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雜志：Translational Psychiatry

影響因子：6.8（2022-2023）

年份：2020

通訊作者：Robert J. Bryson-Richardson

通訊作者單位：School of Biological Sciences, Faculty of Science, Monash University, Clayton,

Australia

摘要

前言

注意缺陷多動障礙(ADHD)是一種非常普遍的神經(jīng)發(fā)育障礙，影響了約5%的學齡兒童，并在30-60%的病例中持續(xù)到成年。腦容量的減少也常常與這種疾病有關。

據(jù)估計，遺傳因素占ADHD病因的約80%。基因組全關聯(lián)研究(GWAS)的薈萃分析發(fā)現(xiàn)了幾種可能與ADHD有關的DNA變異，包括rs2294123，它映射到帶電多泡體蛋白7 (CHMP7)。此外，最近的大規(guī)模GWAS表明，rs2294123處于顯著LD狀態(tài)，其中幾個snp顯示與ADHD有名義上的關聯(lián)(補充圖1，補充表1)。然而，缺乏對這些相關基因?qū)DHD發(fā)展貢獻的功能驗證。通過候選基因和GWAS方法檢測到的大多數(shù)變異都映射到基因組的非編碼區(qū)域?？紤]到非編碼區(qū)在基因表達中發(fā)揮的廣泛作用，將中性ADHD相關變異與致病/致病變異分離仍然是一個主要挑戰(zhàn)。

為了解決這個問題，Tong等人開發(fā)了一個芯片管道，優(yōu)先考慮與ADHD相關的一組非編碼單核苷酸多態(tài)性(snp)，用于功能分析。他們發(fā)現(xiàn)了一個SNP (rs2294123, G→T)，映射到CHMP7的5個UTR，這與ADHD顯著相關。風險等位基因(T)的純合子與ADHD個體較低的神經(jīng)認知功能、較高的ADHD癥狀特征以及與純合子G個體相比，CHMP7轉(zhuǎn)錄水平降低33%顯著相關。這些發(fā)現(xiàn)表明，CHMP7表達的減少有助于ADHD表型，值得進一步研究。

CHMP7在內(nèi)體分選、核膜形成中起重要作用，最近被認為與脊髓和球性肌萎縮有關。它與運輸所需的內(nèi)體分選復合體(ESCRT)家族成員ESCRT-III相互作用。幾個CHMP家族成員是ESCRT-III的一部分，與神經(jīng)發(fā)育過程有關，并且已知有助于神經(jīng)精神疾病的發(fā)展。這支持了進一步研究CHMP7在ADHD中的作用的必要性。

為了研究CHMP7與ADHD的功能相關性，我們使用CRISPR-Cas9基因組編輯技術生成了一個chmp7斑馬魚突變系，并假設chmp7雜合(chmp7+/-)動物會模仿與ADHD相關SNP (rs2294123)相關的轉(zhuǎn)錄本減少。我們證明chmp7+/-魚比野生型(chmp7+/+)更活躍，并且總腦容量減少，類似于ADHD病例的報道。此外，我們還表明，通過應用通常用于治療多動癥的哌醋甲酯，可以顯著降低chmp7+/-魚的多動癥。總的來說，我們已經(jīng)提供了實驗驗證CHMP7作為ADHD的危險因素。

材料和方法

根據(jù)MARP/2015/004/BC繁殖群體許可證，魚在莫納什大學魚核心設施中飼養(yǎng)。創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因品系獲得生物科學學院動物倫理委員會(BSCI/2015/07)批準。實驗以野生型(t<s:1> bingen, TU)胚為背景進行。

chmp7突變系的產(chǎn)生及基因分型：

為了創(chuàng)建chmp7突變斑馬魚系，根據(jù)Gagnon等人的研究，生成了靶向chmp7 (ENSDARG00000041362)外顯子2的引導RNA。將單細胞期胚胎注射含有150 ng/μL引導RNA、5μg/μL Cas9蛋白(PNA Bio, Newbury Park, CA, USA)、20μM STOP cassette、0.25μL Phenol Red、0.25μL Cascade Blue (Molecular Probes, Waltham, MA, USA)和超純H2O的混合物，最終體積為2.5μL。選擇胚胎進行Cascade Blue，表明注射成功，在24 hpf下飼養(yǎng)至成年。通過與TU魚的異交鑒定F0個建立者，收集15~20個后代的DNA，并將匯集的DNA作為靶位點周圍區(qū)域PCR擴增的模板。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對異二聚體進行可視化分析。將創(chuàng)始人與野生型魚進行異交，并利用PCR和凝膠電泳技術篩選F1個體是否存在突變。使用Sanger測序確定突變。實驗采用F3及其后代。引導rna和引物序列見補充表2。采用等位基因特異性KASP熒光法(LGC Biosearch Technologies, Teddington, Middlesex, UK)進行基因分型。

整胚原位雜交：

為了生成檢測chmp7表達的探針，使用引物從基因組DNA中擴增出chmp7片段(補充表2)，并將其克隆到pGEM-T Easy (Promega,Madison,WI,USA)中。使用chmp7和M13引物組合通過PCR確定序列方向(補充表2)。使用chmp7原位模板反向和pGEM-T Easy M13正向引物從質(zhì)粒中擴增探針模板，并使用前面描述的T7 RNA聚合酶生成雙氧合核糖探針。按照Ruparelia等人的方法進行全載原位雜交。

PT-PCR：

RT-PCR檢測chmp7何時表達。cDNA合成是在野生型胚胎的8和16體期(1、1.5、2、3、4和5 dpf)提取的RNA上進行的。使用制造商(Sigma,St.Louis,MO,USA)描述的TRIzol?試劑分離總RNA，并用DNAse(Promega)處理以去除可能的DNA污染。使用Superscript III第一鏈合成試劑盒(Invitrogen, Waltham, MA, USA)逆轉(zhuǎn)錄1μg總RNA。RT-PCR引物見補充表2。PCR周期為:96°C初始變性周期2 min, 96°C、57°C、72°C 30個周期，各30 s;最后在72°C下延長5分鐘。25μL PCR產(chǎn)物在1% Tris-acetate-EDTA瓊脂糖凝膠上進行可視化。

qPT-PCR：

采用qRT-PCR比較不同基因型間chmp7 mRNA的表達水平。在6 dpf時從chmp7+/+、chmp7+/-和chmp7?/?胚胎中提取RNA，并在每個生物重復中與每個基因型的固定數(shù)量的魚(20-25)混合。cDNA的制備方法如上所述。采用Lightcycler 480 (Roche, Basel, Switzerland)和SYBR Green混合試劑(Roche)進行qRT-PCR。以肌動蛋白(actin)、β 1 (actb1)、18s核糖體RNA (18SrRNA)和真核翻譯延伸因子1α1 (eef1α1)的平均表達值為參考。引物見補充表2。每個生物重復進行3次技術重復。使用廣義混合線性模型來檢查mRNA水平的差異。基因型檢驗為固定效應，生物復制檢驗為隨機效應。使用Satterthwaite估計自由度進行F檢驗。

24小時運動試驗:6 dpf：

斑馬魚的活動水平在6 dpf時使用運動試驗來檢查幼蟲階段表現(xiàn)出自主運動的活動，同時仍然使用高通量行為試驗。在09:00-10:00之間收集胚胎，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)14小時(09:00-23:00,300勒克斯±20勒克斯)和10小時(23:00-09:00，全黑暗)循環(huán)，直到6 dpf。第5、6天09:00 ~ 10:00飼喂?jié)饪s草履蟲0.5 ml, 14:00~16:00每日更換培養(yǎng)基。第6天14:00-16:00，將幼蟲轉(zhuǎn)移到24孔板上，每孔含有1.5 ml E3胚培養(yǎng)基(5 mm NaCl,0.17 mm KCl,0.33 mm CaCl,0.33 mm MgSO4)，以適應環(huán)境。在第6天22:30至22:50之間，將板轉(zhuǎn)移到Zebraboxes (Viewpoint,Lyon,France)。22:50關閉斑馬箱，讓魚適應黑暗10分鐘，23:00開始錄像。實驗在全黑暗條件下進行24小時30分鐘，之后處死胚胎并進行基因分型。

24小時運動試驗:6 dpf時給藥：

為了檢驗哌醋甲酯的作用，如上所述進行了運動試驗。然而，在第6天22:00時，將150μL的dH2O(對照)或100μM的鹽酸三甲基哌醋酯(Tocris Bioscience, Bristol，英國)添加到含有1.35 ml E3培養(yǎng)基和魚的孔中，得到每個孔1.5 ml和10μM哌醋酯的最終體積，如Lange等人所述。升高的蓋子用于防止蒸發(fā)，任何顯示冷凝的孔都從分析中移除。在每個實驗中，哌醋甲酯和載體隨機分布在整個培養(yǎng)皿中，研究者對第三方治療不知情。在初始混合模型試驗后去除盲板。

24小時運動試驗:受精后6周和12周：

運動測定法用于檢測幼魚和成魚的活動水平。用50 mM NaOH和1 M Tris-HCl (pH 7.5)從魚鰭剪片中提取DNA，在3 dpf處進行基因分型，然后進行基因分型。飼養(yǎng)周期為白天12 h，夜間12 h(分別為08:00-20:00和20:00-08:00)。在第41天和第83天的12:00-14:00之間，將魚轉(zhuǎn)移到單獨的水箱中適應環(huán)境。在第41天和第83天的19:00到19:50之間，坦克被轉(zhuǎn)移到Zebracubes (Viewpoint，每個系統(tǒng)9輛坦克)。19:50關閉斑馬燈，讓魚適應黑暗10分鐘，20:00開始跟蹤?；蛐偷奈恢秒S機化，研究者對基因型不知情。視頻跟蹤在完全黑暗的情況下運行24小時30分鐘，之后將魚放回魚缸。

視頻分析：

使用Ethovision (Noldus, version 14, Wageningen, Netherlands)分析視頻。閾值為:移動，1毫米/秒;停止，0.75 mm/秒;檢測閾值，動態(tài)減法，深色，9。使用體素平滑去除6 dpf分析中的誤差，排除了每幀<0.04 mm和> 12 mm的運動。

運動試驗統(tǒng)計分析：

使用Microsoft Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA)處理數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 26 (IBM, Armonk, NY, USA)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)按時間順序按10分鐘的順序排列。不包括長度小于300秒的視頻的結(jié)尾時間點。每條魚的活動數(shù)據(jù)按小時匯總。通過將每條魚每小時的活動與來自各自重復的所有魚每小時的平均活動值進行比較，確定每條魚每小時的標準化值。然后將基因型分配給單個魚，并將基因型不明確的魚從分析中刪除。排除最初24小時后30分鐘的數(shù)據(jù)點。使用GraphPad Prism Version 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)中的線形圖對數(shù)據(jù)進行可視化。

為了檢查活動的差異，使用了混合線性模型。在6、42和84個dpf運動實驗中，使用了時間和基因型的主要效應，以及時間與基因型的交互效應。時間(h)的重復測量使用一階自回歸方差結(jié)構(gòu)對6 dpf試驗進行建模，對42 dpf和84 dpf試驗使用對角方差結(jié)構(gòu)。采用斑馬箱跟蹤系統(tǒng)的隨機效應，以及按基因型分組的個體動物。對歸一化數(shù)據(jù)應用自然對數(shù)變換，以滿足通過殘差檢查來檢查的正態(tài)性假設。使用最大似然模型進行F檢驗，使用Satterthwaite估計自由度。藥物治療試驗采用時間、治療和基因型的主要效應，以及時間、基因型和治療的相互作用效應。所有時間點的兩兩比較均為雙尾比較，采用Bonferroni校正進行多重比較。

共聚焦顯微鏡實時成像：

將chmp7+/-魚與綠色熒光蛋白(GFP)標記的HuC報告基因(HuC:eGFP)轉(zhuǎn)基因(Tg)系雜交，飼養(yǎng)至成年。Tg (HuC: eGFP);將chmp7+/-魚與chmp7+/-魚雜交，胚胎在含有200μM N-苯硫脲(PTU, Sigma)的E3中培養(yǎng)6 h以抑制黑素細胞的形成，每48 h更換一次培養(yǎng)基。胚胎在2 dpf下進行熒光分選。在3 dpf時，用0.0016%的三卡因甲磺酸(Sigma)在E3中麻醉魚，剪斷魚尾，提取DNA，按基因型對魚進行分類。為了檢查幼蟲期的腦容量，與運動試驗一致，在6 dpf時，胚胎再次麻醉，并將其置于含三卡因的E3中1%低熔點瓊脂糖中，置于0.8 mm氟化乙丙烯(FEP)管中(Bola, gr<s:1>斯菲爾德，德國)?；蛐碗S機化，研究者對基因型不知情。使用Thorlabs共聚焦顯微鏡(Newton, NJ, USA)， Olympus 20倍水浸1.0 NA物鏡(Tokyo, Japan)，針孔25μm, 2.005μm/pixel，步長= 1μm，平均16幀。

大腦圖像配準和分析：

使用Advanced Normalization Tools (ANTs)配準軟件(3.0.0.0)實現(xiàn)了實時共聚焦堆棧的圖像配準，該軟件運行在莫納什大學的MASSIVE計算集群上。使用Gupta等人描述的cobraZ腦容量分析軟件分析配準圖像。除了總體積外，還使用廣義混合線性模型檢查了與已知ADHD個體中具有體積差異的人類大腦區(qū)域(端腦(pallium, pallium下，前連合)，丘腦和丘腦腹側(cè))相似的腦區(qū)域?；蛐蜋z測為固定效應，生物復制檢測為隨機效應。采用Satterthwaite估計自由度進行F檢驗。多次比較的Bonferroni校正應用于每個測試。

chmp7在整個發(fā)育早期都有表達

斑馬魚擁有人類CHMP家族基因所有成員的同源基因(補充圖2，補充表3)。更重要的是，斑馬魚的Chmp7蛋白與人類的序列同源性為51%，相似性為70%。為了確定chmp7在斑馬魚中的表達位置和時間，對野生型胚胎進行了原位雜交和RT-PCR。我們觀察到，chmp7在受精后1天(dpf)在胚胎中普遍表達，在大腦中表達水平較高，到2 dpf時更局限于頭部。在6 dpf時，僅在頭部和腎臟可見(圖1A)。RT-PCR顯示，chmp7在8-somite階段表達到至少5dpf(圖1B)。

chmp7雜合子mRNA水平降低

在確認在斑馬魚早期發(fā)育過程中可以檢測到chmp7表達后，使用CRISPR-Cas9基因組編輯對該基因進行突變，導致外顯子2缺失7bp (補充圖3A)。這導致增加了20個氨基酸，并在第142個氨基酸后面添加了一個終止密碼子(補充圖3B)。預計這將去除蔗糖非發(fā)酵蛋白7 (Snf7)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是CHMP7的主要催化結(jié)構(gòu)域，負責與CHMP4B和ESCRT-III相互作用。

據(jù)預測，這種突變會觸發(fā)無義介導的衰變和蛋白質(zhì)的損失，而不是產(chǎn)生截斷的異構(gòu)體。為了確定chmp7+/-魚是否減少了chmp7 mRNA，從而模仿ADHD相關SNP的ADHD風險等位基因(T)純合個體的減少，對來自chmp7+/+， chmp7+/-和chmp7?/? 6dpf魚的cDNA進行了定量實時PCR (qRT-PCR)?；旌暇€性模型顯示mRNA水平顯著降低(F=71.41 (2,4)， p=0.001，圖2)，與chmp7+/+相比，chmp7+/-魚的chmp7 mRNA總量為53% (t=-5.13 (4)， p=0.007)，支持使用chmp7+/-魚作為與rs2294123純合子ADHD風險等位基因相關的CHMP7 mRNA水平降低模型(T)。

圖2 chmp7+/+、chmp7+/-和chmp7?/?胚胎的qRT-PCR。混合線性模型顯示基因型之間存在顯著差異(p = 0.001)。數(shù)據(jù)來自三個生物重復，并歸一化為chmp7+/+值。中線=平均值，誤差柱=平均值的±標準誤差(SEM)。

chmp7雜合幼蟲表現(xiàn)出多動表型

鑒于chmp7+/-魚具有與CHMP7 ADHD風險等位基因純合的個體相似的chmp7 mRNA水平降低，我們研究了chmp7 mRNA水平降低是否會導致胚胎(6 dpf)、幼年(42 dpf)和成年(84 dpf)階段的多動表型。

chmp7+/+ (n=153)和chmp7+/-(n=131)在6 dpf時的斑馬魚活性被跟蹤了24小時，從受精后14小時(hpf)的第6天開始(圖3)?；旌暇€性建模分析顯示了基因型的顯著主要影響(F=4.70 (1,287.06)， p=0.031)?；蛐团c時間無交互作用(F=0.77 (23, 3543.20)， p=0.78)。這表明，在24小時內(nèi)，chmp7+/-魚始終比chmp7+/+魚更活躍。

為了確定過度活躍的表型是否持續(xù)到幼魚和成魚階段，研究人員在24小時內(nèi)跟蹤了chmp7+/+和chmp7+/-魚的活性，從幼魚41天11hpf開始，到成魚83天11hpf開始。在整個實驗期間，幼魚(chmp7+/+， n = 41, chmp7+/-，n=50, F=0.29 (1,61.52)， p=0.59，補充圖4A)或成魚(chmp7+/+，n=30, chmp7+/-，n=36, F=0.008 (1,60.55)，p=0.93，補充圖4B)的基因型之間沒有顯著差異，這表明過度活躍的表型不會持續(xù)到幼蟲期。

圖3 chmp7+/+ (n=153)和chmp7+/-(n=131)斑馬魚6 dpf胚胎24小時內(nèi)的活性分析。y軸顯示的是每個基因型每小時移動的平均時間，單位是秒。數(shù)據(jù)來自三個生物復制。誤差條=±SEM。

chmp7雜合子的腦容量明顯更小

鑒于一貫報道的ADHD個體腦容量減少，在泛神經(jīng)元熒光Tg(HuC:eGFP)背景下，使用共聚焦顯微鏡在6 dpf下對chmp7+/+ (n=12)和chmp7+/-(n=12)斑馬魚頭部進行活體成像(圖4A)。我們觀察到，與chmp7+/+魚相比，chmp7+/-魚的總腦容量減少了9.2% (F=11.49 (1,20)，p=0.018，單尾，圖4B)。然而，我們沒有觀察到在特定選定的大腦區(qū)域有顯著差異(補充表4)。

圖4 chmp7雜合子在6 dpf時總腦容量減小。(A)Tg(HuC:eGFP)、chmp7+/+ (n=12)和Tg(HuC:eGFP)、chmp7+/-(n=12) 6 dpf魚的全腦最大強度投影。(B)與chmp7+/+魚相比，chmp7+/+魚的總腦容量顯著減少。數(shù)據(jù)來自三個生物復制。中線=平均值，誤差柱=±SEM。

哌醋甲酯可顯著降低chmp7雜合子的過動性

為了確定哌醋甲酯是否可以改善chmp7+/-魚的過度活躍，我們對chmp7+/++ dH2O (n=179)、chmp7+/-+ dH2O (n=160)、chmp7+/++10μM哌醋甲酯(n=171)、chmp7+/-+10μM哌醋甲酯(n=166)斑馬魚進行了為期24小時的追蹤，從第6天開始，14 hpf。與chmp7+/-+dH2O魚相比，chmp7+/++dH2O魚在10小時夜間表現(xiàn)出過度活躍(圖5)。然而，chmp7+/-+哌醋甲酯魚的這種影響減弱。混合線性模型顯示基因型、藥物治療和時間之間存在顯著的相互作用(F=1.60 (69, 8038.37)，p=0.001)。鑒于基因型和治療隨時間的顯著相互作用，我們調(diào)查了不同時間組間的差異。

與chmp7+/++ dH2O的魚相比，chmp7+/++ dH2O的魚在夜間大部分時間表現(xiàn)出顯著的多動癥(第3小時，p=0.002;第4小時，p=0.007;第5小時，p=0.013;第6小時，p=0.020;第7小時，p=0.025;第8小時，p=0.014)。施用哌甲酯逐漸降低chmp7+/-+哌甲酯魚的活性，直至顯著低于chmp7+/-+ dH2O魚(第8小時，p=0.045)。此外，chmp7+/-+哌甲酯魚與chmp7+/++ dH2O魚在夜間大部分時間無顯著差異。這表明，施用哌甲酯足以顯著減少chmp7+/-魚的過度活躍，其水平與野生型相當。

圖5 chmp7+/+和chmp7+/-斑馬魚6 dpf胚胎在10μM鹽酸甲酯(MpH)或dH2O處理下24小時的活性分析。Y軸顯示的是每個基因型每小時移動的平均時間，單位是秒。數(shù)據(jù)來自六個生物復制。誤差條=±SEM。

討論

斑馬魚正在成為一種有前途的神經(jīng)精神疾病模型。我們在這里首次展示了斑馬魚模型的實用性和多功能性，通過分析游泳活動和腦容量作為ADHD的表型來驗證ADHD遺傳關聯(lián)。在6條dpf chmp7+/-魚中觀察到的多動癥并沒有持續(xù)到成年，這證明了斑馬魚用于測試ADHD表型的時間進展。斑馬魚也可以用來檢查ADHD患者通常觀察到的腦容量變化，為ADHD相關性提供解剖學證據(jù)。最后，對哌醋甲酯的反應表明多巴胺(或去甲腎上腺素)信號的失調(diào)可能導致觀察到的多動癥。此外，考慮到哌甲酯的有效性在ADHD個體之間存在差異，使用斑馬魚來測試ADHD相關基因模型對藥物的反應可能有助于了解藥物反應的變異性。

chmp7+/-魚過度活躍的分子機制需要進一步研究。考慮到chmp7+/-魚對哌甲酯治療的陽性反應，這提示多巴胺或去甲腎上腺素信號異常。雖然我們在chmp7+/-魚中看到的表型可能與其他神經(jīng)遞質(zhì)途徑有關，但異常的多巴胺能信號傳導，尤其是多巴胺能信號傳導，一再與多動癥相關。因此，研究CHMP7在多巴胺信號傳導中的作用需要進一步的研究。此外，在ESCRT-III蛋白的敲低、功能喪失和顯性負突變中可以看到神經(jīng)元修剪缺陷。鑒于CHMP7與ESCRT-III蛋白已知的相互作用，當CHMP7 mRNA水平降低時，神經(jīng)元修剪也可能被破壞。因此，chmp7+/-魚的過度活躍表型可能是由于缺乏有效的神經(jīng)修剪，導致神經(jīng)網(wǎng)絡成熟延遲，神經(jīng)網(wǎng)絡對沖動控制或運動控制/協(xié)調(diào)至關重要。這與多動癥患者的神經(jīng)發(fā)育遲緩是一致的。

圖3和圖5所示的實驗表明，與chmp7+/+相比，chmp7+/-的魚明顯過度活躍。然而，在哌甲酯實驗中，chmp7+/-+ dH2O對照組基本上重復了之前的活性實驗，多動癥僅限于夜間。這可能表明chmp7 mRNA的減少對睡眠模式而不是清醒時的認知有更強、更一致的影響。這與多動癥患者經(jīng)常出現(xiàn)的睡眠障礙，以及受試者之間和體內(nèi)晝夜節(jié)律的可變性是一致的。此外，在果蠅中，多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白或嗜乳蛋白的泛神經(jīng)元敲低中觀察到夜間過度活躍，這被認為是多巴胺信號失調(diào)的特征。這強調(diào)了多巴胺失衡可能導致了chmp7+/-魚中觀察到的多動表型。這與應用甲基苯乙烯對表型的改善是一致的(圖5)。

結(jié)語

這項研究是同類研究中首次使用動物模型對CHMP7作為ADHD風險基因進行功能檢測。這也是通過GWAS鑒定的ADHD相關基因首次在斑馬魚中進行功能驗證。我們在這里證明了chmp7+/-魚是CHMP7 ADHD相關等位基因的合適模型，并且chmp7 mRNA水平的降低與多動癥表型和腦容量減少有關。此外，這種多動癥可以通過哌甲酯治療得到緩解，這有助于我們了解藥物反應性變異的特定ADHD危險因素。更廣泛地說，我們提倡使用斑馬魚來模擬最近從大規(guī)模GWAS中出現(xiàn)的大量ADHD候選基因。