雜志：International Immunopharmacology
影響因子：5.6（2022）
年份：2023
通訊作者：Dingding Shenb; Qi Zhanga
摘要
炎癥被認(rèn)為與癲癇的發(fā)生有關(guān)。然而，發(fā)熱與炎癥的關(guān)系以及發(fā)熱在兒童癲癇發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在這里，我們描述了一個(gè)暴露于戊四唑（PTZ）的斑馬魚(yú)幼魚(yú)的熱療誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的體內(nèi)模型。高溫增加了PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)對(duì)癲癇發(fā)作的易感性和促炎因子的產(chǎn)生。GABRG2突變與發(fā)熱相關(guān)癲癇相關(guān)，我們使用表達(dá)突變?nèi)嘶騁ABRG2（F343L）的Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)模型來(lái)進(jìn)一步研究炎癥在發(fā)熱誘發(fā)癲癇發(fā)作中的作用。我們的數(shù)據(jù)表明，高溫也增加了Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。雖然GABRG2突變上調(diào)了促炎因子的產(chǎn)生，但高溫并沒(méi)有顯著改變促炎因子的產(chǎn)生。脂多糖（LPS）的刺激足以增加斑馬魚(yú)幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活性，暗示炎癥可增加發(fā)熱相關(guān)癲癇。在PTZ誘導(dǎo)后，GABRG2的表達(dá)增加，特別是在較高的溫度下。此外，用地塞米松（DEX）抑制炎癥反應(yīng)可降低斑馬魚(yú)幼魚(yú)的興奮性，特別是在高溫下。最后，體外實(shí)驗(yàn)證明，LPS刺激作用增加了GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-1β和IL-6的產(chǎn)生。綜上所述，我們的研究表明，發(fā)熱性癲癇發(fā)作可誘發(fā)神經(jīng)炎癥，而IL-1β和IL-6表達(dá)的增加可能是癲癇發(fā)生的原因。發(fā)熱和炎癥之間的惡性循環(huán)可能誘發(fā)癲癇發(fā)作，而抗炎策略可能是治療發(fā)熱相關(guān)癲癇的一種潛在治療方法。
關(guān)鍵詞：發(fā)熱；癲癇；斑馬魚(yú)；炎癥；GABAA 受體
1.引言
發(fā)燒常是兒童癲癇的誘因。雖然發(fā)熱性癲癇發(fā)作（FS）通常被認(rèn)為是良性的，但長(zhǎng)期的復(fù)雜FS可增加腦損傷和隨之而來(lái)的不良后果的風(fēng)險(xiǎn)，包括顳葉癲癇（TLE）、生活后期的認(rèn)知障礙和兒童時(shí)期的猝死（SUDC）。然而，在體內(nèi)發(fā)熱誘發(fā)癲癇發(fā)作的機(jī)制尚不清楚。為了了解高熱過(guò)程中癲癇發(fā)生的潛在機(jī)制，特別是在發(fā)育中的大腦中，我們利用高溫在未成熟的嚙齒動(dòng)物和斑馬魚(yú)幼魚(yú)中誘發(fā)癲癇樣活動(dòng)，這可能為FS的治療提供預(yù)防策略。例如，在熱誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的斑馬魚(yú)模型中，已經(jīng)證明瞬時(shí)受體電位香草素1和4（TRPV1/4）和NMDA型谷氨酸受體參與了癲癇發(fā)作的發(fā)生。然而，高熱在兒童癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
許多證據(jù)表明，炎癥與癲癇的發(fā)生有關(guān)。急性腦損傷后，腦內(nèi)迅速誘發(fā)神經(jīng)炎癥，從而增加了人類和相關(guān)動(dòng)物模型發(fā)生癲癇的風(fēng)險(xiǎn)。在癲癇發(fā)作的兒童中血漿中檢測(cè)到神經(jīng)炎癥通路的差異激活。在FS后的新生大鼠中也觀察到誘發(fā)的炎癥過(guò)程，并與成年記憶缺陷有關(guān)。臨床研究證明，特異性抗炎藥物可以減少耐藥性癲癇發(fā)作。使用地塞米松（DEX），一種廣泛的抗炎藥物，被報(bào)道可以減弱發(fā)熱性癲癇持續(xù)狀態(tài)（FSE）未成熟大鼠模型的異常奮性。DEX還可縮短發(fā)熱感染相關(guān)癲癇綜合征（FIRES）患者的危險(xiǎn)期。由于炎癥是發(fā)熱的原因之一，發(fā)熱會(huì)加重炎癥，我們推測(cè)發(fā)熱和炎癥之間的惡性循環(huán)可能誘發(fā)癲癇發(fā)作，靶向炎癥可能是癲癇治療的一種治療選擇。γ-氨基丁酸（GABAA）受體γ2亞基基因（GABRG2）的突變與FS和遺傳性癲癇伴熱性發(fā)作（GEFS +）相關(guān)。據(jù)報(bào)道，GABAA受體的激活可以抑制促炎途徑，并通過(guò)減少星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮保護(hù)作用。最近，有人報(bào)道了一例由GABAA受體抗體介導(dǎo)的自身免疫性腦炎引起的FIRES疾病。在高溫條件下，GABAergic神經(jīng)元突觸前末端的GABA釋放和再攝取功能障礙可能會(huì)增加神經(jīng)元的興奮性。以上證據(jù)表明，GABAA受體可能在發(fā)熱相關(guān)性癲癇中發(fā)揮重要作用。然而，促炎因子及其與GABAA受體的相互作用在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚不清楚。
在之前的一項(xiàng)研究中，我們?cè)诎唏R魚(yú)中建立了一個(gè)與GABRG2（F343L）錯(cuò)義突變相關(guān)的癲癇性腦病模型，進(jìn)一步表明斑馬魚(yú)是一種有效的癲癇模型，可用于了解所涉及的各種機(jī)制和篩選藥物治療。戊四唑（PTZ）是一種GABAA受體拮抗劑，廣泛應(yīng)用于斑馬魚(yú)中闡明癲癇的發(fā)病機(jī)制。溫度的升高足以獲得斑馬魚(yú)幼魚(yú)的腦電圖（EEG）記錄。本研究旨在探討熱療對(duì)PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)癲癇模型的影響，并探討其作用機(jī)制。此外，我們還應(yīng)用了一個(gè)過(guò)表達(dá)突變的人類GABRG2（F343L）亞基的斑馬魚(yú)模型，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)熱相關(guān)癲癇中炎癥和GABAA受體之間的關(guān)系。
斑馬魚(yú)飼養(yǎng)和護(hù)理
斑馬魚(yú)（AB株）在我們之前的協(xié)議條件下被保存在南通大學(xué)的斑馬魚(yú)中心。Tg（hGABRG2WT）和Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)由我們的實(shí)驗(yàn)室建立，并在南通大學(xué)的斑馬魚(yú)中心進(jìn)行維護(hù)。所有方案和程序均遵循南通大學(xué)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理指南，并獲得了南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理委員會(huì)（20200305-001）的倫理批準(zhǔn)。成年斑馬魚(yú)在循環(huán)水系統(tǒng)（pH為7.0 ~ 8.0）中進(jìn)行14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)。這些斑馬魚(yú)每天被喂食兩次魚(yú)食。斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)在28?C包含E3溶液的10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并在受精后24小時(shí)后（hpf）添加加入0.2mM PTU以抑制色素沉著。
高溫和PTZ處理
在受精后5天（dpf），將斑馬魚(yú)幼魚(yú)轉(zhuǎn)移到48孔培養(yǎng)板中，每孔有1只幼蟲(chóng)。28?C是通常用來(lái)保持斑馬魚(yú)群落的溫度。當(dāng)斑馬魚(yú)接受高溫暴露時(shí)，水溫設(shè)置為32?C。在PTZ敏感性實(shí)驗(yàn)中，加入PTZ到培養(yǎng)基中使終濃度為15 mM。為了檢測(cè)熱療對(duì)斑馬魚(yú)的影響，將動(dòng)物分為四組：常溫（28?C）PTZ誘導(dǎo)組或不誘導(dǎo)組，高溫組（32?C）PTZ誘導(dǎo)組或不誘導(dǎo)組。
行為實(shí)驗(yàn)
使用丹麥視覺(jué)視頻跟蹤系統(tǒng)（Noldus，德國(guó)）記錄在不同溫度下使用或不使用PTZ誘導(dǎo)下斑馬魚(yú)30 min運(yùn)動(dòng)活性。對(duì)于LPS刺激，在不同溫度下5 dpf的斑馬魚(yú)幼魚(yú)培養(yǎng)基中加入80 μg/mL LPS。用濃度為（1 μg/mL）的DEX抑制斑馬魚(yú)幼魚(yú)的炎癥反應(yīng)。使用EthoVision XT運(yùn)動(dòng)跟蹤軟件版本（Noldus，德語(yǔ)）分析運(yùn)動(dòng)活性。記錄并分析了所運(yùn)動(dòng)總距離。自發(fā)性癲癇發(fā)作樣活動(dòng)被定義為癲癇發(fā)作評(píng)分系統(tǒng)，以評(píng)估斑馬魚(yú)幼魚(yú)的行為變化并從0期到3期進(jìn)行分類：第0階段，特征為很少游泳活動(dòng)；第1階段，特征為游泳活動(dòng)普遍增加；第2階段，快速“漩渦狀”；第3階段，特征為抽搐后失去姿勢(shì)。在PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)或Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)中記錄了達(dá)到2/3階段的潛伏時(shí)間。
腦電圖（EEG）記錄
采用MD3000生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)（安徽正華，中國(guó)）對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行腦電圖記錄。簡(jiǎn)而言之，將斑馬魚(yú)包埋在記錄介質(zhì)溶液（1 mM氯化鈉，2.9 mM氯化鉀，10 mM HEPES，1.2 mM氯化鎂，10 mM葡萄糖，2.1 mM氯化鈣）中，用1.2 %低融化瓊脂糖和0.02 %三卡因麻醉動(dòng)物。在電壓電阻配置中，使用膜片鉗放大器測(cè)量電極電阻，以確定正確的值。膜片鉗放大器的放大倍數(shù)為1000，上限為10000Hz，時(shí)間常數(shù)為0.5 ms，高通濾波器為100 Hz。對(duì)每只斑馬魚(yú)的電極進(jìn)行場(chǎng)電位（FP）記錄。量化最大振幅和癲癇樣放電事件的數(shù)量。
定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）
記錄運(yùn)動(dòng)活動(dòng)后，用TRIzol試劑（Invitrogen，USA）從斑馬魚(yú)胚胎的大腦中提取總RNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Omniscript RT試劑盒（Qiagen，美國(guó)）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR green mix（諾唯贊，中國(guó)）進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)不同條件下c-fos、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)。以β-actin作為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)歸一化為內(nèi)參基因β-actin，并相對(duì)于對(duì)照幼魚(yú)的表達(dá)進(jìn)行定量。數(shù)值代表了圖注中所示的幾個(gè)獨(dú)立生物樣本的平均值，每個(gè)樣本包括10個(gè)匯集的幼魚(yú)。
整體原位雜交（WISH）
斑馬魚(yú)幼魚(yú)的WISH按照Thisse的方案進(jìn)行，并進(jìn)行了修改。簡(jiǎn)單地說(shuō)，我們?cè)O(shè)計(jì)了引物序列并用用DIG-RNA標(biāo)記試劑盒（Roche，瑞士）合成了DIG標(biāo)記的c-fos正義探針和反義探針。行為實(shí)驗(yàn)后，收集斑馬魚(yú)幼魚(yú)，用4%多聚甲醛（PFA）在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中固定過(guò)夜，并如前所述進(jìn)行雜交。
免疫印跡
從斑馬魚(yú)幼魚(yú)的大腦中提取總蛋白，然后用BCA分析進(jìn)行定量。20個(gè)μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。該膜用5%的脫脂奶粉在Tris緩沖鹽水（TBS，pH 7.4）中封閉，并與指示抗體在4?C下孵育過(guò)夜。用TBS/T（含0.1%Tween20的TBS）洗滌后，將HRP偶聯(lián)親和純化的驢兔抗IgG（1：5000）或山羊鼠抗（1：5000）在室溫下孵育2h。用ECL底物孵育膜，用成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描（Tanon，上海，中國(guó)）。使用ImageJ1.8.0軟件（貝塞斯達(dá)，馬里蘭州，美國(guó)）對(duì)圖像進(jìn)行分析。
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
人胚胎腎（HEK）293 T細(xì)胞在添加10 %胎牛血清的DMEM中，37?C，95%空氣和5%二氧化碳的潮濕氣氛中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每?jī)商旄鼡Q一次。將編碼人GABAA受體α1、β2和γ2亞基的cDNA亞克隆到pcDNA3.1載體中。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/mL的密度置于10厘米的培養(yǎng)皿中。按照聚乙烯亞胺（PEI）試劑（40kD，Polyscinces）的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染了3 mg的GABAA受體cDNA。DNA：PEI的比例為1mg：2.5ml，α1：β2：γ2亞基的cDNA比例為1：1：1。
細(xì)胞活力分析
轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞置于96孔板中，用1 μg/mL LPS或100 nM/L TNF-α處理。在LPS或TNF-α孵育24 h后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞活力。用ELx-800酶標(biāo)儀（Bio-Tek Inc.，Winooski，VT，USA）在450 nm處的分光光度法測(cè)定吸光度（光密度，OD）。
統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)用平均± SEM表示。在GraphPad Prism 8.0（GraphPad，圣地亞哥，CA，USA）中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用未配對(duì)Student’st-test或雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)來(lái)比較組間的差異。正態(tài)分布采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
高溫增加了PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)癲癇發(fā)作的易感性
為了確定短期溫度升高對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)PTZ誘發(fā)癲癇易感性的影響，分別將斑馬魚(yú)暴露于28?C和32?C的PTZ。測(cè)量癲癇發(fā)作評(píng)分、旅行距離和斑馬魚(yú)達(dá)到癲癇發(fā)作階段（階段2或階段3）的潛伏期。在28?C時(shí)，根據(jù)視頻跟蹤系統(tǒng)，幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較低的運(yùn)動(dòng)能力（圖1A），在30 min范圍內(nèi)的平均旅行距離為1325±185mm（圖1B）。當(dāng)環(huán)境溫度設(shè)置為32?C時(shí)，游泳活動(dòng)略有增加，總距離為2693±230mm（圖1b）（P<0.0001，Tukey’s檢驗(yàn)）。經(jīng)15 mM PTZ處理后，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的代表性游泳軌跡運(yùn)動(dòng)活動(dòng)顯著增加（圖1A），28?C平均距離為9415±201mm，32?C平均距離為10680±210mm（圖1B）（P=0.0003，Tukey檢驗(yàn)）。
采用未成熟斑馬魚(yú)癲癇發(fā)作行為評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)估不同溫度下PTZ誘導(dǎo)下的行為變化。在沒(méi)有PTZ刺激的情況下，所有斑馬魚(yú)幼魚(yú)均處于第0或第1階段，而PTZ暴露的幼魚(yú)均達(dá)到第2或第3階段（圖1C），表明PTZ在兩種溫度下都誘導(dǎo)了癲癇樣行為。然而，當(dāng)溫度從28?C上升到32?C時(shí)，斑馬魚(yú)幼魚(yú)達(dá)到第3階段的比例從35.00 %上升到68.33 %。為了研究不同水溫和PTZ暴露對(duì)斑馬魚(yú)行為的影響，我們計(jì)算了斑馬魚(yú)達(dá)到癲癇發(fā)作階段的時(shí)間潛伏期。暴露在PTZ斑馬魚(yú)幼魚(yú)到達(dá)的第2/3階段潛伏時(shí)間從28?C時(shí)的119 ± 4 s下降到32?C時(shí)的96±4s（圖1D）（P < 0.0001，未配對(duì)Student’s t-test）。這些數(shù)據(jù)表明，高溫增加了PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)對(duì)癲癇發(fā)作的易感性。
圖1 溫度對(duì)PTZ暴露條件下斑馬魚(yú)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的影響。(A)采用丹麥視覺(jué)XT運(yùn)動(dòng)跟蹤軟件在丹麥視覺(jué)視頻跟蹤系統(tǒng)中記錄斑馬魚(yú)幼魚(yú)30 min后的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。在5 dpf時(shí)，斑馬魚(yú)接受不同的溫度（28?C和32?C），暴露或不暴露15 mM PTZ。(B)對(duì)每一組的總旅行距離進(jìn)行量化（每一組的n=24）。數(shù)據(jù)以平均± SEM表示。** P < 0.01通過(guò)雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,92）= 38.74；PTZ，F(xiàn)（1,92）= 1444；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,92）= 0.05816。(C)癲癇發(fā)作評(píng)分通過(guò)錄像獲得，條形圖顯示了不同癲癇發(fā)作階段的幼魚(yú)的百分比（每組n=74）。(D)斑馬魚(yú)幼魚(yú)達(dá)到第2期或第3期的潛伏期（每組n=120）。** P < 0.01采用未配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)。
采用前腦場(chǎng)電位記錄法，觀察PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)在短暫溫度升高時(shí)的癲癇發(fā)作活動(dòng)。PTZ的誘導(dǎo)導(dǎo)致了多尖峰、大振幅和長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的突發(fā)放電，這與之前的報(bào)道相似（圖2A）。高溫沒(méi)有引起顯著的癲癇發(fā)作活動(dòng)，而異常放電隨著PTZ的暴露而增加（圖2A）。在兩種溫度下，PTZ誘導(dǎo)最大振幅顯著增加（43.01 ± 9.98 μV vs 11.04 ± 0.82 μV在28?C，P=0.0284，Tukey檢驗(yàn)；73.12 ± 7.39 μV vs 21.87 ± 1.52 μV在32?C，P=0.0019，Tukey檢驗(yàn)）（圖2B）。高溫只增加了PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)的振幅（P=0.0381，Tukey’s檢驗(yàn)）（圖2B）。此外，我們還比較了各組間的癲癇樣放電事件。PTZ增加了兩種溫度下每秒放電事件數(shù)(22.00 ± 1.73對(duì)0.33 ± 0.33，P = 0.0002；32?C時(shí)± 3.22和0.67 ± 0.33，P < 0.0001，熱療僅增加了斑馬魚(yú)的事件數(shù)（P = 0.0350，圖基測(cè)試）（圖2C）。
c-fos是一種即時(shí)早期轉(zhuǎn)錄因子，在動(dòng)物模型中作為癲癇發(fā)作的標(biāo)志，包括經(jīng)PTZ處理的斑馬魚(yú)幼魚(yú)。因此，我們利用WISH和qRT-PCR在5 dpf條件下進(jìn)一步研究了不同溫度下斑馬魚(yú)幼魚(yú)中cfos的表達(dá)。在28?C時(shí)，在整個(gè)大腦中表現(xiàn)出的c-fos表達(dá)水平非常低（圖2D和2E）。雖然升高的溫度沒(méi)有顯著改變c-fos的表達(dá)（1.34 ± 0.37在32?C，對(duì)照組在28?C作為1），PTZ誘導(dǎo)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的強(qiáng)勁增加，包括端腦、視神經(jīng)頂蓋、中腦和后腦特別是在32?C（32?C時(shí)92±10 vs 28?C 43±7）（P=0.0002，Tukey’s檢測(cè)）。以上數(shù)據(jù)表明，在PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)模型中，高溫能夠通過(guò)上調(diào)c-fos的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)癲癇樣行為。
圖2 PTZ暴露不同溫度下斑馬魚(yú)幼魚(yú)大腦c-fos活性和表達(dá)。(A)在28?C和32?C條件下，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的代表性現(xiàn)場(chǎng)記錄。(B)各組最大振幅的量化（每組n=3）。數(shù)據(jù)以平均± SEM表示。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,8）= 10.66；PTZ，F(xiàn)（1,8）= 44.07；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,8）= 2.365。(C)各組癲癇樣出院事件的量化（每組n=3）。數(shù)據(jù)以平均± SEM表示。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,8）= 6.426；PTZ，F(xiàn)（1,8）= 199.5；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,8）= 5.541。(D)全貼式原位雜交（WISH）檢測(cè)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)在28?C和32?C下C-mosmRNA的表達(dá)，以及5 dpf下15 mM PTZ的暴露。c-fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為深紫色。(E)不同處理后斑馬魚(yú)幼魚(yú)大腦中c-fos mRNA水平的定量分析。數(shù)據(jù)歸一化為內(nèi)參基因β-actin，無(wú)PTZ暴露常溫（28?C）組c-fos mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為“1’”（每組n=6，一個(gè)樣本混合10個(gè)幼蟲(chóng)）。** P < 0.01通過(guò)雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,20）= 13.58；PTZ，F(xiàn)（1,20）= 98.06；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,20）= 13.21。
高溫促進(jìn)了PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)產(chǎn)生促炎因子
IL-1β、IL-6和TNF-α是中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的主要促炎因子。在5 dpf時(shí)，斑馬魚(yú)接受不同的溫度（28?C和32?C），暴露或不暴露15 mM PTZ處理。采用qPCR方法檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)上述3種細(xì)胞因子在32?C時(shí)均增加，但在對(duì)照組中沒(méi)有。雖然高溫增加了促炎細(xì)胞因子的生產(chǎn)，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于IL-1β，在每個(gè)溫度下，隨著PTZ暴露其表達(dá)量顯著增加（圖3A），而IL-6和TNF-α僅在32?C時(shí)隨PTZ暴露而增加（圖3B和3C)。此外，PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)在不同溫度下各促炎因子的差異顯著。結(jié)果表明，高溫可能增加了PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)促炎因子的產(chǎn)生。
圖3 PTZ暴露下不同溫度下斑馬魚(yú)幼魚(yú)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。在5 dpf時(shí)，斑馬魚(yú)接受不同的溫度（28?C和32?C），暴露或不暴露15 mM PTZ。用qPCR檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-1β (A)、IL-6 (B)和TNF-α (C)的表達(dá)（每組n=6，共混合10個(gè)幼蟲(chóng)）。對(duì)照組在28?C時(shí)各細(xì)胞因子的表達(dá)量任意取為1。* P < 0.05和** P < 0.01，通過(guò)雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。(A)溫度，F(xiàn)（1,20）= 8.163；PTZ，F(xiàn)（1,20）= 41.27；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,20）= 1.748；(B)溫度，F(xiàn)（1,20）= 7.674；PTZ，F(xiàn)（1,20）= 9.504；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,20）= 4.164；(C)溫度，F(xiàn)（1,20）= 6.719；PTZ，F(xiàn)（1,20）= 15.51；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,20）= 2.463。
高溫增加了Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活性，而不影響促炎因子的產(chǎn)生
為了進(jìn)一步研究高溫對(duì)癲癇發(fā)生中炎癥過(guò)程的影響，我們應(yīng)用了一個(gè)表達(dá)突變?nèi)薌ABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系。突變體GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)表現(xiàn)出自發(fā)的癲癇發(fā)作活動(dòng)和驚厥行為，可作為一個(gè)再現(xiàn)人類癲癇綜合征的有用模型。通過(guò)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在不同溫度下的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)（圖4A）。在28?C下，Tg（hGABRG2F343L）在30 min中的平均旅行距離為2898 ± 184 mm，遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)染野生型（WT）GABRG2的對(duì)照組（889±151mm）（圖4B）。當(dāng)環(huán)境溫度升高到32?C時(shí)，F(xiàn)343L和WT斑馬魚(yú)的總距離分別增加到3898 ± 271 mm和1706 ± 212 mm，F(xiàn)343L突變體組更高（圖4B），暗示高溫增加了突變體GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活性。雙盲癲癇評(píng)分評(píng)估還顯示，所有的斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)在階段0或階段1WT組在28?C和32?C，而在F343L組，大多數(shù)幼魚(yú)（95.83 %）留在階段1和2.08 %的幼魚(yú)達(dá)到階段2在28?C。隨著溫度的升高，8.51 % F343L轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在第2階段，8.51 %的幼魚(yú)達(dá)到第3階段（圖4C），達(dá)到第2/3階段的潛伏期從28?C時(shí)的837 ± 113 s下降到32?C時(shí)的342 ± 45 s（圖4D）。暗示高溫也增加了Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)幼魚(yú)癲癇發(fā)作的易感性。
圖4 熱療對(duì)Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)品系運(yùn)動(dòng)能力的影響。在5 dpf時(shí)，Tg（hGABRG2WT）和Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)處于不同的溫度（28?C和32?C）。(A)在28?C和32?C下，用etho視覺(jué)XT運(yùn)動(dòng)跟蹤軟件記錄野生型GABRG2或突變型GABRG2（F343L）的斑馬魚(yú)幼魚(yú)30 min的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。(B)分析每組的總旅行距離（每組n=42）。數(shù)據(jù)以平均± SEM表示。* P < 0.05和** P < 0.01，通過(guò)雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,164）= 18.47；F343L，F(xiàn)（1,164）= 98.57；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（1,164）= 0.1875。(C)通過(guò)錄像獲得癲癇發(fā)作評(píng)分，條形圖顯示不同癲癇發(fā)作階段的幼魚(yú)百分比（每組n=60）。(D)Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)幼魚(yú)達(dá)到第2期或第3期的潛伏期（每組n=22）。** P < 0.01采用未配對(duì)Studeent’s t-test。
場(chǎng)電位記錄顯示，F(xiàn)343L組存在多峰放電（圖5A），在兩種溫度下，最大振幅均比WT組增加（圖5B)。在兩種溫度下，F(xiàn)343L組每秒放電事件數(shù)也增加，而高溫只增加了F343L組的事件數(shù)量（圖5C)。WISH圖像顯示廣泛的c-fos在整個(gè)大腦中表達(dá)，特別是在32?C時(shí)。雖然溫度升高對(duì)WT組c-fos的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，F(xiàn)343L組的c-fos隨溫度的升高而顯著升高（圖5E)。以上數(shù)據(jù)表明，在Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)中，高溫也可以通過(guò)上調(diào)c-fos的表達(dá)來(lái)誘發(fā)癲癇樣行為。
圖5 Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)在不同溫度下c-fos的腦活動(dòng)和表達(dá)。(A)從Tg（hGABRG2WT）和Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)幼魚(yú)在28?C和32?C下獲得的代表性現(xiàn)場(chǎng)記錄。(B)各組最大振幅的量化（每組n=3）。數(shù)據(jù)以平均± SEM表示。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,8）= 1.504；F343L，F(xiàn)（1,8）= 46.68；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（1,8）= 1.039。(C)各組癲癇樣出院事件的量化（每組n=3）。數(shù)據(jù)以平均± SEM表示。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,8）= 6.231；F343L，F(xiàn)（1,8）= 192.3；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（1,8）= 6.231。(D) WISH檢測(cè)Tg（hGABRG2WT）和Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)在28?C和32?C在5 dpf時(shí)c-fos mRNA的表達(dá)。c-fos陽(yáng)性表達(dá)呈深紫色。(E)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)大腦中c-fos mRNA水平的定量分析。數(shù)據(jù)歸一化為內(nèi)參基因β-actin，WT組在常溫（28?C）下c-fos mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為“1’”（每組n=6,1個(gè)樣本混合10個(gè)幼蟲(chóng)）。** P < 0.01通過(guò)雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,20）= 2.314；F343L，F(xiàn)（1,20）= 19.18；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（1,20）= 0.2306。
在突變體GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)中也檢測(cè)到了促炎因子。突變GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)顯示IL-1β和IL-6表達(dá)在正常溫度下與WT組相比增加（圖6A-C）。與未轉(zhuǎn)染的斑馬魚(yú)相反，高溫并不影響WT或突變體轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)（圖6A-C）。
圖6 LPS或DEX在不同溫度下對(duì)Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)活性和促炎細(xì)胞因子的影響。用qPCR方法檢測(cè)Tg（hGABRG2WT）和Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)（每組n=-4~6）中IL-1β (A)、IL-6 (B)和TNF-α (C)的表達(dá)。將28?C時(shí)Tg（hGABRG2WT）斑馬魚(yú)中各細(xì)胞因子的表達(dá)量任意取為1。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。(A)溫度，F(xiàn)（1,20）= 3.361；F343L，F(xiàn)（1,20）= 8.307；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（1,20）= 1.878，(B)溫度，F(xiàn)（1,16）= 2.457；F343L，F(xiàn)（1,16）= 15.34；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（1,16）= 3.425，(C)溫度，F(xiàn)（1,12）= 7.222；F343L，F(xiàn)（1,12）= 8.493；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（1,12）= 0.0009071。(D) Tg（hGABRG2WT）斑馬魚(yú)和Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)在不同溫度（28?C和32?C），LPS（80 μg/mL）或DEX（1 μg/mL）暴露。對(duì)每組行走的總距離進(jìn)行量化，數(shù)據(jù)以平均± SEM表示（每組n=32）。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,186）= 3.413；藥物，F(xiàn)（2,186）= 43.69；溫度×藥物相互作用，F(xiàn)（2,186）= 3.876。(E)F343L斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)經(jīng)LPS或DEX暴露達(dá)到第2期或第3期的潛伏期（每組n=3）。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,12）= 32.08；F343L，F(xiàn)（2,12）= 20.77；溫度×F343L相互作用，F(xiàn)（2,12）= 3.476。(F)用qPCR檢測(cè)Tg（hGABRG2F343L）斑馬魚(yú)在不同溫度下（28?C和32?C）中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)（每組=3,10只幼蟲(chóng)）。F343L組各細(xì)胞因子的表達(dá)量任意取1，圖中數(shù)據(jù)為DEX處理后與處理前的表達(dá)量比例。
抑制炎癥反應(yīng)可降低PTZ誘導(dǎo)或GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)染斑馬魚(yú)幼魚(yú)的興奮性
DEX是一種廣泛使用的用于治療炎癥的皮質(zhì)類固醇。在這里，我們使用DEX來(lái)檢測(cè)抑制炎癥是否可以降低PTZ誘導(dǎo)或突變GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)染斑馬魚(yú)的興奮性。在未轉(zhuǎn)染的斑馬魚(yú)中，DEX處理對(duì)斑馬魚(yú)的活性沒(méi)有明顯影響（圖7A）。在PTZ誘導(dǎo)斑馬魚(yú)中，DEX降低了兩者在28?C時(shí)的旅行距離（圖7B)。PTZ誘導(dǎo)斑馬魚(yú)達(dá)到2/3期的潛伏期沒(méi)有顯著變化（圖7C）。在PTZ誘導(dǎo)的28?C和32?C的斑馬魚(yú)中，促炎因子的表達(dá)降低（圖7D)。結(jié)果表明，抑制炎癥反應(yīng)可降低PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)或GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)染的興奮性。
在突變體GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，只有在32?C下，DEX處理才降低了旅行距離（圖6D）。與PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)相反，在32?C時(shí)，DEX處理后，GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)達(dá)到2/3期的潛伏期顯著降低（圖6E)。然而，在兩種溫度下，促炎因子的表達(dá)均無(wú)顯著變化（圖6F）。
圖7 LPS或DEX對(duì)不同溫度下斑馬魚(yú)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和促炎細(xì)胞因子的影響。(A)在5 dpf時(shí)，斑馬魚(yú)在不同溫度（28?C和32?C），LPS（80 μg/mL）或DEX（1 μg/mL）暴露。對(duì)每組行走的總距離進(jìn)行量化，數(shù)據(jù)以平均± SEM表示（每組n=32）。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,186）= 30.19；藥物，F(xiàn)（2,186）= 25.25；溫度×藥物相互作用，F(xiàn)（2,186）= 2.662。(B)PTZ（15mM）誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)在不同溫度（28?C和32?C）下，用LPS（80 μg/mL）或DEX（1 μg/mL）暴露。對(duì)每組行走的總距離進(jìn)行量化，數(shù)據(jù)以平均± SEM表示（每組n=40）。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,234）= 12.69；藥物，F(xiàn)（2,234）= 183.3；溫度×藥物相互作用，F(xiàn)（2,234）= 6.534。(C)PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)LPS或DEX暴露達(dá)到第2期或第3期的潛伏期（每組n=22）。* P < 0.05通過(guò)雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,126）= 10.93；藥物，F(xiàn)（2,126）= 4.940；溫度×藥物相互作用，F(xiàn)（2,126）= 1.611。(D)用qPCR檢測(cè)PTZ誘導(dǎo)的不同溫度（28?C和32?C）下斑馬魚(yú)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)（每組n=4~6，幼魚(yú)10個(gè)混合）。PTZ組中各細(xì)胞因子的表達(dá)量任意取1，圖中數(shù)據(jù)為DEX處理后與處理前的表達(dá)量比例。* P < 0.05和** P < 0.01通過(guò)非配對(duì)Student’s t-test。
高溫改變了斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)GABRG2的表達(dá)
在許多癲癇模型中，GABRG2亞基表達(dá)的改變可能是導(dǎo)致癲癇發(fā)生的原因。在這里，我們檢測(cè)到在28?C和32?C時(shí)，PTZ刺激下斑馬魚(yú)大腦中GABRG2的表達(dá)上調(diào)。在較高的溫度下，其上調(diào)尤其顯著（圖8a和8B）。
圖8 不同溫度下PTZ暴露對(duì)GABRG2表達(dá)的變化。(A)在5 dpf時(shí)，斑馬魚(yú)接受不同的溫度（28?C和32?C），暴露或不暴露15 mM PTZ。用Western印跡法檢測(cè)斑馬魚(yú)幼魚(yú)大腦中GABRG2蛋白表達(dá)水平的代表性圖像。采用GAPDH作為內(nèi)加載對(duì)照。(B)GABRG2（n=4）。數(shù)據(jù)以平均± SEM表示。** P < 0.01采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。溫度，F(xiàn)（1,12）= 68.83；PTZ，F(xiàn)（1,12）= 202.5；溫度×PTZ相互作用，F(xiàn)（1,12）= 27.96。
LPS增加了轉(zhuǎn)染突變GABRG2亞基的HEK293T細(xì)胞的促炎因子
為了進(jìn)一步證實(shí)促炎因子在體外對(duì)癲癇中的作用，我們測(cè)定了在LPS或TNF-α刺激下表達(dá)突變體GABRG2（F343L）亞基的HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞活力。CCK-8數(shù)據(jù)顯示，LPS不影響細(xì)胞活力，而在WT GABRG2或突變GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，TNF-α顯著降低了細(xì)胞活力（圖9A)。LPS處理后，IL-1β和IL-6表達(dá)在突變GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)染細(xì)胞增加，而不是WT GABRG2轉(zhuǎn)染細(xì)胞（圖9B和9C）。LPS刺激對(duì)TNF-α的產(chǎn)生沒(méi)有顯著影響（圖9D）。數(shù)據(jù)表明，LPS刺激增加了突變體GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致，且促炎因子的產(chǎn)生并不依賴于癲癇發(fā)作的發(fā)生。結(jié)果還表明，IL-1β和IL-6均有升高可能與PTZ誘導(dǎo)和突變的GABRG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的癲癇發(fā)生有關(guān)。
圖9 LPS和TNF-α對(duì)轉(zhuǎn)染了α1、β2和γ2 GABAA受體亞基的HEK293T細(xì)胞的影響。將表達(dá)GABAA受體α1，β2，和γ2亞基（WT）或γ2亞基（F343L）的HEK293T細(xì)胞用1 μg/mL LPS或100 nM/L TNF-α處理24小時(shí)。(A)細(xì)胞采用CCK-8法評(píng)估細(xì)胞活力（每組n=11）。** P < 0.01通過(guò)雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。F343L，F(xiàn)（1,58）= 1.113；藥物，F(xiàn)（2,58）= 437.5；F343L×藥物相互作用，F(xiàn)（2,58）= 17.26。用qPCR（n = 5）檢測(cè)轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中IL-1β (B)、IL-6 (C)和TNF-α (D)的表達(dá)。* P < 0.05，** P < 0.01，采用雙向方差分析和隨后的Tukey多重比較檢驗(yàn)。(B) F343L，F(xiàn)（1,24）= 5.700；藥物，F(xiàn)（2,24）= 6.389；F343L×藥物相互作用，F(xiàn)（2,24）= 4.635。(C) F343L，F(xiàn)（1,24）= 8.839；藥物，F(xiàn)（2,24）= 13.63；F343L×藥物相互作用，F(xiàn)（2,24）= 3.944。(D) F343L，F(xiàn)（1,24）= 0.9603；藥物，F(xiàn)（2,24）= 41.07；F343L×藥物相互作用，F(xiàn)（2,24）= 0.3541。
討論
FS是最常見(jiàn)的兒童癲癇發(fā)作形式，發(fā)生在3-5%的5歲前兒童。FS可分為簡(jiǎn)單FS或復(fù)雜FS。復(fù)雜的FS往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果和共病，需要適當(dāng)?shù)闹委?。為了進(jìn)一步研究FS的相關(guān)機(jī)制，我們?cè)诒狙芯客ㄟ^(guò)PTZ暴露或突變GABRG2（F343L）表達(dá)建立了兩種具有FS表型的熱誘導(dǎo)斑馬魚(yú)模型。我們證實(shí)，在這兩種模型中，熱療增加了對(duì)癲癇發(fā)作的易感性和神經(jīng)元活動(dòng)，并且神經(jīng)炎癥參與了熱療誘導(dǎo)的癲癇，這表明炎癥是治療發(fā)燒相關(guān)性癲癇的一個(gè)靶點(diǎn)。
炎癥過(guò)程已經(jīng)在許多癲癇發(fā)作和癲癇的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约鞍d癇患者中被觀察到，這表明神經(jīng)炎癥在癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度和發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。在PTZ誘導(dǎo)大鼠海馬體模型中，IL-1β及其受體顯著增加。我們的數(shù)據(jù)還表明，PTZ能夠在常溫下誘導(dǎo)斑馬魚(yú)幼魚(yú)產(chǎn)生IL-1β，這與之前的研究結(jié)果一致。此外，我們還證實(shí)了突變體GARBG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)中IL-1β和IL-6的增加，這可能是導(dǎo)致較高的癲癇易感性的原因。在電刺激大鼠模型中，海馬內(nèi)給予LPS可增加IL-1β的表達(dá)和谷氨酸的濃度，從而促進(jìn)癲癇的發(fā)生。與對(duì)照組相比，重度癲癇患者血清中HMGB1、TLR4、TNF-α、IL- 1β、IL-1R1水平均升高。這些炎癥介質(zhì)有多種來(lái)源，包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、外周血免疫細(xì)胞和血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞。此外，HMGB1抑制劑通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB通路，在PTZ誘導(dǎo)的成年斑馬魚(yú)慢性癲癇發(fā)作模型中發(fā)揮了抗驚厥作用。胸腺激活調(diào)節(jié)趨化因子（TARC），也被稱為CC趨化因子配體17，是另一個(gè)有前途的耐藥性癲癇患者的生物標(biāo)志物。上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)合臨床觀察表明，這些細(xì)胞因子是新的癲癇標(biāo)志物和難治性癲癇治療策略的潛在靶點(diǎn)。FS及相關(guān)癲癇綜合征涉及免疫機(jī)制，但其確切的潛在致病過(guò)程尚未闡明。在新生大鼠中，皮質(zhì)和海馬中TNF-α、IL-1β和TLR4的增加與FS相關(guān)。據(jù)報(bào)道，全身給藥LPS增加了海馬和下丘腦中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。在這里，我們證明了熱療只誘導(dǎo)PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)產(chǎn)生促炎因子，而不誘導(dǎo)突變的GARBG2（F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)，這表明突變的GABRG2可能隨著溫度增加而影響促炎因子的產(chǎn)生。我們證明，LPS誘導(dǎo)的炎癥足以增加在更高溫度下的運(yùn)動(dòng)活性，抑制炎癥可以降低PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)的興奮性。許多促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括IL-1β、IL-6和TNF-α，可以通過(guò)LPS刺激介導(dǎo)激TLR4和激活核因子-kappaB（NF-κB）系統(tǒng)。TLR4是促炎分子HMGB1的受體，而HMGB1/TLR4通路的激活已在各種實(shí)驗(yàn)性致癲癇性損傷研究中得到證實(shí)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，LPS誘導(dǎo)了炎癥因子IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由于TNF-α在體外不受LPS刺激的顯著影響，體內(nèi)TNF-α的增加可能是癲癇發(fā)作的結(jié)果，從而損害腦細(xì)胞活力。有證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥和癲癇發(fā)作之間可能存在相互作用。
炎癥在癲癇中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，它成為治療目標(biāo)發(fā)熱癲癇TAK- 242，一個(gè)特定的TLR4抑制劑，可以減少炎癥細(xì)胞因子和TLR4表達(dá)皮質(zhì)和海馬，增加癲癇閾值和減少癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間，表明抑制炎癥可能有利于控制FS和TLR4是FS治療的潛在目標(biāo)。一些抗炎療法，包括皮質(zhì)類固醇和靜脈免疫球蛋白（IVIg），也被報(bào)道在治療發(fā)燒相關(guān)癲癇方面有一些效果，但在大多數(shù)情況下，它們不足以預(yù)防癲癇發(fā)生。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們證明了DEX對(duì)炎癥的抑制對(duì)PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型和高溫誘導(dǎo)的Tg（hGABRG2F343L）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)具有抗驚厥作用，進(jìn)一步為炎癥是FS的治療靶點(diǎn)提供了一個(gè)很有希望的論點(diǎn)。
炎癥可能通過(guò)影響谷氨酸和GABA神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及它們的受體的調(diào)節(jié)，從而參與癲癇發(fā)。在2-5天的大鼠中，熱療后腦脊液中GABA水平下降，這是通過(guò)抑制谷氨酸脫羧酶（GAD）活性來(lái)介導(dǎo)的，從而導(dǎo)致發(fā)熱性驚厥。在PTZ處理的大鼠中，海馬體中GABAA受體α1和γ2亞基的表達(dá)增加。GABAA受體γ2亞基，GABRG2，與廣泛性癲癇綜合征相關(guān)，而GABRG2的突變或缺失已被報(bào)道通過(guò)GABAergic通路信號(hào)中斷與FS和GEFS +相關(guān)。通過(guò)GABAA受體調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的神經(jīng)元活性抑制是用作FS的常用藥物。然而，在FS早期，GABAergic信號(hào)增強(qiáng)可能加重癲癇活動(dòng)。在這里，我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)幼魚(yú)中，GABRG2的表達(dá)隨著PTZ的誘導(dǎo)而增加，這可能是對(duì)緊張性抑制降低的適應(yīng)性反應(yīng)。另一方面，攜帶GABRG2（F343L）突變的斑馬魚(yú)，在該模型中，GABRG2的表達(dá)顯著下降，在高溫和PTZ誘導(dǎo)下誘發(fā)癲癇的易感性增加，進(jìn)一步表明GABA傳遞的失調(diào)在FS中發(fā)揮了重要作用。然而，GABRG2表達(dá)的增加和減少在FS的炎癥過(guò)程中是否具有相同的調(diào)控機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。
結(jié)論
綜上所述，我們證實(shí)了FS中誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥，促炎因子特別是IL-1β和IL-6的表達(dá)增加是癲癇發(fā)生的原因。我們的研究結(jié)果還表明，GABRG2的失調(diào)可能在發(fā)熱相關(guān)癲癇的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。此外，抗炎策略可能能夠抑制癲癇發(fā)作，炎癥成為發(fā)燒相關(guān)癲癇治療的潛在靶點(diǎn)。
基金：江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目No.BK20201440)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82271487,81771404），江蘇省高等學(xué)校重點(diǎn)學(xué)術(shù)發(fā)展項(xiàng)目（PAPD）。
原文：Liang, W., Wang, J., Sui, J., Yun, F., Shen, Y., Zhou, J., Wu, Y., Shen, D., and Zhang, Q. Inflammation as a target for the treatment of fever-associated epilepsy in zebrafish larvae. International Immunopharmacology, 2023, 116.
詳細(xì)網(wǎng)址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S156757692300125X
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