雜志：JournalofNaturalProducts
影響因子：5.1（2022）
年份：2021
通訊作者：
YutianPan-電子郵件:pytmnnu@126.com
YuXue?電子郵件:xueyu0614@163.com
通訊作者單位：
摘要
背景：鹽酸氨基葡萄糖(GAH)是最基本的和甲殼素的重要衍生物，是由甲殼素水解濃縮而成鹽酸。目前，GAH在骨骼中的作用機(jī)制尚不清楚發(fā)展。
方法：在這篇報(bào)告中，我們證明了從細(xì)胞壁中提取的GAH以劑量依賴(lài)的方式發(fā)揮作用，不僅促進(jìn)軟骨以及幼魚(yú)的骨骼發(fā)育和成年魚(yú)的尾鰭再生。此外，GAH處理顯著增加了骨代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)標(biāo)記基因，表明其在促進(jìn)骨骼發(fā)育中的重要作用發(fā)展。
結(jié)果：我們的研究表明，在幼蟲(chóng)和成體骨質(zhì)疏松模型誘導(dǎo)經(jīng)高鐵處理后，成骨缺陷明顯改善GAH調(diào)控一系列骨相關(guān)基因的表達(dá)。最后,我們表明GAH通過(guò)促進(jìn)骨骼發(fā)育和損傷修復(fù)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bmp)信號(hào)通路的下游受體水平。
結(jié)論：綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)不僅提供了強(qiáng)有力的研究利用斑馬魚(yú)模型篩選天然骨質(zhì)疏松藥物和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)和策略建立了開(kāi)發(fā)雙孢蘑菇衍生的GAH作為一種治療骨質(zhì)疏松的新藥物的潛力。
關(guān)鍵詞：GAH；骨質(zhì)疏松；斑馬魚(yú)；(Bmp)信號(hào)通路
前言
鹽酸氨基葡萄糖(GAH)是其中最常見(jiàn)的一種獲得甲殼素的堿性和重要衍生物用濃鹽酸水解甲殼素。在以往的研究，其分子量，分子式，和求解了結(jié)構(gòu)式，GAH已經(jīng)被證明具有多種生物學(xué)功能，包括促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，降低腫瘤的生長(zhǎng)速度并將其轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞，抗炎癥活動(dòng)。鹽酸氨基葡萄糖是一種天然氨基單糖衍生物，氨基葡萄糖是對(duì)蛋白聚糖的合成至關(guān)重要軟骨基質(zhì)成分。蛋白聚糖允許關(guān)節(jié)軟骨通過(guò)抑制膠原纖維的拉伸來(lái)吸收沖擊force.7GAH在許多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，比如醫(yī)藥、食品、生物技術(shù)、化妝品和飼料這導(dǎo)致了國(guó)內(nèi)需求的增加國(guó)外。目前，大多數(shù)GAH來(lái)自蝦和蟹殼被大量的鹽酸水解，而其中的重金屬、砷和灰分含量往往超過(guò)中國(guó)食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和USP標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。雙孢蘑菇是一種常見(jiàn)的食用菌。其細(xì)胞壁富含幾丁質(zhì)生物聚合物，主要由甲殼素和殼聚糖。本研究采用雙孢酵母提取GAH，因其消耗的酸、堿較少，產(chǎn)品純度較高，安全性較高，成本較低;特別是砷和灰分的含量低于蝦蟹殼衍生GAH。
脊椎動(dòng)物的骨骼發(fā)育是高度保守的進(jìn)化。斑馬魚(yú)骨骼系統(tǒng)由三部分衍生而來(lái)干細(xì)胞系:神經(jīng)嵴、外側(cè)板和肌小節(jié)中胚層。斑馬魚(yú)的骨骼發(fā)育也始于間充質(zhì)細(xì)胞，分化為成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞在骨形成過(guò)程中經(jīng)歷四個(gè)階段形成:增殖、成熟、礦化和細(xì)胞凋亡。骨骼發(fā)育過(guò)程涉及許多調(diào)節(jié)因子，包括轉(zhuǎn)錄因子，激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如矩陣。斑馬魚(yú)的骨骼發(fā)育是時(shí)序性的;也就是說(shuō)，從頭到尾都有有序的骨化。首先,頭骨發(fā)育，接著是身體骨骼，鰭也跟著發(fā)育此外，該過(guò)程需要對(duì)許多細(xì)胞信號(hào)通路的精確控制。
骨發(fā)育涉及多種信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Bmp、TGFβ、Wnt-β連環(huán)蛋白、Hedgehog,Notch和OPG/RANKL/RANK。這些途徑要么通過(guò)控制來(lái)調(diào)節(jié)骨發(fā)育成骨細(xì)胞分化或在軟骨中起關(guān)鍵作用發(fā)育和骨代謝。骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨質(zhì)紊亂以骨量減少和退化為特征的骨結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加與人口老齡化日益加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也隨之升高上升，使其成為我國(guó)的一個(gè)重要健康問(wèn)題世界各地。目前，主要藥物類(lèi)別為骨質(zhì)疏松癥是指那些抑制骨吸收的疾病，比如雌激素和降鈣素;那些增加骨形成的，如甲狀旁腺激素和他汀類(lèi)藥物;而藥物帶有抗骨吸收和骨形成活動(dòng)，如維生素D3。由于西藥的副作用，中醫(yī)療法已經(jīng)成為越來(lái)越受世界各地患者的歡迎。此外,發(fā)現(xiàn)青蒿素的屠呦呦女士獲得了諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)，證明科學(xué)研究向自然轉(zhuǎn)化與植物藥物開(kāi)發(fā)和藥理功能在我國(guó)具有廣闊的應(yīng)用前景世界各地。
斑馬魚(yú)一直被用作理想的椎體模型用于人類(lèi)疾病的研究這是由幾個(gè)因素造成的，包括短的世代時(shí)間，光學(xué)透明的胚胎，以及在斑馬魚(yú)和人類(lèi)。鑒于這些優(yōu)勢(shì)，研究集中在骨骼上斑馬魚(yú)的形成正迅速變得越來(lái)越普遍在這里的工作中，我們發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇-衍生的GAH促進(jìn)骨發(fā)育，且具有特異性改善骨缺損。我們進(jìn)行了生理測(cè)試生化分析，包括骨鈣化評(píng)估軟骨發(fā)育和成骨細(xì)胞的表達(dá)水平相關(guān)的基因。并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了探討在骨骼發(fā)育過(guò)程中，GAH通過(guò)Bmp信號(hào)傳導(dǎo)斑馬魚(yú)的損傷修復(fù)。
實(shí)驗(yàn)部分GAH和其他藥物
從雙孢霉中提取GAH我們的實(shí)驗(yàn)室。將新鮮雙孢霉切碎勻漿后煮熟在100℃水浴中浸泡2h，冷卻后用200目絲過(guò)濾布。以1:4將過(guò)濾殘余物添加2%NaOH溶液(w/w)，在100℃水浴中煮沸2h。冷卻后，過(guò)濾殘余物并且然后用水洗滌到中性狀態(tài)。的以1:4的比例將中性雙孢曲霉殘余物與1%HAC溶液一起添加(w/w)并置于100℃水中。冷卻后，殘?jiān)鼮檫^(guò)濾后再用水沖洗至中性狀態(tài)，最后干燥并粉碎用于制備試驗(yàn)。GAH水解產(chǎn)物為借由在36%鹽酸中水解(80℃4h)獲得，然后冷卻和過(guò)濾。進(jìn)一步研究該GAH水解產(chǎn)物通過(guò)加水濃縮以去除大部分鹽酸。經(jīng)脫色后，最終獲得GAH樣品通過(guò)乙醇結(jié)晶獲得。HPLC執(zhí)行為與標(biāo)準(zhǔn)GAH樣品進(jìn)行成分分析。標(biāo)準(zhǔn)GAH樣品購(gòu)自Sigma(G1514)。艾爾DM分別購(gòu)自默克公司和西格瑪公司。
斑馬魚(yú)
TU菌株Tg(osx:mcherry)16和Tg-(BRE:GFP)40在本研究中被使用。所有的魚(yú)都是飼養(yǎng)的于28.5℃下于具有10/14h之標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)水系統(tǒng)中黑/光周期。斑馬魚(yú)胚胎為自然獲得產(chǎn)卵。所有胚胎和幼蟲(chóng)均在HolfreterH2O中培養(yǎng)含NaCl3.5g/L、KCl0.5g/L、CaCl20.1g/L、0.025g/LNaHCO3。
骨染色和骨定量分析礦化
本研究中所有的骨骼染色，包括阿新藍(lán)、茜素紅、鈣黃綠素染色根據(jù)我們之前發(fā)表的研究。
半定量PCR和ELISA
總RNA和cDNA按照之前描述的方法制備37半定量PCR檢測(cè)β-的表達(dá)水平肌動(dòng)蛋白，sox9b,col10a1a,col1a2,BGP,sp7,bmp2b和bmp4。的半定量PCR的擴(kuò)增參數(shù)為(1)95℃5分鐘，(2)95℃30s，(3)54℃30s，(4)72℃30s，(5)重復(fù)步驟2到4進(jìn)行約28個(gè)周期，并在72℃下進(jìn)行10個(gè)周期Min，在某些情況下進(jìn)行微調(diào)。ALP-ELISA試劑盒采用B、BGP和TRAP，并進(jìn)行相應(yīng)的操作根據(jù)工具箱。本研究使用的ELISA引物和方法可根據(jù)要求提供學(xué)習(xí)。
WISH和免疫熒光
整座原位雜交-斑馬魚(yú)胚胎化(WISH)按照描述進(jìn)行以前使用探針檢測(cè)以下靶點(diǎn):sp7、col1a2、Col2a1a、col10a1a、sox9a、sox9b、runx2b、bmp2b、bmp4、bmp7a和gfp。胚胎采用熒光顯微鏡(尼康，SMZ18)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)如中所述進(jìn)行ref41。本研究中使用的抗體包括兔抗斑馬魚(yú)抗體Bmp2b(NT)(Anaspec,1:50稀釋)，兔抗斑馬魚(yú)Chordin抗體(GeneTex,1:50稀釋)，小鼠抗smad1抗體(SantaCruz)，兔抗磷酸化smad1/5/8(細(xì)胞信號(hào)，1:100稀釋)，小鼠抗β-catenin(細(xì)胞信號(hào)，1:100稀釋)，山羊抗地高辛(羅氏，1:4000稀釋)，DyLight488共軛親和純山羊抗小鼠IgG和DyLight549標(biāo)記的親和純山羊抗兔IgG二抗(JacksonImmunoResearch,1:100稀釋)。
統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。學(xué)生的t采用雙側(cè)不等方差檢驗(yàn)確定p值對(duì)于本研究中的所有測(cè)量。與P<的P值比較;0.05(*)，P<0.01(**)，P<取0.001(***)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
GAH促進(jìn)幼蟲(chóng)骨骼發(fā)育和成年斑馬魚(yú)的尾鰭再生
GAH在從雙孢霉中提取。高效液相色譜法(HPLC)顯示此峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)GAH(1.210Min,1.211Min)，峰形對(duì)稱(chēng)。是什么1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)GAH的峰面積為1.211min為1812.74768mAU·s，雙孢霉-1.210min時(shí)的GAH為1998.35132mAU·s，大于與標(biāo)準(zhǔn)品GAH相比，純度較高高于標(biāo)準(zhǔn)GAH(圖1A)。如斑馬魚(yú)頭軟骨形成于5dpf,我們處理胚胎0.75hpf直到5dpf,GAH為7個(gè)不同濃度(0、0.01%、0.03%,0.05%,0.1%,0.3%,和0.5%)。
根據(jù)圖1B所示的病死率，我們使用SPSS軟件確定本研究中GAH的IC50為0.324%。我們選擇了3個(gè)工作濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn):0.05%、0.1%和0.3%。經(jīng)過(guò)治療后在不同濃度的GAH下，每5天采集1次幼蟲(chóng)用于阿爾新藍(lán)染色。對(duì)照組為頭部軟骨如梅克爾軟骨(Meckel’scartilage,mk)、角鞏膜軟骨(ceratohyal(ch)，腭方(pq)，唇下頜(hm)，以及前頸鰓裂(cb1?3)清晰可見(jiàn)(圖1-3)1c。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組軟骨發(fā)育較慢gah處理組表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)-表示“狀態(tài)”。我們將這些表型分為四種類(lèi)型:正常，H1H2和H3。軟骨結(jié)構(gòu)，如mk,ch,pq和hm，在H1型中明顯加深。在H2型中，Mk、ch、pq、hm進(jìn)一步加深，呈1?3對(duì)角線下頜骨更清晰可見(jiàn);甚至是第四個(gè)牛皮可以觀察到支氣管。在H3型中，ps和第五型頸鰓裂清晰可見(jiàn)(圖1C)。在低GAH濃度為0.05%，以H1為主表型，占本組斑馬魚(yú)的40%。在中間濃度(0.1%)、H1型比例增加，約占40%。在高處——濃度(0.3%)GAH組，超過(guò)50%的幼蟲(chóng)顯示H2軟骨發(fā)育表型。所有三個(gè)濃度包括一定比例的幼蟲(chóng)與H3表型(圖1D)。這些結(jié)果提示GAH是能以劑量依賴(lài)性方式促進(jìn)斑馬魚(yú)頭部軟骨的發(fā)育。
茜素紅在骨形成中與鈣離子相互作用可以用來(lái)評(píng)估骨骼形狀和骨礦物質(zhì)密度。因此，我們?cè)u(píng)估了骨發(fā)育斑馬魚(yú)在GAH處理6dpf后使用茜素紅染色。對(duì)照組染色信號(hào)可清晰在幼魚(yú)的頭骨上觀察到，特別是在魚(yú)蓋處(op)、脊索(nc)、鎖骨(cl)和枕骨(oc)。隨著GAH濃度增高，染色信號(hào)增強(qiáng)面積逐漸增強(qiáng)，意味著骨增加礦化。在0.1%和0.3%GAH暴露組中，88%和79%的幼蟲(chóng)表現(xiàn)出增強(qiáng)在骨化區(qū)域，如ch,ps,hm和bs(圖1E).
斑馬魚(yú)是研究鰭的一個(gè)極好的模型系統(tǒng)再生，即尾鰭可以完全再生截肢之后。成年魚(yú)(1.5歲)切除尾鰭，然后在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)或0.1%GAH溶液。鈣黃綠素能染色骨內(nèi)鈣化活體組織用來(lái)標(biāo)記骨的程度鈣化。在GAH治療組中，我們發(fā)現(xiàn)50%以上的魚(yú)表現(xiàn)出尾鰭再生，較好高于對(duì)照組(圖1F、G)。鈣黃綠素染色結(jié)果表明GAH能促進(jìn)尾鰭再生顯著增加骨量(圖1F'-G″)。
圖1 GAH促進(jìn)骨骼發(fā)育和鰭再生。(A)標(biāo)準(zhǔn)GAH和雙孢霉衍生GAH的HPLC峰圖。(B)不同濃度GAH處理后72hpf的胚胎死亡率。(C)GAH后斑馬魚(yú)幼魚(yú)阿爾新藍(lán)染色治療。(D)(C).(E)GAH處理后6dpf的茜素紅染色統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。(F?G)GAH處理后再生尾鰭15天。再生鰭(F'、G')的鈣黃綠素染色;F″和G"是紅色方塊E'和F'的放大倍率。箭頭表示ch，ceratohyal;ps,parasphenoid;數(shù)控、脊索;不,耳石;oc,枕;ceratobranchialcb1?5日;嗯,hyomandibula;cl,cleithrum;可,Meckel軟骨;pqpalatoquadrate;op,鰓蓋;Ma，下頜弓。比例尺:100μm。
GAH可增加骨特異性表達(dá)水平標(biāo)記基因
根據(jù)骨染色的結(jié)果，我們想了解基因的表達(dá)水平是否有特異性調(diào)控骨骼發(fā)育發(fā)生了改變。首先，我們發(fā)現(xiàn)軟骨特異性標(biāo)記基因col1a2、col10a1a、和col2a1a。這些基因?qū)儆谀z原蛋白家族col1a2編碼I型膠原合酶和col10a1a和col2ala編碼II型膠原合酶，并且已知參與骨膜成骨，調(diào)控骨化過(guò)程軟骨內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生。這里，我們檢測(cè)到這三種軟骨標(biāo)記基因在72HPF處被原位檢測(cè)雜交(ISH)。結(jié)果表明，該基因的表達(dá)三個(gè)基因在頭部增加。信使rna這些基因的分布均顯著增強(qiáng)隨著GAH濃度的增加。與對(duì)照組col10a1a表達(dá)逐漸加深旁蝶竇(ps)區(qū)域在GAH治療組。在0.1%和0.3%GAH組col10a1a表達(dá)明顯增加在鰓骨(bs)，鰓蓋中增強(qiáng)和擴(kuò)張(op)和腭方(pq)區(qū)域(圖2A)。在0.1%和0.3%GAH組col2a1a表達(dá)明顯凹痕(de)和頭骨區(qū)域增加(圖2B)。與col2a1a相似，col1a2在全基因組的分布整個(gè)骨骼也呈明顯的梯度增加方式(圖2C)。這些結(jié)果表明，GAH可以促進(jìn)軟骨標(biāo)志基因col1a2的表達(dá)Col10a1a和col2a1a呈劑量依賴(lài)性。
以上數(shù)據(jù)表明，GAH在促進(jìn)骨骼發(fā)育。接下來(lái)，我們想要探究是否GAH治療影響成骨的調(diào)節(jié)。然而,骨骼發(fā)育過(guò)程涉及一系列調(diào)控因子，包括sp7(osterix,osx)和runx家族基因，哪些在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化中起重要作用點(diǎn)子。其他關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，如sox9a和Sox9b，已被報(bào)道調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞形成。0.75hpf的胚胎接受不同的處理濃度為72hpf。治療后,runx2b在ps、op等組織中表達(dá)增強(qiáng)說(shuō)明GAH可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成分化(圖2D)。sox9a和sox9a的表達(dá)水平sox9b在頭部也逐漸增強(qiáng)(圖1)2e、F)。重要的是，GAH對(duì)sp7的促進(jìn)作用，Sox9a和sox9b早在24HPF開(kāi)始并持續(xù)到5HPFdpf，以及它對(duì)runx2b的影響(圖S1和S2)。
此外，我們使用了Tg(osx:mcherry)轉(zhuǎn)基因菌株，在成骨細(xì)胞中特異性表達(dá)mCherry的是什么。成骨細(xì)胞分化程度6天后0.1%GAH處理后，mCherry表達(dá)下降頭部，尤其是clethrum明顯增大(cl)、下頜弓(ma)和梅克爾軟骨(mk)區(qū)域(圖2G?H')。再生尾鰭采用原位雜交(ISH)法檢測(cè)sp7mRNA水平。GAH處理后，sp7的表達(dá)明顯增加在新生鰭中，尤其是在遠(yuǎn)端鰭鰩中(圖2I-J”)。半定量PCR檢測(cè)表達(dá)骨特異性基因，如sox9a,sox9b,col10a1a，和col1a2(圖2K?O)。再生尾鰭分為對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(0.1%阿侖膦酸鈉(Alendronatesodium,AL)組和gah組。DNA這些基因的電泳條帶均明顯在GAH組增加(圖2K)。統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)一步表明這種增強(qiáng)是顯著的，甚至比AL組更顯著(圖1)2l?O)。綜上所述，這些結(jié)果表明GAH治療可促進(jìn)骨骼發(fā)育和尾鰭發(fā)育再生;而且在推廣方面也優(yōu)于AL尾鰭再生。
圖2 GAH處理增強(qiáng)了成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平。(A?C)軟骨基因(col10a1a、col2a1a和col2a1a)的表達(dá)col1a2)的表達(dá)量隨GAH濃度的增加而增加。(D?F)成骨標(biāo)志基因(runx2b、soa9a和soa9a)的表達(dá)sox9b)在72hpf隨GAH濃度的增加而增加。(G,H)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的mCherry強(qiáng)度GAH處理6d后，表明成骨細(xì)胞分化程度。(G'，H')合并圖片。(I,J)sp7在腫瘤組織中的表達(dá)GAH處理15天后再生鰭。I'和J'是I和J中紅色方框的放大倍數(shù)(K)對(duì)應(yīng)的放大波段半定量PCR檢測(cè)sox9a、sox9b、col10a1a、col1a2的表達(dá)。AL(阿侖膦酸):陽(yáng)性藥物。β肌動(dòng)蛋白:參考基因。(L?O)K定量數(shù)據(jù);*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.箭頭表示ch，鼻透明;ps,parasphenoid;電腦,parachordal;德,削弱;cbceratobranchial;廢話,branchiostegal;H，舌骨弓;cl,cleithrum;Ma(m)，下頜弓;mk,Meckel軟骨;pq,palatoquadrate;op,鰓蓋;Ma，下頜弓。比例尺:100μm。
圖S1 GAH促進(jìn)sp7(A)、sox9a(B)和sox9a的時(shí)空表達(dá)模式sox9b(C)在不同濃度的GAH處理后24hpf胚胎的側(cè)位切面，48hpf胚胎的腹側(cè)切面，箭頭表示:cl,cleithrum;ps,parasphenoid;oc,occitipal。比例尺:100μm。
圖S2 runx2b(A)、sp7(B)、sox9a(C)和sox9b的時(shí)空表達(dá)模式(D)不同濃度GAH處理5dpf后。箭頭表示:ph骨，perichondral骨;M，下頜弓;cbceratobranchial;ps,parasphenoid;chceratohyal;op,鰓蓋;oc,occitipal;pqpalatoquadrate。比例尺:100μm。
GAH促進(jìn)fac誘導(dǎo)的骨骼損傷修復(fù)骨質(zhì)疏松斑馬魚(yú)幼體和成體
在我們之前的課程中工作中，我們成功構(gòu)建了斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型使用高鐵應(yīng)力在這里，我們使用這個(gè)模型進(jìn)行探索GAH對(duì)骨損傷的治療效果。將2dpf胚胎分為5組在10dpf下收集并進(jìn)行茜素紅，鈣黃綠素和阿爾新藍(lán)染色。治療組如下:對(duì)照組組(僅在HolfreterH2O中持續(xù)培養(yǎng));500μg。ml?1FAC組(FAC8d);FAC+H2O組(4dFAC+4dH2O);FAC+AL組(FAC+AL組)1mgmL?1AL染毒1個(gè)月額外4d);FAC+GAH組(4dFAC+4d0.1%GAH)。
骨骼染色顯示，與對(duì)照組相比組，fac誘導(dǎo)模型組呈現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松表型，包括骨密度降低和軟骨的發(fā)育性損傷。高鐵環(huán)境下的魚(yú)應(yīng)力處理后再進(jìn)行H2O處理，其效果略有改善這種表型。阿侖膦酸鈉顯著挽救FAC-誘導(dǎo)骨鈣化減少75%以上與單純fac組相比。重要的是,顯著改善fac誘導(dǎo)的骨密度降低與之相比，發(fā)育受損超過(guò)70%FAC-only組。具體來(lái)說(shuō)，這次營(yíng)救是由脊柱、nc(脊索)和oc(枕骨)的信號(hào)恢復(fù)區(qū)域(圖3A?C)。定量分析顯示僅陽(yáng)性對(duì)照治療AL組顯著修復(fù)軟骨損傷;而GAH治療顯著拯救骨骼損傷，在這方面比正面藥物更有效圖3D?G。
經(jīng)不同藥物治療后，我們收集10DPF的幼蟲(chóng)，檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平sox9a、sox9b、col10a1a、col1a2和BGP的半定量分析PCR。電泳條帶顯示，GAH為最有效的藥物修復(fù)fac誘導(dǎo)的減少骨密度和發(fā)育損傷(圖3H)。定量分析顯示，在GAH治療中組中這些基因的mRNA水平均顯著升高顯著高于FAC組，甚至更高與AL組相比，sox9a,col1a2和bgp(圖3I)。我們同時(shí)檢測(cè)成骨細(xì)胞蛋白表達(dá)水平骨特異性堿性磷酸酶B(ALP-B)、骨鈣素(BGP)等標(biāo)志物破骨細(xì)胞標(biāo)志物，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)ELISA檢測(cè)。堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)的蛋白水平FAC治療后明顯降低，可挽救根據(jù)GAH，甚至優(yōu)于AL組(圖3J,K)。在而TRAP蛋白水平在FAC組升高，表明骨代謝平衡而GAH可以完全恢復(fù)這種不平衡(圖3l)。此外，我們還觀察了成骨細(xì)胞的變化不同組之間的分布，如Tg(osx:mcherry)轉(zhuǎn)基因菌株。我們發(fā)現(xiàn)GAH是最重要的有效地挽救了成骨細(xì)胞分化引起的缺陷通過(guò)FAC，特別是在mk和cl區(qū)域(圖3M,N)。
探討GAH是否具有相同的影響將成年魚(yú)骨質(zhì)疏松、1.5歲魚(yú)分為以下5組:對(duì)照組(僅培養(yǎng)于HolfreterH2O);facs處理組(500μgmL?1FAC25d);FAC+H2O組(FAC染毒15d)以及額外10d于H2O中);FAC+AL組(治療組)先暴露于FAC15d，然后暴露于1mgmL?1阿侖膦酸鹽追加10d);FAC+GAH組(暴露于FAC15d，再暴露于0.1%的FAC10d嗨)。處理后進(jìn)行茜素紅染色。野生型魚(yú)在骨染色中表現(xiàn)出很強(qiáng)的信號(hào)(圖4A)，而FAC-誘導(dǎo)模型組較模型組明顯降低區(qū)域和染色強(qiáng)度(圖4B)。進(jìn)一步高倍鏡下觀察確定染色陽(yáng)性頭部、脊柱和尾鰭區(qū)域顯著在模型組下降(圖4A1?A3,B1?B3)。暴露于FAC后，在水中繼續(xù)培養(yǎng)則沒(méi)有結(jié)果全骨缺損明顯恢復(fù)(圖4C-C3)。這些全骨的缺損可以被有意義的修復(fù)AL(圖4D?D3)。重要的是，GAH暴露幾乎完全彌補(bǔ)了整個(gè)骨骼密度的不足，特別是在頭部、脊柱和尾鰭(圖4E?E3)。進(jìn)一步的定量分析顯示，在脊柱尾鰭區(qū)域，累積骨光密度(IOD)與GAH和AL治療組相比，GAH和AL治療組的肺纖維化程度顯著增加與fac治療組比較(圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明GAH對(duì)fac誘導(dǎo)的損傷具有明顯的修復(fù)作用幼魚(yú)和成魚(yú)的骨質(zhì)疏松。
圖3 GAH對(duì)FAC誘導(dǎo)的幼鼠骨骼發(fā)育缺陷具有顯著的治療作用。茜素紅染色(A)，阿利新斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露于FAC48hpf至6dpf以及隨后的藥物處理后，在10dpf進(jìn)行藍(lán)染色(B)和鈣黃綠素染色(C)從6DPF到10DPF;GAH和AL的濃度均為0.1%。(D、E)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)源于茜素紅染色，對(duì)應(yīng)相對(duì)分別測(cè)量礦化面積和骨密度。(F)b的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。(G)鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度定量分析染色。(H)半定量PCR檢測(cè)不同處理組sox9a、sox9b、col10a1a、col1a2、BGP對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增條帶為表示。β-Actin:內(nèi)參基因。(I)定量數(shù)據(jù)來(lái)自h(J?L)不同組的ALP-B、BGP和TRAP的蛋白水平。與ctr組比較，##P<0.01，###P<0.001.與FAC組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,NS:無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(M)Tg(osx:mcherry)在不同藥物處理后10dpf的熒光蛋白表達(dá);箭頭表示:ch,ceratohyal;ps,parasphenoid;數(shù)控、脊索;不,耳石;oc,occitipal;ceratobranchialcb1?5日;嗯,hyomandibula;cl,cleithrum;mk,Meckel軟骨;pq,palatoquadrate;op,鰓蓋;Ma，下頜弓。比例尺:100μm。(N)M的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
圖4 GAH對(duì)fac誘導(dǎo)的成年魚(yú)骨質(zhì)疏松有顯著的治療作用。茜素紅染色1.5歲成人，表明全骨密度。不同的處理以A-A3表示。對(duì)照組:HolfreterH2O培養(yǎng);(B?B3)500μg。mL?1FAC處理25天;(C-C3)暴露于FAC15d，在HolfreterH2O中連續(xù)培養(yǎng)10d;(D?D3)FAC治療15天，隨后用0.1%AL治療10天;(E-E3)FAC治療15天，隨后0.1%GAH治療10天。(F)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分別來(lái)自A2~E2(脊柱)和A3~E3(尾鰭)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
GAH促進(jìn)骨骼發(fā)育通過(guò)靶向Bmp信號(hào)
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GAH在促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用對(duì)鰭的發(fā)育和再生具有重要意義對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療效果，正如兩者所證明的幼體和成體斑馬魚(yú)模型。在此基礎(chǔ)上結(jié)果，我們繼續(xù)探索哪些信號(hào)通路的GAH以促進(jìn)骨生長(zhǎng)和損傷修復(fù)。
我們發(fā)現(xiàn)，GAH治療可導(dǎo)致心肌病表型類(lèi)似于Bmp過(guò)表達(dá)和以更小或融合的眼睛(V1)為特征，尾骨增大(V2)、頭部神經(jīng)系統(tǒng)缺失(V3)、脊髓損傷(V3)血島積聚(V4)(圖5A)。這些治療后，向心性表型呈劑量依賴(lài)性高濃度的GAH(0.3%);超過(guò)一半胚胎心室化，且表型越嚴(yán)重(V3和V4)占胚胎總數(shù)的20%以上圖5B進(jìn)一步支持aGAH與Bmp信號(hào)的關(guān)系。
在斑馬魚(yú)中，Bmp家族的主要成員包括Bmp2b,Bmp4和Bmp7a。因此，我們檢測(cè)了mRNA屏蔽(6h)時(shí)bmp2b、bmp4和bmp7a的表達(dá)水平ISH分期24hpf期。GAH可以顯著增加表達(dá)Bmp家族成員在原腸期均有擴(kuò)增其表達(dá)范圍及染色強(qiáng)度增強(qiáng)。為bmp2b在0.1%或0.3%GAH處理后表達(dá)從腹側(cè)向背側(cè)深度擴(kuò)張，在組織者區(qū)域有明顯的增加(圖5C)。這種增強(qiáng)作用持續(xù)至24hpf bmp2b和bmp4在腦內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng)尾芽區(qū)域隨處理濃度的增加而增加圖5D。我們還檢測(cè)了Bmp2b和bmp4在骨質(zhì)疏松的幼蟲(chóng)和再生中不同指示處理后的尾鰭。結(jié)果表明，bmp2b和bmp4的轉(zhuǎn)錄水平是兩者都通過(guò)GAH恢復(fù)(圖S3)。接下來(lái)，我們使用免疫熒光檢測(cè)內(nèi)源性Bmp2b定位0.1%GAH治療后。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明24hpf和72hpf均以Bmp2b為主分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間區(qū)域，部分Bmp2b定位于質(zhì)膜。與對(duì)照組比較，Bmp2b的分布在GAH后頭部和尾部區(qū)域明顯增強(qiáng)治療。在72hpf時(shí)，Bmp2b蛋白有升高趨勢(shì)頭部區(qū)域的表達(dá)與24時(shí)觀察到的一致(圖5E,F)。
Bmp信號(hào)通過(guò)其磷酸化而被激活下游轉(zhuǎn)錄因子，smad1/5/8。p-smad1/5/8(磷酸化的smad1/5/8)可以進(jìn)入細(xì)胞核激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄在在我們之前的研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們研究了GAH是否可以通過(guò)監(jiān)測(cè)smad1/激活Bmp信號(hào)5/9。0.1%GAH處理的胚胎從0.75hpf到24hpfsmad1和smad5mRNA的分布通過(guò)ISH檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)smad1在GAH處理后明顯增強(qiáng)，尤其是在尾椎和整個(gè)脊椎脊柱。Smad5主要表達(dá)于小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)頭部，其表達(dá)也明顯增加GAH治療后(圖6A)。另外，我們用了a特異性免疫熒光抗體檢測(cè)p-smad1/5/8整個(gè)胚胎在24HPF和72HPF的水平。與對(duì)照組比較，0.1%GAH治療組與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組p-的核定位明顯增強(qiáng)Smad1/5在這兩個(gè)階段的頭部和尾部均有表達(dá)(圖6b)。BRE(Bmp響應(yīng)元件)是一種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Bmp激活做出反應(yīng)的調(diào)控元件.隨后觸發(fā)一系列細(xì)胞行為T(mén)g-(BRE:gfp)胚胎在治療后24hpf收集不同濃度的GAH。采用ISH法進(jìn)行檢測(cè)gfpmRNA,gfp蛋白熒光強(qiáng)度為觀察到。結(jié)果表明，gfp的表達(dá)是腹側(cè)頭部和尾部明顯隆起增加GAH濃度(圖6C)。的GFP熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)頭部和背部的神經(jīng)嵴隨增加而增加GAH濃度(圖6D)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明在斑馬魚(yú)中GAH促進(jìn)骨骼通過(guò)靶向Bmp信號(hào)來(lái)發(fā)展。
圖5 GAH可增強(qiáng)Bmps的表達(dá)。(A)不同濃度GAH處理后24hpf的心室化表型。(B)不同類(lèi)型(A)在三種濃度的GAH的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。(C,D)通過(guò)ISH在6hpf和24hpf表達(dá)bmp2b,bmp4和bmp7a，分別隨GAH濃度的增加而增加。(E、F)Bmp2b蛋白在斑馬魚(yú)頭部和尾部的亞細(xì)胞定位分別為24HPF和72HPF。紅色標(biāo)記為Bmp2b，綠色標(biāo)記為細(xì)胞膜標(biāo)志蛋白β-catenin。比例尺:100μm。
圖6 GAH通過(guò)增加磷酸化smad1/5/8的活性來(lái)激活Bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。(A)smad1和smad5mRNA的表達(dá)在24hpf的GAH。(B)斑馬魚(yú)24、72hpf頭部和尾部p-smad1/5/8蛋白表達(dá)情況。紅色信號(hào)代表p-smad1/5/8;DAPI(藍(lán)色標(biāo)簽)專(zhuān)門(mén)識(shí)別細(xì)胞核。(C,D)處理后gfpmRNA和熒光蛋白(gfp)的表達(dá)在Tg(BRE:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，GAH分別顯示在24hpf和48hpf。比例尺:100μm。
圖S3 GAH處理后10dpf仔魚(yú)的bmp基因表達(dá)增強(qiáng)成年斑馬魚(yú)的再生鰭。(A)bmp2b和bmp4的半定量擴(kuò)增條帶不同處理組的PCR結(jié)果均為10dpf幼蟲(chóng)。β-肌動(dòng)蛋白:內(nèi)參基因。(c)定量數(shù)據(jù)來(lái)自A.(D)半定量PCR檢測(cè)bmp2b和bmp4的擴(kuò)增條帶不同處理組在成體再生鰭中顯示。β-actin:內(nèi)參基因。(E-F)定量數(shù)據(jù)來(lái)自D.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
GAH作用于Bmp信號(hào)的下游受體的水平
一個(gè)有趣的問(wèn)題是關(guān)卡的作用GAH在Bmp信號(hào)上工作。為此，我們使用了一種BmpI型的特異性抑制劑dorsomorphin(DM)受體(Alk3)和tBr(Alk3的截短形式)，以抑制其表達(dá)Bmp信號(hào)分別來(lái)自受體水平胚胎2.5μMDM處理0.75~6h，然后替換為加入0.1%GAH或Holfreter水，直至26小時(shí)野生型組，DM處理(0.75~26h)引起不同的背根化表型由于Bmp的抑制信號(hào)傳導(dǎo)，包括尾部組織輕微缺失(D1)，較小腹部組織(D2)和尾部組織不清晰(D3)，其中D3是顯性表型(>50%)。在DM+GAH組D3降低至20%以下D1增加至50%左右。此外,我們將tBrmRNA注射到單細(xì)胞胚胎中，然后用0.1%GAH培養(yǎng)至26h僅DM組可誘導(dǎo)與DM組相同的背根化表型治療，其中D1、D3占80%以上，與GAH共培養(yǎng)后，D1型細(xì)胞增多>80%時(shí)，D3消失，正常值由0%增加至10%(圖7A)。這表明這是嚴(yán)重的背伸表型(D3)引起的受體抑制可大大降低經(jīng)GAH后緩解，甚至轉(zhuǎn)為正常表型。
此外,半定量PCR檢測(cè)其表達(dá)成骨特異性標(biāo)志物bmp2b、bmp4、Sp7(osx)、sox9a、sox9b和col10a1a。糖尿病后這些基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低而GAH可顯著恢復(fù)上述指標(biāo)的下降DM引起的基因表達(dá)(圖7B)。最后，我們使用觀察雙轉(zhuǎn)基因系Tg(osx:mCherry;BRE:GFP)mCherry和GFP熒光的共定位代表SP7蛋白水平和Bmp信號(hào)活性，分別。mCherry和GFP的表達(dá)均為陰性0.1%GAH處理36h后明顯增強(qiáng)，特別是在尾部區(qū)域;共定位區(qū)域和強(qiáng)度顯著增加(圖7C)。所有這些數(shù)據(jù)表明，GAH可能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化通過(guò)Bmp信號(hào)傳導(dǎo)和下游功能受體水平(圖7D)。
圖7 GAH作用于受體水平下游的Bmp信號(hào)。(A)26hpf背根化表型的代表形態(tài)(左)各組統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如右圖所示。工作劑量為2.5μMDM、100pgtBrmRNA、0.1%GAH。比例尺:100μm。(B)半定量PCR擴(kuò)增bmp2b、bmp4、sp7、sox9a、sox9b和col10a1a對(duì)應(yīng)的條帶，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不同的組。同a組處理后收集26hpf胚胎。0.001.與DM組比較，**P<0.01，***P<0.001.(C)Tg(osx:mCherry;BRE:GFP)胚胎在36hpf觀察到mCherry和GFP不同組的熒光表達(dá)情況如下。黃色箭頭表示mCherry和GFP在尾部區(qū)域的共定位。(D)工作GAH作用于Bmp信號(hào)的模型。
討論
之前的研究已經(jīng)證明GAH具有抗癌和抗腫瘤的雙重作用pro-immune函數(shù);GAH可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞恢復(fù)分化能力，大大降低腫瘤生長(zhǎng)速度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖然而，沒(méi)有報(bào)道表明GAH起著重要的作用在骨骼發(fā)育中的作用，以及詳細(xì)的基礎(chǔ)分子機(jī)制尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，我們證明GAH通過(guò)Bmp/Smad1/5/9途徑發(fā)揮作用顯著促進(jìn)骨骼發(fā)育，促進(jìn)恢復(fù)幼魚(yú)和成年斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型的研究我們建立了GAH的三濃度梯度死亡率。然后用骨骼染色觀察明顯的骨骼變化，包括軟骨，骨的增加礦化和骨鈣化。我們找到了GAH以劑量依賴(lài)性方式作用以促進(jìn)軟骨和在斑馬魚(yú)的幼體骨發(fā)育中起到促進(jìn)作用尾鰭的再生(圖1)在幼蟲(chóng)和動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到與骨骼相關(guān)的標(biāo)記基因再生成體尾鰭。ISH和半定量PCR結(jié)果顯示，GAH處理引起a骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)顯著增加col2a1a、col10a1a、BGP、sp7、sox9a和sox9b等基因說(shuō)明GAH起著重要的促進(jìn)作用骨骼發(fā)育(圖2)。
之前的研究表明，鐵離子可以促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和骨吸收通過(guò)活性氧(ROS)的產(chǎn)生。以前,我們成功地利用幼魚(yú)和成年斑馬魚(yú)進(jìn)行了發(fā)育使用高鐵應(yīng)力建立快速而穩(wěn)健的骨質(zhì)疏松模型我們使用這個(gè)模型來(lái)驗(yàn)證GAH的治療效果FAC-induced骨質(zhì)疏松癥。結(jié)果表明，GAH特別改善骨軟骨缺損和骨骼染色、半定量PCR和ELISA分析證實(shí)GAH治療可以挽救一系列骨表達(dá)幼魚(yú)和成年魚(yú)的相關(guān)基因。此外,成骨細(xì)胞相關(guān)熒光蛋白表達(dá)GAH處理顯著增強(qiáng)Tg(osx:mCherry)轉(zhuǎn)基因幼蟲(chóng)，GAH處理效果較好用陽(yáng)性對(duì)照藥物AL治療(圖3和4)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，GAH將是一個(gè)促進(jìn)骨骼發(fā)育的優(yōu)秀候選藥物修復(fù)。
我們繼續(xù)探索其分子機(jī)制GAH促進(jìn)骨骼發(fā)育就像GAH治療一樣導(dǎo)致類(lèi)似于BMP過(guò)度表達(dá)的表型，我們檢測(cè)兩個(gè)主要成員的mRNA表達(dá)水平其下游因子Smad1/5/9。我們發(fā)現(xiàn)所有這些基因的mRNA和蛋白水平都是逐漸增加。此外，在Tg(BRE:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，GFP熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)在頭部和神經(jīng)嵴后部增加增加GAH濃度(圖5和6)。此外，GAH可以極大地挽救背根化表型以及下調(diào)骨特異性基因表達(dá)引起的通過(guò)dorsomorphin抑制Bmp受體治療和tBr過(guò)表達(dá)，表明GAH起作用受體水平下游的Bmp信號(hào)(圖7)。GAH和Bmp信號(hào)成員及其下游靶基因仍不清楚，應(yīng)在后續(xù)解決實(shí)驗(yàn)。
結(jié)論
綜上所述，我們的結(jié)果揭示了分子機(jī)制GAH影響骨發(fā)育和修復(fù)的機(jī)制通過(guò)靶向BMP通路，它在下游起作用受體水平。這種工作不僅提供了強(qiáng)大的自然篩選的研究基礎(chǔ)和工作流程使用斑馬魚(yú)進(jìn)行骨質(zhì)疏松藥物和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)模型也建立了發(fā)展的潛力GAH作為一種治療骨質(zhì)疏松的新藥。
基金：這項(xiàng)工作是由國(guó)家自然科學(xué)基金的資助(撥款編號(hào)31501174和81903665)福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(授權(quán)號(hào):2019J01602,2019J01744,2020J1822，2020J01823和2020J011301)福建省科技項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào):2013Y0081)，福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目資助教育部(資助號(hào):JB06150)項(xiàng)目福建省教育廳資助編號(hào)JAT190357)，以及來(lái)自國(guó)家科學(xué)和科技部“十二五”科技支撐計(jì)劃(專(zhuān)項(xiàng))2012號(hào)bad36b0504)。
本文章原文：Peng W, Zhang W, Wu Q, Cai S, Jia T, Sun J, Lin Z, Alitongbieke G, Chen Y, Su Y, Lin J, Cai L, Sun Y, Pan Y, Xue Y. Agaricus bisporus-Derived Glucosamine Hydrochloride Facilitates Skeletal Injury Repair through Bmp Signaling in Zebrafish Osteoporosis Model. J Nat Prod. 2021 Apr 23;84(4):1294-1305. doi: 10.1021/acs.jnatprod.1c00002. Epub 2021 Feb 26. PMID: 33635072.
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