)和BDNF + ngfra嗎啉注射腦(G-G3)。(H) NFkB信號(hào)通路活躍的增殖干細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的定量圖。比例尺相等 100μM。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。參見(jiàn)S10圖。支持參見(jiàn)S5 Data, S6 Data, S7 Data 信息。BDNF，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;DEG，差異表達(dá)基因;GFP，綠色熒光 蛋白質(zhì);包含IHC,免疫組織化學(xué);IL4 interleukin-4;NFkB，核因子κ輕鏈增強(qiáng)子 激活b細(xì)胞;Ngfr，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體;NSC，神經(jīng)干細(xì)胞;PCNA，增殖核細(xì)胞抗原; S100β， S100鈣結(jié)合蛋白B;t分布隨機(jī)鄰域嵌入。由于BDNF/NGFRA信號(hào)傳導(dǎo)受到IL4的影響，而IL4也通過(guò)IL4R直接作用于NSCs，我們假設(shè)IL4對(duì)NSCs的作用可以通過(guò)IL4R(直接通過(guò)IL4/IL4R相互作用)和NGFR(通過(guò)5-HT/BDNF/NGFRA/NFkB軸)分別介導(dǎo)，IL4R陽(yáng)性和NGFR陽(yáng)性膠質(zhì)細(xì)胞將構(gòu)成2種功能亞型NSCs。我們觀察到，只有3.2%的ngfr陽(yáng)性NSCs同時(shí)呈il4r1陽(yáng)性(24.5%僅為il4r陽(yáng)性，72.3%僅為ngfr陽(yáng)性)，表明這兩個(gè)人群可能代表了NSCs的兩種功能亞型。我們進(jìn)一步假設(shè)，如果ngfr陽(yáng)性和il4r陽(yáng)性的NSCs構(gòu)成不同的亞型，那么它們對(duì)特定治療的反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致不同的基因表達(dá)譜。這些結(jié)果表明，通過(guò)BDNF的神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞相互作用通過(guò)NGFRA/NFkB信號(hào)調(diào)節(jié)NSC增殖和神經(jīng)發(fā)生(圖6)。
圖6 成年斑馬魚大腦中神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)相互作用如何調(diào)節(jié)阿爾茨海默病誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生的研究結(jié)果示意圖一個(gè)β42,amyloid-beta42; Bdnf，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;Htr1, 5-羥色胺受體1;IL4 interleukin-4;NFkB，活化B-的核因子κ輕鏈增強(qiáng)子 細(xì)胞;NGFRA，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體A;NSC，神經(jīng)干細(xì)胞;PCNA，增殖細(xì)胞核抗原;pERK，磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié) 激酶;pSTAT6，磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6，白細(xì)胞介素-4誘導(dǎo);PVZ，腦室周圍區(qū);Ngfra，神經(jīng)生長(zhǎng)因子 受體;Tph2，色氨酸羥化酶;5 -羥色胺。為了探索我們的發(fā)現(xiàn)在健康和AD條件下的進(jìn)化保守性，我們測(cè)定了BDNF、NTRK2和p75/NTR(小鼠NGFRA同源物)的表達(dá)，野生型小鼠和APP/PS1dE9 AD模型(圖7- 9)。與12月齡對(duì)照小鼠相比，年齡匹配的APP/PS1dE9小鼠大腦顯示SOX2(神經(jīng)源性能力和NSC維持標(biāo)志物[42,43])減少，GFAP(膠質(zhì)標(biāo)志物[44,45])增加;S7圖，S8圖，S9圖)，表明神經(jīng)原性能力降低，膠質(zhì)細(xì)胞增生增加。我們發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮層和齒狀回(DG)中，BDNF主要由非神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)(S7圖，S8圖)，這得到了以往研究的支持，而這種模式在AD大腦中沒(méi)有改變(S7圖，S8圖)。NTRK2在皮質(zhì)和DG中表達(dá)，同樣主要在非神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，但在野生型和AD小鼠大腦中，很少有g(shù)fap陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞呈NTRK2陽(yáng)性，在健康和患病大腦之間的表達(dá)模式?jīng)]有明顯變化(S7圖)?？偟膩?lái)說(shuō)，NTRK2主要由神經(jīng)元表達(dá)，但也有少數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(S8圖)。我們發(fā)現(xiàn)p75/NTR主要在皮層和DG的神經(jīng)元中表達(dá)，而DG的NSC生態(tài)位(亞顆粒區(qū)[(SGZ)])不表達(dá)p75/NTR (S7圖，S9圖)。在野生型和APP/PSIdE9小鼠中，我們可以檢測(cè)到BDNF、NTRK2和p75/NTR的表達(dá)，然而，gfap陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加與這些蛋白的表達(dá)不相關(guān)，這表明BDNF信號(hào)傳導(dǎo)可能不調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)NSC的增殖。
圖S7 BDNF不能誘導(dǎo)AD小鼠模型的神經(jīng)干細(xì)胞可塑性(A、B) GFAP的免疫組化 以及12月齡時(shí)WT (A)和APP/PS1dE9小鼠腦(B)中的SOX2。(A1, A2)單人 a組熒光通道(B1, B2) b組單一熒光通道(C-D′)IHC 野生型小鼠的GFAP和BDNF:(C)皮質(zhì)，(D) DG。顯像是更高的放大鏡 沒(méi)有DAPI。(E - F′)APP/PS1dE9小鼠GFAP和BDNF的免疫組化:(E)皮質(zhì)，(F) DG。底色圖像具有更高的放大倍數(shù)，無(wú)需DAPI。(G-H′)GFAP和 野生型小鼠NTRK2:(G)皮質(zhì)，(H) DG。底色圖像不需要更高的放大倍數(shù) DAPI。(I - J′)APP/PS1dE9小鼠GFAP和NTRK2的免疫組化:(I)皮質(zhì)，(J) DG。啟動(dòng) 沒(méi)有DAPI的圖像具有更高的放大倍率。(K-L′)WT中NeuN和p75/NTR的免疫組化 小鼠:(K)皮質(zhì)，(L) DG。底色圖像具有更高的放大倍數(shù)，無(wú)需DAPI。(mn′) APP/PS1dE9小鼠的NeuN和p75/NTR的免疫組化:(M)皮質(zhì)，(N) DG。啟動(dòng)圖像是 無(wú)DAPI的高倍放大。(O-R2)野生型小鼠PBS- Ki67和GFAP的免疫組化 注射大腦半球(O)，野生型小鼠注射大腦半球(P)， APP/PS1dE9小鼠注射PBS- 注射大腦半球(Q)， APP/PS1dE9小鼠bdnf注射大腦半球(R) (S-V2)免疫組化 在WT小鼠注射pbs的大腦半球(S)和注射bdnf的大腦半球(S)中檢測(cè)Ki67和Iba1 大腦半球(T)， APP/PS1dE9小鼠pbs注射大腦半球(U)， APP/PS1dE9小鼠 bdnf注射半球(V)。(W) Ki67和GFAP染色的高倍圖像 對(duì)APP/PS1dE9小鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)注射側(cè)DG的影響。GFAP細(xì)胞不增殖 BDNF注射后。(X) DG Ki67和Iba1染色高倍圖像 APP/PS1dE9小鼠bdnf注射半球。多數(shù)ki67陽(yáng)性細(xì)胞與Iba1重疊 BDNF注射后染色。N = 2只動(dòng)物用于分析。比例尺為100 μM。與圖4相關(guān)。AD，阿爾茨海默病;BDNF，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;DG,窩 泰特回;GFAP，膠質(zhì)纖維酸性蛋白;Iba1，離子鈣結(jié)合接頭摩爾 cule 1;包含IHC,免疫組織化學(xué);Ki67，經(jīng)Ki-67單克隆抗體鑒定; NeuN、Fox-3、Rbfox3或Hexaribonucleotide binding protein 3;NSC，神經(jīng)干細(xì)胞; NTRK2，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)酪氨酸激酶受體，2型;SOX2，(性別決定區(qū)Y)- 盒轉(zhuǎn)錄因子2;Wt，野生型。
圖S8 小鼠腦內(nèi)BDNF和NTRK2的表達(dá)(A, A′)淀粉樣斑塊的免疫組化 (4G8)在野生型小鼠海馬中的表達(dá)。(B-F)野生型GFAP、SOX2和BDNF的免疫組化 老鼠的大腦。(G, G′)APP/PS1dE9小鼠海馬中淀粉樣斑塊(4G8)的免疫組化。(H-L) APP/PS1dE9小鼠腦內(nèi)GFAP, SOX2和BDNF的免疫組化。老鼠處于這個(gè)年齡 12個(gè)月。(M)野生型小鼠DG中GFAP和NTRK2的免疫組化。(M′)單熒光 NTRK2頻道。(N)合并圖像的高倍放大。(N′)單熒光通道 (O) IHC檢測(cè)Iba1和NTRK2。(O′)單個(gè)熒光通道用于 O組NTRK2 (O”)組Iba1的單熒光通道(P) NTRK2的IHC 和NeuN。紅色的單通道是NTRK2。比例尺為100 μM。與圖4和圖5相關(guān)。BDNF，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;DG，齒狀回;GFAP，膠質(zhì)纖維酸性前體 愛(ài)因斯坦;Iba1，離子鈣結(jié)合接頭分子1;包含IHC,免疫組織化學(xué);NeuN, fox3、Rbfox3或六核苷酸結(jié)合蛋白3;包含IHC,免疫組織化學(xué);; NTRK2，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)酪氨酸激酶受體，2型;SOX2，(性別決定區(qū)Y)- 盒轉(zhuǎn)錄因子2。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們研究了BDNF在野生型和AD小鼠中的作用 通過(guò)向小鼠腦內(nèi)注射BDNF (S7圖，S10圖)。BDNF注射為per- 在老鼠大腦的一個(gè)半球形成，而另一個(gè)半球被用作 PBS注射對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn)，與注射pbs相比，在野生型和APP/中，注射BDNF增加了大腦半球的總體增殖水平 PS1dE9腦(S7圖)。此外，我們還檢查了增加其增殖的細(xì)胞類型 變形的水平。
圖S9 p75/NTR在小鼠腦內(nèi)的表達(dá)(A-C)野生型p75/NTR (NGFR)的免疫組化 (D - k)皮質(zhì)(D)和DG中p75/NTR和NeuN的免疫組化 (H). (E-G)來(lái)自面板d的高倍圖像(I-K)來(lái)自面板d的高倍圖像 圖h (L - s) APP/PS1dE9小鼠皮層(L)和DG (P)的p75/NTR和NeuN的免疫組化。(M-O) l面板高倍圖像(Q-S) p面板高倍圖像比例尺為100 μM。與圖4和圖5相關(guān)。DG，齒狀回;包含IHC immunohis - tochemistry;NeuN、Fox-3、Rbfox3或Hexaribonucleotide binding protein 3;NGFR,神經(jīng) 生長(zhǎng)因子受體;p75/NTR，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75;SVZ，室管膜下區(qū)。
圖S10 BDNF增加小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，但不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞 老鼠的大腦。(A, B)野生型(A)和APP/PS1dE9 (B)中Ki67和GFAP的免疫組織化學(xué) 在12月齡時(shí)注射PBS(左半球)和BDNF(右半球)后的小鼠大腦 半球)。(C) APP/PS1dE9腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子注射側(cè)DG的特寫圖像 老鼠的大腦。(D, E)野生型(D)和APP/PS1dE9 (E)小鼠Ki67和Iba1的IHC 在12月齡時(shí)注射PBS(左半球)和BDNF(右半腦) 球體)。(F) APP/PS1dE9小鼠bdnf注射側(cè)DG的特寫圖像 大腦。比例尺為100 μM。與圖4和圖5相關(guān)。BDNF，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 tor;DG，齒狀回;Ki67，經(jīng)Ki-67單克隆抗體鑒定;GFAP、膠質(zhì) 纖維酸性蛋白;Iba1，離子鈣結(jié)合接頭分子1;包含IHC immunohis - tochemistry;NeuN、Fox-3、Rbfox3或Hexaribonucleotide binding protein 3;包含IHC免疫, 組織化學(xué)。
為了鑒定bdnf反應(yīng)性增殖細(xì)胞，我們與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP進(jìn)行了共染色，發(fā)現(xiàn)Ki67(由單克隆抗體Ki-67鑒定的抗原，增殖細(xì)胞的標(biāo)志物)陽(yáng)性的細(xì)胞是GFAP陰性的，這表明bdnf反應(yīng)性增殖細(xì)胞不是星形膠質(zhì)細(xì)胞(S7圖，S10圖)。接下來(lái)，我們將Ki67與小膠質(zhì)標(biāo)記物Ibal(離子鈣結(jié)合接頭分子1)進(jìn)行共染色，發(fā)現(xiàn)幾乎所有Ki67陽(yáng)性的細(xì)胞都是Ibal陽(yáng)性，這表明BDNF誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞增生，而不是NSC增殖(S7圖，S10圖)。這一發(fā)現(xiàn)與之前的報(bào)道一致。此外，由于小鼠海馬SGZ中存在的NSCs缺乏p75/NTR的表達(dá)，因此BDNF/p75NTR信號(hào)傳導(dǎo)雖然能增強(qiáng)斑馬魚大腦中NSCs的增殖輸出和神經(jīng)發(fā)生，但在小鼠大腦中并不是一個(gè)活躍的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制?；谶@些結(jié)果，我們提出斑馬魚利用特殊的回路機(jī)制，利用血清素- bdnf信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)NSC可塑性，并通過(guò)神經(jīng)元中間體誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生;然而，BDNF信號(hào)并不調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物腦內(nèi)NSC的可塑性和神經(jīng)發(fā)生，其作用主要是影響神經(jīng)元存活和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。
討論
我們的研究結(jié)果確定了一個(gè)以前未表征的調(diào)節(jié)回路機(jī)制，涉及 AD條件下斑馬魚大腦NSC可塑性的神經(jīng)元中間體。這個(gè)機(jī)甲- nism涉及血清素對(duì)表達(dá)bdnf的腦室周圍神經(jīng)元的抑制作用，其直接調(diào)節(jié)表達(dá)bdnf受體ngfra的NSCs子集。amyloid-induced IL4抑制最初的血清素能輸出，從而增強(qiáng)bdnf的表達(dá) 干細(xì)胞增殖。我們認(rèn)為il - 4的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生了一種疾病 支持NSC增殖的相關(guān)NSC生態(tài)位環(huán)境。血清素影響神經(jīng)發(fā)生、干細(xì)胞增殖和神經(jīng)回路的正常功能;然而，其對(duì)NSCs和神經(jīng)發(fā)生的影響存在爭(zhēng)議。在斑馬魚中，血清素積極影響中腦而非下丘腦的NSC增殖，并促進(jìn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生。雖然5 -羥色胺的消耗會(huì)降低大鼠成年后的神經(jīng)發(fā)生結(jié)局，但血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)缺陷小鼠血清素水平升高并不影響NSC增殖和神經(jīng)發(fā)生。在小鼠大腦的中腦和海馬祖細(xì)胞中，抑制5 -羥色胺受體或敲除5 -羥色胺生成酶以產(chǎn)生低5 -羥色胺能表型對(duì)神經(jīng)發(fā)生有積極影響，確定了5 -羥色胺對(duì)NSC可塑性的負(fù)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，5 -羥色胺對(duì)NSCs的影響依賴于環(huán)境，并可能通過(guò)中間的次級(jí)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制運(yùn)行，這支持了我們的發(fā)現(xiàn)。此外，在大多數(shù)研究中，未研究NSCs中血清素的特異性受體;因此，我們的研究提供了一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)的詳細(xì)描述，在我們的研究中，BDNF通過(guò)中間體將5 -羥色胺能輸入與干細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)聯(lián)系起來(lái)。5 -羥色胺和BDNF之間的相互作用被部分理解。在壓力相關(guān)疾病中，血清素的消耗會(huì)降低腦BDNF水平。相反，低血清素能小鼠(Tph2-/-或Pet1-/-)海馬和前額皮質(zhì)BDNF水平升高，SERT缺乏(高血清素)的人BDNF的可用性降低，從而增強(qiáng)NSCs的增殖和神經(jīng)發(fā)生。我們的研究結(jié)果支持5 -羥色胺對(duì)BDNF信號(hào)傳導(dǎo)和NSC可塑性的負(fù)面作用。BDNF在AD中的作用主要是影響神經(jīng)元存活，而不是神經(jīng)發(fā)生或NSC可塑性。盡管BDNF表達(dá)與神經(jīng)元存活增加相關(guān)，并可能對(duì)增加海馬凈神經(jīng)發(fā)生和改善認(rèn)知功能有積極影響，但一些研究表明，這些影響與增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生沒(méi)有直接關(guān)系。事實(shí)上，在最近的一項(xiàng)研究中，在5X-FAD AD小鼠模型中，增加成年神經(jīng)發(fā)生和同時(shí)治療BDNF可以增加認(rèn)知輸出，但單獨(dú)的成年神經(jīng)發(fā)生或BDNF不足以達(dá)到這一目的，這表明在獨(dú)立刺激神經(jīng)發(fā)生后，需要依賴BDNF的神經(jīng)元存活級(jí)聯(lián)來(lái)抵消AD癥狀。在斑馬魚中，與哺乳動(dòng)物不同，BDNF直接調(diào)節(jié)NSC可塑性和神經(jīng)發(fā)生。我們?cè)贏PP/PS1dE9小鼠中的結(jié)果也支持了在小鼠中的發(fā)現(xiàn)，表明斑馬魚具有內(nèi)在的、天然的啟動(dòng)NSC增殖和神經(jīng)發(fā)生的能力，這可以告訴我們?nèi)绾握{(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的大腦，啟動(dòng)阿爾茨海默病中丟失的神經(jīng)元的“再生”。BDNF在哺乳動(dòng)物大腦中表達(dá)豐富，其主要受體為TrkB/ Ntrk2，主要表達(dá)于神經(jīng)元、皮層和DG以及 很少有星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序確定。BDNF也有 對(duì)p75受體的結(jié)合親和力，主要在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)元中表達(dá) 。然而，在斑馬魚中，ngfra主要在NSCs中表達(dá)，并負(fù)責(zé) 為NSC塑性。斑馬魚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)ngfra受體對(duì)BDNF產(chǎn)生應(yīng)答并激活 增殖和神經(jīng)發(fā)生;而小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)BDNF的反應(yīng)是反應(yīng)性的 星形膠質(zhì)細(xì)胞病和小膠質(zhì)細(xì)胞病。因此，我們的研究結(jié)果也表明BDNF活性可以專門研究脊椎動(dòng)物大腦中不同的受體信號(hào)通路。例如, BDNF-NGFRA信號(hào)可能是細(xì)胞再生和可塑性的一個(gè)潛在因素 而在哺乳動(dòng)物等非再生生物中，BDNF主要通過(guò)TrkB/Ntrk2信號(hào)發(fā)揮作用。的進(jìn)一步研究 在其他再生生物體中的這種調(diào)節(jié)機(jī)制將有助于測(cè)試 我們的假設(shè)。此外，誘導(dǎo)ngfra在人類干細(xì)胞群中的表達(dá) 在阿爾茨海默病中，馬里大腦可能是一種將神經(jīng)源性可塑性強(qiáng)加給星形膠質(zhì)細(xì)胞的潛在途徑條件。我們發(fā)現(xiàn)IL4抑制不表達(dá)il4r的神經(jīng)元中5 -羥色胺的產(chǎn)生，表明ILA間接調(diào)節(jié)5 -羥色胺的可用性。事實(shí)上，IL-1β、TNFa、IFNa和IFNy等促炎細(xì)胞因子可以增加5-HT水平和5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體SERT的表達(dá)，這與大腦中5-HT水平呈正相關(guān)。理論上，抗炎因子可以抑制促炎因子的表達(dá)，從而降低大腦中5-HT的水平。事實(shí)上，IL4降低了5-HT或SERT水平，支持了我們的研究結(jié)果。因此，在成年斑馬魚大腦中，AD條件引發(fā)il - 4對(duì)血清素的炎癥調(diào)節(jié)，這轉(zhuǎn)化為特定神經(jīng)元亞型的神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)，直接調(diào)節(jié)NSCs亞群。我們鑒定了2個(gè)功能不同的NSCs群體，它們都對(duì)il - 4有反應(yīng)，但通過(guò)不同的受體信號(hào)(IL4R/STAT6和BDNF/NGFRA)和不同的基因調(diào)控(圖3X和3Y)。這一發(fā)現(xiàn)表明，NSC異質(zhì)性是決定某種類型的神經(jīng)病理學(xué)和特定信號(hào)通路如何對(duì)某些亞型細(xì)胞產(chǎn)生差異的重要因素(例如，在AD條件下，IL4以兩種不同的模式調(diào)節(jié)增殖[圖6])。這一認(rèn)識(shí)將有助于設(shè)計(jì)針對(duì)人類AD的靶向治療方案，并可能導(dǎo)致對(duì)實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物AD模型中NSC亞型的更詳細(xì)分析。此外，il - 4和5 -羥色胺在調(diào)節(jié)NSCs多種信號(hào)機(jī)制中的作用開(kāi)辟了有趣的研究途徑，即哺乳動(dòng)物大腦中神經(jīng)炎癥環(huán)境的調(diào)節(jié)是否會(huì)通過(guò)動(dòng)員內(nèi)源性NSCs庫(kù)來(lái)啟動(dòng)“再生”反應(yīng)，這是一個(gè)有爭(zhēng)議的主題。我們認(rèn)為斑馬魚可以用來(lái)解決疾病條件下的神經(jīng)發(fā)生相關(guān)問(wèn)題，并可以作為研究NSC可塑性分子機(jī)制的有用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/span>
基金：這項(xiàng)工作得到了德國(guó)人的支持神經(jīng)退行性疾病中心(DZNE)和德國(guó)亥姆霍茲協(xié)會(huì)青年研究員獎(jiǎng)(VH-NG-1021，頒給C.K. schungsgemeinschaft (KI1524/6， KI1524/10和KI1524/11至c.k)和TU Dresden (FZ-111, 043_261518至C.K.)。瑞典的研究理事會(huì)(2015-03359 to K.A.)， StratNeuro (to K.A.)，瑞典大腦基金會(huì)(FO2019-0011至K.A.)，卡羅林斯卡學(xué)院(致K.A.和WP.C)的資助者不參與研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集并分析、決定出版或準(zhǔn)備的手稿。
本文章原文：PLOS Biology | https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000585 January 6, 2020
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