雜志：Molecular Psychiatry
影響因子：11（2022）
年份：2012
通訊作者：L Bally-Cuif博士或W Norton博士
摘要
背景：注意力缺陷/多動(dòng)障礙(ADHD)是一種以注意力不集中、多動(dòng)、沖動(dòng)增加和情緒失調(diào)為特征的神經(jīng)發(fā)育障礙。連鎖分析和精細(xì)定位確定了嗜乳蛋白3(LPHN3)基因編碼的變異，這是一種假定的粘附-g蛋白偶聯(lián)受體，是ADHD的危險(xiǎn)因素。
方法：為了驗(yàn)證LPHN3與ADHD之間的聯(lián)系，并了解LPHN3在該疾病的病因?qū)W中的功能，我們?cè)诎唏R魚發(fā)育過程中檢測了其同源基因lphn3.1。
結(jié)果：lphn3.1功能的喪失會(huì)導(dǎo)致腹側(cè)間腦多巴胺陽性神經(jīng)元的減少和錯(cuò)位，并導(dǎo)致過度活躍/沖動(dòng)運(yùn)動(dòng)表型。行為表型可以通過ADHD治療藥物哌甲酯和阿托西汀來挽救。
結(jié)論：綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，Lphn3活性的降低與引發(fā)adhd樣行為有關(guān)，并證明了其對(duì)大腦多巴胺能回路發(fā)育的相關(guān)貢獻(xiàn)。
關(guān)鍵詞：ADHD;多巴胺;多動(dòng);沖動(dòng);Lphn3;斑馬魚
前言
注意缺陷/多動(dòng)障礙(ADHD;人類沒有。143465)臨床異質(zhì)性神經(jīng)發(fā)育障礙是以注意力不集中、多動(dòng)和沖動(dòng)增加/情緒化為特征。多動(dòng)癥代表了最常見的行為兒童和青少年障礙，患病率為3-5%在不同的文化背景下。雖然實(shí)質(zhì)性ADHD的遺傳性在許多家庭、雙胞胎和雙胞胎中都有記載收養(yǎng)研究，估計(jì)高達(dá)80%，都是全基因組的。到目前為止，方法和候選基因研究都無法可靠地進(jìn)行識(shí)別和描述adhd相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因。
藥理學(xué)研究和動(dòng)物模型的見解一致地暗示了ADHD的神經(jīng)生物學(xué)中神經(jīng)傳遞的改變。與多巴胺能(DA)和NA系統(tǒng)相互作用的興奮劑(例如，哌甲酯(MPH))和去甲腎上腺素(NA)再攝取抑制劑(例如，托莫西汀(ATO)治療ADHD的有效性，以及抗抑郁藥(針對(duì)5-HT系統(tǒng))調(diào)節(jié)ADHD相關(guān)情緒失調(diào)的能力已將研究重點(diǎn)放在單胺能信號(hào)傳導(dǎo)上。遺傳關(guān)聯(lián)研究也支持DA在ADHD病因?qū)W中的關(guān)鍵作用。然而，神經(jīng)發(fā)育過程中導(dǎo)致ADHD癥狀的變化尚不清楚。
最近，Arcos-Burgos等人通過對(duì)南美遺傳分離物的連鎖掃描和隨后在幾個(gè)北美和歐洲人群中對(duì)4q13.2位點(diǎn)的精細(xì)定位，報(bào)道了嗜乳蛋白3(LPHN3)基因編碼中存在風(fēng)險(xiǎn)單倍型的證據(jù)。在西班牙成人ADHD患者隊(duì)列中的重復(fù)研究表明，LPHN3在該疾病終生持續(xù)中發(fā)揮了作用。此外，LPHN3也被確定為86個(gè)物質(zhì)使用障礙患者的風(fēng)險(xiǎn)基因之一，物質(zhì)使用障礙是ADHD的常見合并癥。LPHN3是一種假定的粘附-g蛋白偶聯(lián)受體，但其生理作用尚不清楚，內(nèi)源性配體尚未確定。近年來，斑馬魚已被確立為一種有效的動(dòng)物模型，用于探索行為的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)。在這項(xiàng)研究中，我們使用斑馬魚幼蟲來評(píng)估LPHN3的斑馬魚同源物之一Lphn3.1活性的發(fā)育和行為功能。我們發(fā)現(xiàn)，Lphn3.1活性的降低選擇性地影響DA系統(tǒng)的發(fā)育，并引發(fā)多動(dòng)/沖動(dòng)運(yùn)動(dòng)。這種行為表型可以通過MPH和ATO這兩種有效治療ADHD的藥物來挽救。這些結(jié)果明確暗示LPHN3是ADHD運(yùn)動(dòng)表型的因素之一，并強(qiáng)調(diào)了其在DA神經(jīng)元發(fā)育中的關(guān)鍵作用。
I原位雜交和組織化學(xué)方法
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)θN裝(全胚胎或解剖腦)和成人腦切片進(jìn)行原位雜交和抗體標(biāo)記。
嗎啉代注射
Lphn3剪接形態(tài)學(xué)寡核苷酸(MO)購自GeneTools LLC。Lphn3-MO1用于結(jié)合外顯子2的剪接給體位點(diǎn)，而Lphn3-mo2則阻斷外顯子6/內(nèi)含子6邊界的剪接(Supplementary Figure S4H)。對(duì)照MO(Lphn3-CO)也有5 bp錯(cuò)配。胚胎在單細(xì)胞期注射250 mM MO(5.9ng)，并在281C的正常晝夜周期中恢復(fù)6天，然后分析行為(見下文)。為了確認(rèn)MO注射后的剪接缺陷，將20個(gè)胚胎快速冷凍在液氮中，并使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)提取RNA。然后，我們使用RT-PCR(使用Superscriptase II試劑盒，Invitrogen)來觀察變形體中l(wèi)phn3.1剪接的異常，并使用實(shí)時(shí)PCR(見補(bǔ)充方法)來定量lphn3.1轉(zhuǎn)錄本。MOs和引物序列見補(bǔ)充方法。
Lphn3型幼蟲運(yùn)動(dòng)行為分析
在受精后6天(dpf)，通過記錄5分鐘內(nèi)游泳的總距離來檢查運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，使用斑馬實(shí)驗(yàn)室軟件(Videotrack;生命科學(xué)，里昂，法國)。將注射后的幼蟲置于斑馬箱(ViewPoint生命科學(xué)公司)內(nèi)12孔板(BD)的不同孔中，讓其適應(yīng)5分鐘后進(jìn)行記錄。采用高速紅外攝像機(jī)，斑馬實(shí)驗(yàn)室軟件設(shè)置檢測閾值為11，不活動(dòng)/小閾值為5，小/大閾值為10，跟蹤幼蟲5 min，計(jì)算游動(dòng)距離。為了比較運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，計(jì)算對(duì)照和變形幼蟲的平均總游動(dòng)距離。對(duì)于夜間測量，將白天已經(jīng)測量過的動(dòng)物留在12孔板中，在斑馬箱關(guān)閉燈后記錄5分鐘3小時(shí)。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel(微軟)中進(jìn)行分析。為了比較野生型和變型幼蟲之間的游動(dòng)距離，使用單因素方差分析計(jì)算p值，然后使用未合并SD的配對(duì)t檢驗(yàn)和根據(jù)HOLM調(diào)整的p值。所有數(shù)據(jù)采用Excel(微軟)和R Foundation統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。
藥物治療
所有藥物溶液于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制于胚胎培養(yǎng)基(含0.01%二甲亞砜)中。藥物治療前，分別給幼蟲注射Lphn3-CO或Lphn3-MO1，讓其恢復(fù)6 d。然后將變形幼蟲在藥物溶液(1、5、10、15或20 mM ATO(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，USA)或8、10、12、15或20 mM MPH(Sigma-Aldrich)中孵育1小時(shí)，或僅在0.01%二甲亞胺中孵育1小時(shí)。如上所述，記錄不同處理組在5分鐘時(shí)間內(nèi)的游動(dòng)距離。為了實(shí)時(shí)PCR分析MPH和ATO處理對(duì)lphn3.1表達(dá)水平的影響，在制備RNA前，將幼蟲用10 mM MPH或1 mM ATO處理1小時(shí)。為了觀察MPH或ATO處理對(duì)DA神經(jīng)元形成的影響，從第0天(受精后立即)，第3天或第6天(1小時(shí))分別用10 mM MPH或1 mM ATO處理幼蟲，然后在6 dpf固定。
HPLC分析
為了進(jìn)行HPLC分析，100只斑馬魚幼蟲分別在250μl含有10μM EDTA、抗壞血酸和代謝亞硫酸鈉的0.1 M乙酸中均勻化。樣品在-20°C保存直至分析。多巴胺(DA)及其代謝物3,4-二羥基苯基乙酸(DOPAC)在Agilent 1100HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies)上進(jìn)行測量，電化學(xué)檢測(型號(hào)1640;BioRad)按照之前描述的方法進(jìn)行。色譜柱為EC 250/4.6 NUCLEOSIL 100-3 C-18HPLC柱(Macherey-Nagel)，流動(dòng)相為0.65 mM辛烷磺酸、0.5mM三乙胺、0.1M EDTA和10%甲醇(均購自西格瑪)，pH 4.12，采用等壓洗脫(流量:0.8 ml/min)。柱溫設(shè)置為30℃，進(jìn)樣量為50μl。分析物的保留時(shí)間(min)為:DA 15.5, DOPAC 14.3。使用Chem Station for LC (Version: 2D, Rev. A.10.02;Agilent)使用峰值高度后手動(dòng)集成。通過對(duì)每種分析物([20/40/80ng/ml])注射三種不同濃度的物質(zhì)混合物獲得校準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)>0.999
實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)
從6日齡幼蟲中提取1μg RNA，合成cDNA，進(jìn)行qPCR定量PCR分析。幼蟲在單細(xì)胞期注射對(duì)照或lphn3.1特異性morpholinos，或在提取RNA前1小時(shí)注射1μg ATO或10μg MPH。使用Lightcycler進(jìn)行定量PCR，采用SYBR綠色檢測方案(Roche)。PCR條件為40個(gè)循環(huán)，95℃，15秒;60℃，10秒;72℃，20秒。在每種情況下，分析以三份重復(fù)進(jìn)行，在morpholino實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)基因型或治療使用2個(gè)生物重復(fù)，在藥物實(shí)驗(yàn)中使用3個(gè)生物樣本。所有結(jié)果分別歸一化到管家基因gapdh的表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示為使用2方法計(jì)算的相對(duì)表達(dá)水平(7)。p <值-ΔΔCT使用t檢驗(yàn)計(jì)算。
小鼠Lphn3感測RNA的制備
將小鼠Lphn3全長編碼區(qū)亞克隆到pCS2+的ECOR1位點(diǎn)上，利用mMessage mMachine SP6試劑盒(Ambion)制備sense capping RNA。在幼蟲單細(xì)胞期，共注射90ng/μl傳感RNA和250μM (5.9ng)的morpholino。讓幼蟲恢復(fù)6天，然后分析其行為。
原位雜交
使用兩個(gè)不同長度的原位探針檢測lphn3.1的表達(dá):一個(gè)長探針對(duì)應(yīng)于斑馬魚lphn3.1基因的全長(4578bp)，一個(gè)短探針識(shí)別lphn3.1的3 '部分(堿基對(duì)2078 - 4578)，長度為2500bp。lphn3.2的表達(dá)使用500bp探針進(jìn)行可視化，該探針檢測到外顯子5至外顯子8的編碼序列。對(duì)6月齡成年斑馬魚大腦100μm明膠/白蛋白包埋切片進(jìn)行成體腦原位雜交。使用徠卡振動(dòng)器對(duì)大腦進(jìn)行切片，并在自由浮動(dòng)切片上進(jìn)行原位切片。幼蟲原位方案之后，在搖晃的水浴中進(jìn)行雜交步驟。
原位雜交和組織化學(xué)方法
斑馬魚:將整個(gè)幼蟲在4%多聚甲醛(Sigma Aldrich)中固定過夜，然后部分解剖。將幼蟲孵育在以下一種一抗中(小鼠抗th, Chemicon MAB318稀釋1:1000;大鼠抗5ht, Chemicon MAB 352稀釋1:100)，在4oC下放置48小時(shí)。洗凈幼蟲，用二抗(馬抗小鼠生物素，Vector稀釋1:20 00;山羊抗大鼠生https://fanyi.youdao.com/download物素，Jackson稀釋1:500)在4℃下孵育過夜。進(jìn)一步?jīng)_洗后，在DAB溶液中顯影。所有照片均使用徠卡顯微鏡拍攝，圖像在Photoshop (Adobe)中組裝。鼠標(biāo):如前所述，對(duì)小鼠腦進(jìn)行原位雜交。簡單地說，在0.1 M新鮮制備的4%多聚甲醛冷PBS中固定5分鐘后，隨后在100%乙醇中儲(chǔ)存，16 μm小鼠腦低溫恒溫切片通過分級(jí)系列乙醇(100-70%)轉(zhuǎn)移到2xSSC(檸檬酸鈉鹽)中，并用0.02 N HCl處理5分鐘。用2xSSC洗滌后，用0.1 M三乙醇胺中0.25%的乙酸酐孵育20分鐘，再用2xSSC洗滌，并用雜交液(50%去離子化甲酰胺、4xSSC、1x Denhardt’s溶液、10%硫酸葡聚糖和250 μg/ml變性鮭魚精子DANN)覆蓋，60℃下孵育1小時(shí)。義和反義特異性地高辛(DIG)標(biāo)記的Lphn3 cRNA探針(cDNA核苷酸133-809，登錄號(hào)NM_198702;在pCRII雙啟動(dòng)子載體上)生成并在1%瓊脂糖凝膠上純化。切片與雜交緩沖液和dig標(biāo)記的反義(或正)Lphn3 cRNA(終濃度10-20 ng/μl)在60℃下孵育16-18 h。用2xSSC在室溫(RT)、50%甲酰胺在2xSSC中(60o℃)逐級(jí)洗滌，然后再用2xSSC (RT)洗滌。為了去除未雜交的單鏈rna，切片用40μg/ml核糖核酸酶A (RNase A)在500 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和1 mM EDTA溶液中處理，37℃下處理30分鐘。用不含RNase A的相同緩沖液在RT下多次洗滌后，在該緩沖液中60℃孵育30分鐘，并用TBS沖洗。cRNA探針采用羊抗dig堿性磷酸酶(aP)偶聯(lián)抗體(1.5 U/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和4-硝基藍(lán)-四氯化銨(NBT)作為aP底物(Roche, Mannheim, Germany)。
吖啶橙染色
根據(jù)對(duì)活胚胎進(jìn)行吖啶橙染色，測定細(xì)胞死亡水平。簡單地說，將24hpf或48hpf的活胚胎在2μg/ml吖啶橙(西格瑪奧爾德里奇)中孵育30分鐘，然后在胚胎培養(yǎng)基中沖洗幾次。胚胎麻醉于0.016%的三卡因(MS-222;西格瑪奧爾德里奇)和拍攝使用微縮顯微鏡(徠卡)。
魚類品系及處理
成年斑馬魚(Danio rerio)使用標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)魚方案并按照研究所動(dòng)物福利準(zhǔn)則進(jìn)行飼養(yǎng)。用于實(shí)驗(yàn)的胚胎來自AB/Ekwill品系的野生型魚的自然產(chǎn)卵，維持在14小時(shí)的光照/10小時(shí)的黑暗周期。胚胎按照進(jìn)行分期。
lphn3基因克隆及l(fā)phn3蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析
通過NCBI和Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(Suppl)的tblastn搜索(2)鑒定了親Latrophilin蛋白序列。表1)。由于我們無法通過這種方法鑒定完整的預(yù)測蛋白，我們手動(dòng)重建蛋白序列，然后進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。使用ClustalX軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)。在BioEdit (TomHall, Ibis Biosciences)中計(jì)算了斑馬魚Lphn3.1、斑馬魚Lphn3.2和人類LPHN3蛋白序列的保守性和一致性百分比。Lphn3.1和LPHN3的第一個(gè)內(nèi)含子不包括在守恒百分比的計(jì)算中，因?yàn)橄鄳?yīng)的Lphn3.2序列尚未在斑馬魚中被鑒定。僅使用在所有物種中可以明確識(shí)別和對(duì)齊的殘基(對(duì)應(yīng)于人類LPHN3蛋白的殘基90-391)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用PhyML構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育，設(shè)置如下:JTT替代模型;4個(gè)替代率類別;伽馬分布參數(shù)估計(jì);不變位點(diǎn)比例的估計(jì)(3)。分支支持度通過近似似然比檢驗(yàn)(aLRT, SH-like;(4))估計(jì)。
功能缺失分析，RT-PCR和qPCR驗(yàn)證
本研究使用的morpholinos序列及RT-PCR和qPCR引物分別為：Lphn3-MO1ATGTGAGTGTATCTCTGTACCTGAA3;Lphn3-MO2 GGTGTCATGTTTTTACTCACTCTTT;Control MO包含5個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(小寫)ATcTGAcTGTATgTCTcTACCTcAA。
RT-PCR引物：MO1Forward:GTCGAGAGCTGTCGTGTGAG,MO1Reverse1 ATTCGGCCATTGTTCTGTTC,MO1Reverse2AACTTGTCCCTGGTGTGTCC,MO2Forward cccctctctccaccaccactacca,MO2ReverseTCTGTGCTCTCCTGTATGGTG。
Lphn3.1 Exon1qPCRForwardGTGGTCCACACGCCTACTT,Lphn3.1 Exon 2qPCRReverse CAGCGAGTTCGATAGGATA,Lphn3.2Exon3qPCRForward CCCTGTCCTGGGACATACAA,Lphn3.2 Exon4qPCRReverseGGCCTGGAGAGGGTCTTTAC
I斑馬魚LPHN3同源物的分離與敲除
為了闡明LPHN3的內(nèi)源性功能，我們?cè)诎唏R魚中克隆并檢測了相應(yīng)的基因。我們對(duì)斑馬魚基因組進(jìn)行BLAST分析，鑒定出兩個(gè)與人類LPHN3相似的部分轉(zhuǎn)錄本，并通過對(duì)來自多個(gè)物種的親Latrophilin家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)了它們的身份(Supplementary Figure S1)。斑馬魚Lphn3.1與重復(fù)的Lphn3.2蛋白同源性為73.7%，相似度為86.2%。Lphn3.1與人類LPHN3的同源性為73.3%，相似度為85.7%；Lphn3.2與人類LPHN3的同源性為76.1%，相似度為89.3%。兩個(gè)LPHN3同源基因在發(fā)育過程中顯示出部分重疊的表達(dá)譜。在受精后24小時(shí)(hpf)，lphn3.1以一種與分化神經(jīng)元相似的模式廣泛表達(dá)(補(bǔ)充圖S2A,D)，例如那些被elavl3表達(dá)標(biāo)記的神經(jīng)元。這種模式在48 mph時(shí)保持(補(bǔ)充圖S2B,E)，而在受精后6天(dpf)，lphn3.1的表達(dá)變得更加受限，在端腦和間腦的腹側(cè)部分、后腦以及脊柱腹側(cè)區(qū)域有強(qiáng)表達(dá)(補(bǔ)充圖S2C,F)。在24 mph時(shí)，在間腦腹側(cè)可以看到lphn3.2的表達(dá)(補(bǔ)充圖S2J，M)，在48 hpf.時(shí)，它擴(kuò)展到也包括端腦和后腦(在表達(dá)條紋中，似乎與lphn3.1的表達(dá)互補(bǔ))，以及在視神經(jīng)頂葉和耳囊的邊緣(補(bǔ)充圖S2K,N)。到6 d.p.f.時(shí)，lphn3.2的表達(dá)與lphn3.1非常相似，并且在端腦、間腦和后腦的腹側(cè)部分可見(補(bǔ)充圖S2L，O).在30 h.p.f.時(shí)，lphn3.1在后結(jié)核(PT)區(qū)域與酪氨酸羥化酶(DA神經(jīng)元的標(biāo)記物)共表達(dá)(補(bǔ)充圖S2X)。為了評(píng)估Lphn3在物種間表達(dá)的保守性，我們比較了斑馬魚lphn3.1和小鼠成年腦中的Lphn3。lphn3.1的表達(dá)沿著遠(yuǎn)端腦中線，以及在遠(yuǎn)端腦實(shí)質(zhì)、丘腦前部、水包導(dǎo)管周圍灰質(zhì)、中縫上核、下丘腦下腦室周圍核、小腦和內(nèi)側(cè)縱束核中的較低水平表達(dá)(補(bǔ)充圖S3A—E)。這種廣泛的表達(dá)譜與lphn3.1的小鼠同源基因Lphn3相同(補(bǔ)充圖S3F—I)。在成年小鼠大腦中，Lphn3在皮層的所有層以及中縫核的背核和中央核、海馬和小腦中表達(dá)。
這種廣泛的發(fā)育表達(dá)對(duì)Lphn3的功能知之甚少。因此，我們選擇破壞具有最強(qiáng)胚胎表達(dá)的LPHN3同源物lphn3.1的功能。lphn3.1由19個(gè)外顯子組成(補(bǔ)充圖S4B)，編碼一種與人類LPHN3預(yù)測結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)(補(bǔ)充圖S4A)。我們?cè)诎l(fā)育過程中使用兩個(gè)剪接阻斷MO來敲低lphn3.1的活性。Lphn3-MO1靶向外顯子2/內(nèi)含子2邊界，Lphn3-MO2靶向外顯子6/內(nèi)含子6邊界，lphn3.1和lphn3.2序列差異顯著的區(qū)域(補(bǔ)充圖S4B,H)。注射這兩種MOs中的任何一種導(dǎo)致在2個(gè)d.p.f.胚胎中缺乏野生型lphn3.1轉(zhuǎn)錄本(補(bǔ)充圖S4D,E,G)。在后期(6 d.p.f.)，lphn3.1的表達(dá)恢復(fù)(補(bǔ)充圖S4F,G)。這表明在發(fā)育過程中注射多酚會(huì)導(dǎo)致Lphn3.1活性的短暫下調(diào)。與對(duì)照動(dòng)物相比，注射morpholino敲低lphn3.1并不會(huì)導(dǎo)致發(fā)育延遲（補(bǔ)充圖S4C)，也不會(huì)增加細(xì)胞凋亡(補(bǔ)充圖 S5A—D)。
圖S1 脊椎動(dòng)物L(fēng)PHN家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)斑馬魚Lphn3.1和Lphn3.2與人類LPHN3同源。使用ClustalX和PhyML軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。序列的加入編號(hào)如表1所示。斑馬魚的Lphn3.1和Lphn3.2與梅塔卡魚和河豚魚的LPHN3同源物密切相關(guān)。丹尼奧·雷里奧博士 Fr, 紅鰭東方鲀; Gg, 紅鳥; Hs, 現(xiàn)代人; Md, 短尾負(fù)鼠; Mm, 小鼠; Oa, 鴨嘴獸; Ol, 青鳉; Xt, 熱帶爪蟾。
表1 用于分子系統(tǒng)發(fā)育的序列列表。9個(gè)不同物種Latrophilin家族3個(gè)蛋白(LPHN1, LPHN2, LPHN3)的NCBI和/或Ensembl序列。
圖S2 斑馬魚lphn3.1和lphn3.2的胚胎和幼蟲表達(dá)。(a - c) lphn3.1在整個(gè)發(fā)育過程中以一種與分化神經(jīng)元相似的模式表達(dá)。與lphn3.1反義原位探針雜交的全頭(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)的背側(cè)圖(sense;a - c)。(D-F)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1反義原位探針雜交的側(cè)面圖(sense;D-F)。(G-I)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1感覺控制原位探針雜交的側(cè)位圖。感覺探針未見染色，說明lphn3.1標(biāo)記的特異性。(J-L) lphn3.2在整個(gè)發(fā)育過程中均在端腦腹側(cè)和間腦、視頂葉邊緣、耳囊和后腦表達(dá)。與lphn3.2反義原位探針雜交的全頭(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)的背側(cè)圖(sense;J-L)。(M-O)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1反義原位探針雜交的側(cè)面圖(sense;M-O)。(P-R)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1傳感控制原位探針雜交的側(cè)面圖。感覺探針未見染色，說明lphn3.1標(biāo)記的特異性。(S- u)使用短(2.5kb)原位反義探針顯示的lphn3.1在3dpf(全安裝頭)的側(cè)位(S)和背位(T)表達(dá)圖。(U)頂蓋水平3天幼蟲頭部切片，顯示lphn3.1廣泛的神經(jīng)表達(dá)。(V,W)下丘腦水平30dpf幼蟲腦切片，顯示lphn3.1在后結(jié)核中表達(dá)(V)， (W)和抗酪氨酸羥化酶抗體在同一區(qū)域標(biāo)記(W)。(X)圖V和圖W合并顯示lphn3.1和抗酪氨酸羥化酶抗體在PT中共表達(dá)?？s寫(圖A-C和V-X): e, eye;h,后腦;Hy,下丘腦;米,中腦;PT是后結(jié)節(jié)，t是端腦。
S3 斑馬魚lphn3.1和小鼠Lphn3的成體表達(dá)。(A-E)成年斑馬魚全腦冠狀切片上lphn3.1的表達(dá)。表達(dá)見于丘腦前核(A)、小腦體(CCe)、內(nèi)側(cè)縱束核(MLF)、腦端腦室層以上細(xì)胞(PC)、腦室周圍灰色區(qū)(PGZ)、前視前區(qū)(PPa)、腦室周圍核(PVN)和腦室上核(SR)。(F-I) Lphn3在成年小鼠腦中的表達(dá)。高倍冠狀面顯示Nissl染色(F,H,G,I)和Lphn3在皮層(F-F”)、中縫背外側(cè)核(G-G”)、海馬(H-H”)和小腦(I-I”)中的表達(dá)(F '，F(xiàn) "，G '，G "，H '，H "，I '，I ")。鼠標(biāo)部分的縮寫:溝槽區(qū)(Aq)、海馬區(qū)1-3區(qū)(CA1-3)、皮層層(CO)、中央核(CS)、齒狀回(DG)、中縫背側(cè)分裂(DRD)、中縫背下分裂(DRI)、小腦顆粒層(GL)、齒狀回顆粒層(gr)、小腦分子層(ML)、齒狀回分子層(MO)、浦肯野細(xì)胞層(PCL)、齒狀回多態(tài)層(PO)、白質(zhì)(WM)。
圖S4 Morpholino注射導(dǎo)致lphn3.1下調(diào)。(A) Lphn3.1和Lphn3.2粘附- g蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)(包括一個(gè)由自催化GPS位點(diǎn)連接到七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的大細(xì)胞外區(qū)域)。使用SMART預(yù)測程序識(shí)別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并與預(yù)測的人類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相匹配。箭頭表示mo2產(chǎn)生的異常剪接lphn3.1及其對(duì)應(yīng)蛋白與野生型序列的偏離位置?？s寫:GPS, G蛋白偶聯(lián)蛋白水解位點(diǎn);Horm R，激素結(jié)合域;LB，凝集素結(jié)合域;Olfactomedin-like domain。(B) lphn3.1的基因組組織。外顯子(E)以黑盒子表示，內(nèi)含子以實(shí)線表示。我們使用計(jì)算機(jī)搜索和RT-PCR證實(shí)了在斑馬魚基因組的當(dāng)前版本(http://www.ensembl.org, Zv9)中沒有預(yù)測到的額外的lphn3.1 5 '外顯子(E1)的存在，并且包含ATG起始密碼子。morpholino 1 (MO1)和morpholino 2 (MO2)在外顯子/內(nèi)含子邊界的位置分別用紅色和綠色表示。藍(lán)色箭頭表示用于通過RT-PCR驗(yàn)證morpholino功能缺失的引物的位置(對(duì)于MO1，使用了兩個(gè)嵌套的反向引物，如圖B所示)。(C) 6dpf時(shí)觀察到的野生型、注射Lphn3-CO-和lphn3 -MO1的魚的背側(cè)視圖。注射未引起死亡率增加，6dpf時(shí)幼蟲形態(tài)正常。在Lphn3-MO2突變體中也觀察到同樣的情況(未顯示)。(D-F)不同魚類種群(WT, Lphn3-CO-， Lphn3-MO1-和lphn3 - mo2注射)在2dpf (D,E)和6dpf (F)的RT-PCR分析。在Lphn3-MO1突變體中，無法檢測到lphn3.1轉(zhuǎn)錄物，可能是由于2dpf (D)的畸變轉(zhuǎn)錄物的非義介導(dǎo)衰變。注射Lphn3-MO2導(dǎo)致lphn3.1剪接異常，并出現(xiàn)3個(gè)異常PCR產(chǎn)物(E)。序列分析表明，這些PCR產(chǎn)物編碼的突變體lphn3.1蛋白在529位偏離野生型序列(圖s4a中箭頭所示，與MO2的位置對(duì)應(yīng))。黑色箭頭表示預(yù)測的正常lphn3.1波段。(G) Real-time PCR分析lphn3.1在注射Lphn3-CO-和lphn3 - mo1的斑馬魚中48hpf和6dpf的表達(dá)情況。相對(duì)于gapdh的表達(dá)比采用2-ΔΔCT法計(jì)算，然后進(jìn)行t檢驗(yàn)。(H)描繪lphn3.1而非lphn3.2的MO1和MO2序列特異性的卡通。Morpholino序列用紅色表示，lphn3.2中匹配的堿基對(duì)用粗體突出顯示。
圖S5 lphn3.1特異性morpholino注射液不增加細(xì)胞凋亡。(A-D)吖啶橙染色顯示，注射Lphn3-MO1在24h (A,B)和48h (C,D)均未引起細(xì)胞凋亡增加。
Lphn3功能下調(diào)可引發(fā)運(yùn)動(dòng)多動(dòng)和游泳爆發(fā)
我們首先研究了Lphn3活性降低對(duì)斑馬魚幼蟲行為的影響。在adhd典型綜合征維度的標(biāo)志中，我們關(guān)注的是運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，這在該模型系統(tǒng)中最容易評(píng)估。我們將Lphn3-MO1或Lphn3-MO2注射到野生型卵中，6天后測量運(yùn)動(dòng)。我們觀察到，與注射了錯(cuò)配morpholino(Lphn3-CO)的對(duì)照胚胎相比，lphn3.1 morphants游的距離顯著增加(圖1a)。在多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，注射MO1和MO2的幼蟲都表現(xiàn)出類似的運(yùn)動(dòng)增加(補(bǔ)充圖S6A，數(shù)據(jù)未顯示)，證實(shí)了表型的特異性。因此，我們的分析僅限于Lphn3-MO1型幼蟲。
lphn3.1 morphants游動(dòng)距離的增加(圖1a，補(bǔ)充圖S6A,B和補(bǔ)充視頻)可能是這是由于游泳比賽之間休息時(shí)間的減少或游泳速度的總體提高。在5分鐘的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)注射Lphn3-CO和注射lphn3-mo1的幼蟲的休息時(shí)間沒有顯著差異(p=0.5補(bǔ)充圖S6C)。相反，在排除休息時(shí)間后，注射Lphn3-CO的幼蟲平均游泳速度為3.93 mm s-1，而注射lphn3-m01的幼蟲平均游泳速度為6.44 mm s-1(Lphn3-CO與Lphn3-MO1之比為0.04;圖1 b)。因此，lphn3.1變形體的過度活躍反映了活動(dòng)期間整體運(yùn)動(dòng)速度的增加。
ADHD患者表現(xiàn)出的多動(dòng)癥狀可以隨著時(shí)間的推移而非常穩(wěn)定，并且也可能在夜間保持。為了確定lphn3.1變形體的活性是否顯示出類似的特性，我們首先繪制了在120s的實(shí)驗(yàn)中每3秒單個(gè)魚游動(dòng)的總距離(圖1c)。我們用線性方程y=Sx表示得到的單曲線，Lphn3-CO-動(dòng)物的斜率S為2.8 mm S-1，而Lphn3-MO1動(dòng)物的斜率S為6.2 mm S-1。這些值彼此之間存在顯著差異(線性混合t檢驗(yàn)p<0.025)，接近對(duì)照魚和變形魚的平均速度(圖1b)。綜上所述，這些結(jié)果表明，Lphn3.1變異魚表現(xiàn)出規(guī)律且穩(wěn)定的多動(dòng)。接下來，為了確定Lphn3-MO1變形體的過度活動(dòng)是否延伸到睡眠期間，我們記錄了夜間游泳的距離。不出所料，Lphn3-CO和Lphn3-MO1種群在夜間明顯較少游動(dòng)。然而，與注射對(duì)照動(dòng)物相比，Lphn3-MO1變形幼蟲仍然表現(xiàn)出明顯的多動(dòng)癥(圖1d)。
adhd相關(guān)的沖動(dòng)性增加，細(xì)分為運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知成分，被視為在患者中觀察到的各種行為障礙背后的基本特征。在繪制90秒內(nèi)單個(gè)動(dòng)物每3秒游的距離時(shí)，變形魚的曲線比Lphn3-CO幼蟲的曲線更陡(圖2a，灰色箭頭)。Lphn3-MO1魚的個(gè)體曲線平均呈現(xiàn)6.2個(gè)峰，而Lphn3-CO魚的個(gè)體曲線平均呈現(xiàn)2.7個(gè)峰(Lphn3-CO vs Lphn3-MO1 p<0.001;圖2 b)。此外，每個(gè)峰游的距離在變形體中增加(圖2c)，而游這個(gè)距離所花費(fèi)的時(shí)間在兩個(gè)處理組之間沒有變化(Lphn3-CO vs Lphn3-MO1=0.2;圖2 d)。因此，與對(duì)照相比，lphn3.1突變體表現(xiàn)出更多的活動(dòng)爆發(fā)，并且顯著加快(Lphn3-MO1為4.79 mm s—1,Lphn3-CO為2.14 mm s—1;圖2e)，表明其游泳行為的運(yùn)動(dòng)沖動(dòng)性增加。
圖1 下調(diào)lphn3.1誘導(dǎo)斑馬魚幼魚過度活躍。(a)注射Lphn3-CO、Lphn3-MO1或Lphn3-MO2的6只d.p.f.幼蟲在5 min時(shí)間間隔內(nèi)的平均游動(dòng)距離。注射MO1-和mo2的幼蟲與注射co的幼蟲游得同樣快，且游得更遠(yuǎn)。誤差條為±s.e.m。Lphn3-CO n=43,Lphn3-MO1 n=42,Lphn3-MO2 n=49。**po0.025,NS=無顯著性。(b)5min實(shí)驗(yàn)期間注射Lphn3-CO和lphn3-mo1的種群的平均游泳速度，不包括休息時(shí)間。對(duì)于Lphn3-CO，分析了n47只動(dòng)物;對(duì)于Lphn3-MO1,n=48。Lphn3-CO的動(dòng)物游泳的平均速度為3.93 mm s—1，而Lphn3-MO1變形體游泳的速度更快，平均速度為6.44 mm s—1。誤差條為±s.e.m。*po0.05。(c)注射Lphn3-CO和lphn3-mo1的幼蟲游動(dòng)距離隨時(shí)間的總和(單位:毫米)。在120秒的實(shí)驗(yàn)過程中，每3秒增加一次游動(dòng)的總距離;每個(gè)處理組N=10條魚;灰線代表Lphn3-MO1，黑線代表Lphn3-CO幼蟲。Lphn3-MO1變形魚持續(xù)且穩(wěn)定地過度活躍。線性混合t檢驗(yàn)po0.025。(d)白天(*po0.05)和夜間(**po0.025)注射Lphn3-CO(n=12)和Lphn3-MO1(n=12)的幼蟲5 min平均游動(dòng)距離。對(duì)于每個(gè)處理組，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)相同的動(dòng)物進(jìn)行分析。與白天相比，夜間Lphn3-MO1幼蟲的活動(dòng)減少(***po0.001)，但夜間測量的Lphn3-MO1幼蟲仍顯著高于夜間測量的Lphn3-CO(**po0.025)。
圖S6 Lphn3-MO1幼蟲運(yùn)動(dòng)行為的詳細(xì)分析。(A)注射CO-和mo1的種群中每只動(dòng)物在5分鐘內(nèi)行走的總距離。五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(每個(gè)實(shí)驗(yàn)用一種顏色)組合成一個(gè)圖表，顯示每條魚的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)(用圓點(diǎn)表示;左邊是Lphn3-CO，右邊是Lphn3-MO1)。注射lphn3 - mo1的幼蟲活性顯著高于注射Lphn-CO。方差分析后進(jìn)行t檢驗(yàn)p < 0.0001。(B)注射Lphn3-CO-和Lphn3-MO1的魚在5分鐘的時(shí)間間隔內(nèi)游動(dòng)行為的視頻軌跡。紅色和綠色的痕跡對(duì)應(yīng)于幼蟲的游泳速度。綠色跡線表示慢速游泳(小于10mm/秒)，紅色跡線表示速度大于10mm/秒。(C)注射Lphn3-CO- (n=47)和Lphn3-MO1 (n=48)的幼蟲在5分鐘實(shí)驗(yàn)期間的總休息時(shí)間。我們認(rèn)為每一個(gè)非游泳/運(yùn)動(dòng)的插曲都是休息時(shí)間。兩個(gè)種群的休息時(shí)間沒有顯著變化。
圖2 注射了morpholino的個(gè)體幼蟲表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)沖動(dòng)性。(a)Lphn3-MO1變形魚呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)高峰。5條魚的Lphn3-CO(左)和lphn3-mo1注射的幼蟲(右)游出的距離(毫米)，在90秒的實(shí)驗(yàn)中每3秒繪制一次。在第一個(gè)變形圖上顯示了峰值參數(shù)(包括平均游泳距離(水平黑色條)，加速時(shí)間和峰值高度(峰值頂部和底部之間的差值))。(b)120秒實(shí)驗(yàn)期間，Lphn3-CO和lphn3-mo1注射種群的活性峰數(shù)。每組N=10。變異幼蟲平均發(fā)生峰值6.2次，對(duì)照魚平均發(fā)生峰值2.7次。***p<0.01。(c)過度活躍的魚在每個(gè)峰中覆蓋的距離更大。峰的平均高度(毫米;圖a)中顯示的Lphn3-MO1幼蟲(平均12.86 mm)和Lphn3-CO幼蟲(平均6.58 mm)的距離值總結(jié)并報(bào)告在此圖中。ANOVA后進(jìn)行t檢驗(yàn)n=10 ***p<0.001。(d)為變形幼蟲和對(duì)照幼蟲繪制了峰值加速階段的持續(xù)時(shí)間(圖a中所示的時(shí)間值)。Lphn3-MO1注射期(平均持續(xù)時(shí)間3.53 s)與Lphn3-CO幼蟲期(平均持續(xù)時(shí)間3.90 s)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ANOVA后進(jìn)行t檢驗(yàn)。NS=無顯著性。(e)Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲在高峰期的加速值。峰值加速度(mms -1))對(duì)應(yīng)于n=10只動(dòng)物在不同峰值期間游泳距離與時(shí)間的比值。Lphn3-MO1-的平均峰值加速度為4.76 mms-1，注射lphn3-co的平均峰值加速度為2.14 mms -1。***p<0.01。
Lphn3變形體顯示DA系統(tǒng)發(fā)育受損
我們接下來的目標(biāo)是確定神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的任何變化是否與變形體的行為相關(guān)。一些證據(jù)將DA(DAergic)信號(hào)與ADHD的病因聯(lián)系起來。我們首先用高效液相色譜法測定了整個(gè)幼蟲體內(nèi)DA及其代謝物3,4-二羥基苯乙酸的濃度(補(bǔ)充圖S7A)。與Lphn3-CO相比，Lphn3-MO1幼蟲的DA水平和周轉(zhuǎn)量都沒有顯著變化(補(bǔ)充圖S7)，這表明DA信號(hào)在Lphn3-MO1中并未全局中斷。然而，由于這種分析不能檢測到一些DA核形成的細(xì)微變化，我們使用抗酪氨酸羥化酶免疫細(xì)胞化學(xué)檢測了3個(gè)d.p.f.和6個(gè)d.p.f.過度活躍的lphn3.1變異體大腦中DA神經(jīng)元的形成。我們集中分析了PT的DAergic，其中一些核向大腦皮層的下結(jié)構(gòu)發(fā)送投射。盡管斑馬魚系統(tǒng)與人類基底神經(jīng)節(jié)回路的功能關(guān)系仍存在爭議，斑馬魚PT已被認(rèn)為與運(yùn)動(dòng)控制有關(guān)。PT由7個(gè)神經(jīng)元群組成(圖3k)。在3d.p.f.，我們檢測到lphn3.1 嗎啡啉突變體的PT神經(jīng)元數(shù)量整體減少(圖3b和d，補(bǔ)充圖S7B)。這包括種群1和種群2的減少以及種群3的完全缺失(圖3a-d)。到6 d.p.f，過度活躍的Lphn3-MO1注射的幼蟲顯示出所有PT神經(jīng)元的嚴(yán)重紊亂(圖3e—j)，以及DA神經(jīng)元總數(shù)的減少(6 d.p.f Lphn3-CO vs 6 d.p.f Lphn3-MO1 po0.001，補(bǔ)充圖S7B)和投影。種群2、3和7幾乎完全缺失，而且種群1和4/5嚴(yán)重減少(圖3f,h,j)。為了證實(shí)這些觀察結(jié)果，我們分析了第二個(gè)DA標(biāo)記，編碼DA轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因slc6a3/dat。與Lphn3-CO相比，Lphn3-MO1 PT中slc6a3陽性神經(jīng)元的數(shù)量在3 d.p.f(補(bǔ)充圖S7C,D,G,H)和6 d.p.f(補(bǔ)充圖S7E,F,I,J)時(shí)均有所減少，證實(shí)了lphn3.1功能喪失后PT神經(jīng)元的修飾。
運(yùn)動(dòng)是一種數(shù)量性狀，Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲的活動(dòng)水平在單個(gè)種群內(nèi)都是不同的(補(bǔ)充圖S8A)，盡管Lphn3-MO1動(dòng)物的平均種群總是比Lphn3-CO活躍。為了直接研究多動(dòng)癥與DA神經(jīng)元減少之間的相關(guān)性，我們比較了分布在運(yùn)動(dòng)水平譜上的個(gè)體Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲的PT。首先根據(jù)幼蟲的行為表型將其分為三組(補(bǔ)充圖S8A)。第1組注射Lphn3-MO1注射的幼蟲比任何對(duì)照幼蟲游得更遠(yuǎn)。2組和3組幼蟲的游動(dòng)距離分別大于或小于Lphn3-CO幼蟲的平均游動(dòng)距離，均在對(duì)照幼蟲的活動(dòng)水平范圍內(nèi)。然后我們進(jìn)行了抗酪氨酸羥化酶抗體標(biāo)記，并觀察了PT DA神經(jīng)元修飾的梯度。1組(嚴(yán)重亢進(jìn)的Lphn3-MO1)幼蟲的PT DA神經(jīng)元有強(qiáng)烈的復(fù)位和錯(cuò)位(補(bǔ)充圖S8C)。第2組Lphn3-MO1幼蟲與第2組Lphn3-CO幼蟲相比，PT神經(jīng)元輕度減少(補(bǔ)充圖S8D,E)，而第3組Lphn3-MO1動(dòng)物的PT與第3組Lphn-CO動(dòng)物基本相似(補(bǔ)充圖S8F,G)。第2組和第3組Lphn3-CO幼蟲之間沒有顯著差異(補(bǔ)充圖S8D,F)。通過計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些觀察結(jié)果(補(bǔ)充圖S8B)。最后，與對(duì)照組相比，變形組的DAergic投影逐漸但持續(xù)地減少(補(bǔ)充圖S8C—G)。我們得出結(jié)論，PT DA系統(tǒng)形成的嚴(yán)重?fù)p傷確實(shí)與多動(dòng)癥有關(guān)。然而，第2組Lphn3-MO1幼蟲的DA細(xì)胞數(shù)量輕微但顯著減少，所有Lphn3-MO1組的DAergic投射持續(xù)減少，這表明PT DA神經(jīng)元和/或投射的數(shù)量可能存在一個(gè)閾值，需要減少才能觸發(fā)多動(dòng)癥。
其他單胺能神經(jīng)遞質(zhì)，包括NA和5-羥色胺(5-HT)18,44與ADHD有關(guān)，我們接下來分析了注射了多活性mo的幼蟲對(duì)這些系統(tǒng)的發(fā)育。在注射Lphn3-CO和lphn3-mo1的幼蟲中，在第3 d.p.f.和第6 d.p.f.時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)NA神經(jīng)元在c?ruleus 45位點(diǎn)的數(shù)量(補(bǔ)充圖S9F)和位置(補(bǔ)充圖S9A—D)相似。我們對(duì)5-HT神經(jīng)元進(jìn)行了類似的觀察。在斑馬魚中，5-HT神經(jīng)元存在于中縫核、下丘腦腹側(cè)和間腦前簇。我們統(tǒng)計(jì)了每個(gè)簇中這些神經(jīng)元的數(shù)量(補(bǔ)充圖S10M)，但與對(duì)照魚相比，在數(shù)量或形態(tài)上沒有觀察到顯著變化(補(bǔ)充圖S10A—L)。因此，在候選神經(jīng)遞質(zhì)通路中，只有DA神經(jīng)元在lphn3.1變異幼蟲中出現(xiàn)紊亂。
圖S7 Lphn3-MO1幼蟲的DA水平和營業(yè)額沒有顯著變化，但后結(jié)核中slc6a3陽性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少。(A)高效液相色譜測量顯示，與Lphn3-CO相比，Lphn3-MO1中的DA水平或營業(yè)額(由DA/DOPAC比值顯示)沒有差異。經(jīng)t檢驗(yàn)，DA的NS p < 0.58, DA/DOPAC的NS p < 0.65。誤差柱均為±SEM。(B) Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲后結(jié)核3dpf (n=4)和6dpf (n=5) th陽性細(xì)胞數(shù)量的定量。t檢驗(yàn)***p < 0.001。(C- j)與Lphn3-CO (A,C,E,G)相比，注射Lphn3-MO1 (B,D,F,H)幼蟲后結(jié)核中多巴胺能神經(jīng)元slc6a3原位標(biāo)記的減少。下面板(E-H)顯示上面板(A-D)的高倍圖像。在進(jìn)行slc6a3染色之前，所有分析的變形體都被證實(shí)在6dpf處過度活躍。
圖S8 后結(jié)核th陽性多巴胺能神經(jīng)元減少與多動(dòng)癥相關(guān)。(A)注射CO(黑色)和MO1(紅色)的種群在30分鐘內(nèi)單個(gè)動(dòng)物的總行程(每條魚用一個(gè)點(diǎn)表示)。藍(lán)色虛線表示Lphn3-CO種群的平均運(yùn)動(dòng)水平和最大運(yùn)動(dòng)水平。根據(jù)其運(yùn)動(dòng)水平將幼蟲分為3組，2組和3組幼蟲的活動(dòng)水平分別高于和低于Lphn3-CO動(dòng)物的平均活動(dòng)水平，1組幼蟲的游動(dòng)水平高于最活躍的Lphn3-CO動(dòng)物。(B)各組幼蟲后結(jié)核th陽性細(xì)胞數(shù)量定量。將細(xì)胞分為吻側(cè)簇(1/2/3)、中間簇(4/5)和尾側(cè)簇(6/7/8)進(jìn)行計(jì)數(shù)(見圖3k)。2組和3組Lphn3-CO幼蟲細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著差異。2組CO vs 3組CO，種群1/2/3;NS p < 0.58;第2組CO vs第3組CO，種群4/5;NS p < 0.23;第二組CO vs第三組CO，種群6/7/8;NS p < 0.89。1組幼蟲在所有三個(gè)集群中th陽性DA神經(jīng)元都顯著減少(這里與2組Lphn3-CO動(dòng)物相比)。2組Lphn3-MO1幼蟲的DA細(xì)胞在4/5群體中顯著減少，但在1/2/3和6/7/8群體中沒有顯著減少。與3組Lphn3-CO幼蟲相比，3組Lphn3-MO1幼蟲在任何種群中DA細(xì)胞均未顯著減少。(C) 1組Lphn3-MO1幼蟲后結(jié)核th陽性DA神經(jīng)元減少。(D,E)第2組Lphn3-MO1幼蟲(E)與第2組Lphn3-CO幼蟲(D)相比，第2組Lphn3-MO1幼蟲(G)與第3組Lphn3-CO幼蟲(F)相比，第3組Lphn3-MO1幼蟲(G)后結(jié)核中th陽性DA神經(jīng)元無顯著差異(盡管突起束的厚度似乎有所減少)。箭頭(C-G)表示DA神經(jīng)元th陽性投射。
圖S9 藍(lán)斑的去腎上腺素能神經(jīng)元在過度活躍的幼蟲中表現(xiàn)正常。(A- d)冠狀面，背向上顯示6天后腦抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體染色(A,B)。腹內(nèi)側(cè)壁(C,D)放大以突出藍(lán)斑(LC)。(C,D)表示th陽性神經(jīng)元。我們觀察到注射Lphn3-CO-(左)和注射lphn3 - mo1的魚之間沒有明顯差異。在進(jìn)行TH染色之前，所有分析的變形體都被證實(shí)是過度活躍的。(E) 6dpf斑馬魚大腦示意圖。箭頭表示方向;豎條表示A-D中各部分的位置。(F)過度活躍和對(duì)照注射幼蟲藍(lán)斑區(qū)NA神經(jīng)元數(shù)量的定量(n=5)。圖示:H、下丘腦、LC、藍(lán)斑、MO、延髓、OB、嗅球、P、蒼白球、PT、后結(jié)核、TeO、視頂蓋。
圖S10 Lphn3-MO1動(dòng)物5-HT神經(jīng)元正常。(A-F)注射Lphn3-CO (A,C,E)和Lphn3-MO1- (B,D,F)的幼蟲在3dpf時(shí)抗5- ht抗體染色相似。(G-L) 6dpf時(shí)注射Lphn3-CO (G,I,K)和Lphn3-MO1- (H,J,L)的幼蟲抗5- ht抗體染色相似。在進(jìn)行5-HT染色之前，所有分析的6dpf變形體都被證實(shí)是過度活躍的。所有面板顯示背側(cè)視圖，前向左。(M) 3dpf時(shí)變形幼蟲和對(duì)照幼蟲(n=5)中間腦前簇(Ptd)、下丘腦前腹側(cè)(ant.vH)、下丘腦后腹側(cè)(post.vH)和上葉(SR)中5- ht陽性神經(jīng)元的數(shù)量。圖示:vH，下丘腦;Ptd，保護(hù)間腦簇;SR，上拉斐爾核。
圖3 Lphn3-MO1幼蟲PT中DA神經(jīng)元分布發(fā)生改變。(a—j)抗酪氨酸羥化酶(TH)的背側(cè)圖抗體染色在3個(gè)D.P.F.(a-d)和6 D.P.F.(e-j)。尾部(g,h)和吻側(cè)(i,j)PT區(qū)域的高倍視圖。DA神經(jīng)元根據(jù)Rink和Wulliman的說法，子群被標(biāo)記為1-7,43和星號(hào)表示減少，缺失或可能錯(cuò)位的種群Lphn3-MO1-injected幼蟲。(k,l)后結(jié)核th陽性細(xì)胞群的卡通背照。Lphn3-CO魚顯示7與野生型幼蟲相似的不同種群的中腦DA神經(jīng)元(k)。注射lphn3-mo1的幼蟲減少了(紅色星號(hào))后結(jié)核TH陽性神經(jīng)元(l)。
用于治療ADHD最有效的藥物之一是精神興奮劑MPH，一種類似安非他明的化合物，作用于DA轉(zhuǎn)運(yùn)體。MPH被認(rèn)為可以改善注意力和認(rèn)知，導(dǎo)致患者包括沖動(dòng)行為在內(nèi)的心理運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的二次減少。為了探討MPH是否也能挽救lphn3.1型體的過度活躍，我們用藥物處理幼蟲并測量運(yùn)動(dòng)。在第一次劑量反應(yīng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)MPH在變形體中產(chǎn)生最大行為改變的濃度為10 mM(補(bǔ)充圖S11A)。接下來，我們比較了同一斑馬魚幼蟲在相同濃度的藥物治療前后的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。以10 mM MPH處理Lphn3-CO動(dòng)物減少了它們的休息時(shí)間(補(bǔ)充圖S11C)(CO vs CO+MPH;p<0.01)，但沒有導(dǎo)致其活性的顯著變化，無論是以距離游泳測量(圖4a，黑色條)(CO vs CO+mph;p=0.19)或速度(圖4c)(CO vs CO+MPH:p=0.36)。與之形成鮮明對(duì)比的是，MPH將Lphn3-MO幼蟲的游泳距離縮短至與Lphn3-CO對(duì)照動(dòng)物相似的水平(圖4a)(MO1 vs MO1 +MPH:p<0.001;CO vs MO1+mph:p=0.4)。在不改變Lphn3-MO1幼蟲休息時(shí)間(補(bǔ)充圖S11C)的情況下，通過降低其運(yùn)動(dòng)速度(圖4c;MO1 vs MO1;p<0.05,CO vs MO1+mph;p=0.3)。總之，MPH治療的變形動(dòng)物通過將其平均運(yùn)動(dòng)速度恢復(fù)到未治療的對(duì)照魚的水平，顯示出運(yùn)動(dòng)能力的矛盾減少，這讓人想起MPH對(duì)ADHD患者的影響。
一些患者的ADHD癥狀也可以通過選擇性NA再攝取抑制劑ATO 51-54治療得到改善，該抑制劑也間接調(diào)節(jié)能神經(jīng)傳遞。在劑量-反應(yīng)曲線中，我們觀察到ATO處理后，注射Lphn3-CO和Lphn3-MO1的幼蟲的運(yùn)動(dòng)能力普遍下降。然而，ATO對(duì)變形魚的影響通常比對(duì)照更強(qiáng)(補(bǔ)充圖S11B;Lphn3-CO vs Lphn3 MO1;p<0.001)。與MPH相似，我們?cè)趩蝹€(gè)實(shí)驗(yàn)中重新分析了ATO處理的效果。我們使用了1 mM ATO，這是影響變形動(dòng)物的最小劑量(補(bǔ)充圖S11B)。我們觀察到，該處理對(duì)對(duì)照注射的幼蟲沒有顯著影響(圖4d，補(bǔ)充圖S11D)。然而，它挽救了lphn3-mo1注射的幼蟲的過度活躍，將游動(dòng)距離減少到與對(duì)照魚相當(dāng)?shù)乃?圖4b;Lphn3-CO vs MO1-mph:p=0.46)，類似于在人類患者中看到的效果。與未經(jīng)處理的Lphn3-CO和Lphn3-MO1動(dòng)物相比，這種鎮(zhèn)靜作用與平均游泳速度降低到未處理或處理的對(duì)照魚的水平(圖4d)以及變形體的休息時(shí)間增加有關(guān)(CO vs MO-字形ato:p<0.025;MO1 vs MO1+ATO:p<0.05;補(bǔ)充圖S11D)。我們下一個(gè)探討了MPH和ATO治療降低lphn3.1相關(guān)過動(dòng)的可能機(jī)制。以10 mm MPH或1 mm ATO處理野生型幼蟲1 h，測定lphn3.1和lphn3.2的表達(dá)水平。MPH和ATO對(duì)lphn3.1的表達(dá)均無影響。相反，MPH輕度但顯著地增加了lphn3.2的表達(dá)，而ATO處理沒有(補(bǔ)充圖S12)。我們還分析了adhd治療藥物應(yīng)用對(duì)發(fā)育過程中酪氨酸羥化酶陽性PT DA神經(jīng)元形成的影響。10mMMPH或1mMATO處理野生型幼蟲6天(從0 d.p.f;補(bǔ)充圖S13B,C,F)，3天(從3天開始;補(bǔ)充圖S13D,G)或1小時(shí)(第6天;補(bǔ)充圖S13E,H)對(duì)PT中DA神經(jīng)元的位置和數(shù)量沒有整體影響(補(bǔ)充圖S13I)。綜上所述，這些結(jié)果表明，MPH和ATO對(duì)lphn3.1過度活躍的拯救可能不會(huì)發(fā)生在基因表達(dá)水平上(盡管ATO應(yīng)用后lphn3.2表達(dá)增加)，也不會(huì)通過整體修改PT中DA神經(jīng)元的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)。
圖S11 哌醋甲酯和托莫西汀處理Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲的量效曲線。(A)顯示哌醋甲酯(MPH)治療后運(yùn)動(dòng)的劑量反應(yīng)曲線。數(shù)值描述了在1小時(shí)MPH處理(8 μ M, 10 μ M, 12 μ M, 15 μ M或20 μ M)后游泳距離變化的百分比。Lphn3-CO n=12, Lphn3-MO1 n=12。(B)托莫西汀(ATO)治療后運(yùn)動(dòng)的劑量反應(yīng)曲線。數(shù)值描述了1小時(shí)ATO處理(1μM, 5μM, 10μM, 15μM或20μM)后游泳距離變化的百分比。Lphn3-CO n=12, Lphn3-MO1 n=12。(C) Lphn3-CO和Lphn3-MO1 6dpf動(dòng)物在10μM MPH處理前后的5分鐘實(shí)驗(yàn)總休息時(shí)間(n=12)。10μM MPH處理后，Lphn3-CO的靜息時(shí)間明顯縮短。(D)注射Lphn3-CO-和Lphn3-MO1的幼蟲在1μM ATO處理前后的5分鐘實(shí)驗(yàn)總休息時(shí)間(n=12)。Lphn3-MO1+ATO幼蟲的休息時(shí)間增加。誤差條均為±SEM， **p < 0.025， **p < 0.001, NS =無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
圖S12 實(shí)時(shí)PCR分析ATO和MPH處理后lphn3.1和lphn3.2的表達(dá)水平。用1μM ATO或10μM MPH急性處理6天野生型幼蟲1小時(shí)，可以挽救行為，但不影響lphn3.1或lphn3.2的表達(dá)水平。柱狀圖顯示了基因表達(dá)水平相對(duì)于控制基因gapdh的比率。誤差條均為±SEM, lphn3.1對(duì)照vs MPH, NS p < 0.7;lphn3.1對(duì)照與ATO, NS p < 0.2;lphn3.2對(duì)照與MPH， * p < 0.04;lphn3.2對(duì)照與ATO NS對(duì)照p < 0.1。t檢驗(yàn)。
圖S13 ATO和MPH處理不改變后結(jié)核發(fā)育過程中多巴胺能神經(jīng)元的形成。(A)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。胚胎在固定前第0天、第3天或第6天分別用1μM ATO或10μM MPH處理1小時(shí)。第6天對(duì)所有幼蟲進(jìn)行抗酪氨酸羥化酶抗體染色。(B)未經(jīng)處理的幼蟲后結(jié)核中多巴胺能神經(jīng)元的th標(biāo)記。(C-E)無論給藥時(shí)間點(diǎn)如何，1μM ATO處理對(duì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育均無影響。(F-H)無論給藥時(shí)間點(diǎn)如何，10μM MPH處理對(duì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育均無影響。(I)從第0天開始，對(duì)對(duì)照組、ato處理組和mph處理組6日齡幼蟲后結(jié)核th陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定量分析。細(xì)胞分為吻側(cè)簇(1/2/3)、中間簇(4/5)和尾側(cè)簇(6/7/8)(見圖3k)進(jìn)行計(jì)數(shù)。各組間DA神經(jīng)元數(shù)量無顯著差異。t檢驗(yàn)，CO vs ATO 1/2/3 NS p < 0.54;CO vs MPH 1/2/3 NS p < 0.38;CO vs ATO 4/5 NS p < 0.73;CO vs MPH 4/5 NS p < 0.69;CO vs ATO 6/7/8 NS p < 0.86;CO vs MPH 6/7/8 NS p < 0.96。
討論
在這項(xiàng)研究中，我們分析了lphn3.1的發(fā)育和行為功能，lphn3.1是一種斑馬魚同源基因，與人類LPHN3基因同源，通過連鎖和精細(xì)定位分析在ADHD患者中被發(fā)現(xiàn)。這里提出的結(jié)果為全基因組基因鑒定研究提供了必要的驗(yàn)證，并最終暗示LPHN3與ADHD的病因?qū)W有關(guān)。斑馬魚基因組包含兩個(gè)LPHN3同源基因，lphn3.1和lphn3.2，這是硬骨魚基因組中額外的全基因組復(fù)制的結(jié)果。在發(fā)育過程中，這兩個(gè)基因的表達(dá)譜似乎部分重疊。因此，在兩個(gè)基因共表達(dá)的大腦區(qū)域，lphn3.1的morpholino敲低可能會(huì)導(dǎo)致Lphn3總蛋白的亞形態(tài)減少(而不是完全喪失功能)。然而，為了證實(shí)這一假設(shè)，還需要進(jìn)一步研究同時(shí)下調(diào)lphn3.1和lphn3.2的影響。通過全基因組方法鑒定的基因包含多態(tài)性，這些多態(tài)性最有可能導(dǎo)致基因活性的調(diào)節(jié)，而不是功能的完全喪失。我們的數(shù)據(jù)表明，攜帶LPHN3風(fēng)險(xiǎn)的ADHD患者的表型維度haplotype 可能部分是由基因活性的不完全降低引起的。然而，為了直接解決這一問題，未來的實(shí)驗(yàn)需要分析ADHD患者中發(fā)現(xiàn)的與疾病相關(guān)的LPHN3變異。我們的結(jié)果有幾個(gè)重要的含義。首先，他們強(qiáng)調(diào)了lphn3.1在發(fā)育過程中建立準(zhǔn)確的能量信號(hào)傳導(dǎo)方面的主要和必不可少的作用。在lphn3基因廣泛表達(dá)的情況下，這種特異性效應(yīng)是如何實(shí)現(xiàn)的，DA系統(tǒng)發(fā)育的哪一步主要受Lphn3的控制，以及哪些信號(hào)通路依賴于Lphn3的作用，將是未來需要解決的重要問題。在這項(xiàng)研究中，我們分析了lphn3.1的發(fā)育和行為功能，lphn3.1是一種斑馬魚同源基因，與人類LPHN3基因同源，通過連鎖和精細(xì)定位分析在ADHD患者中被發(fā)現(xiàn)。這里提出的結(jié)果為全基因組基因鑒定研究提供了必要的驗(yàn)證，并最終暗示LPHN3與ADHD的病因?qū)W有關(guān)。
我們的結(jié)果有幾個(gè)重要的含義。首先，他們強(qiáng)調(diào)了lphn3.1在發(fā)育過程中建立準(zhǔn)確的能量信號(hào)傳導(dǎo)方面的主要和必不可少的作用。在lphn3基因廣泛表達(dá)的情況下，這種特異性效應(yīng)是如何實(shí)現(xiàn)的，DA系統(tǒng)發(fā)育的哪一步主要受Lphn3的控制，以及哪些信號(hào)通路依賴于Lphn3的作用，將是未來需要解決的重要問題。高效液相色譜分析顯示，Lphn3-MO1和Lphn3-CO幼蟲腦內(nèi)DA水平和周轉(zhuǎn)量無顯著差異。這可能是因?yàn)槲覀冊(cè)贚phn3-MO1中看到的DA神經(jīng)元形成的改變僅限于一個(gè)離散的神經(jīng)元簇，其改變可能不足以全局改變DA水平。因此，Lphn3功能與能量信號(hào)之間的聯(lián)系需要以更高的分辨率進(jìn)行研究，重點(diǎn)關(guān)注特定的大腦區(qū)域和/或投射。Lphn3的表達(dá)在小鼠中也廣泛分布，但目前還沒有研究Lphn3功能喪失的模型。在秀麗隱桿線蟲發(fā)育過程中，嗜乳蛋白基因在控制組織極性的建立中也起著重要作用。因此，我們目前的數(shù)據(jù)提供了嗜乳蛋白家族粘附-g蛋白偶聯(lián)受體蛋白參與早期發(fā)育的進(jìn)一步證據(jù)。此外，由于MO只提供了基因活性的短暫敲低，我們的研究也加強(qiáng)了ADHD主要是一種神經(jīng)發(fā)育障礙的結(jié)論。
我們的研究結(jié)果還表明，Lphn3功能的降低會(huì)引起斑馬魚幼蟲的強(qiáng)烈行為改變，其特征與ADHD患者中觀察到的多動(dòng)/沖動(dòng)表型相似。這些特征包括穩(wěn)定增加的運(yùn)動(dòng)行為、夜間多動(dòng)和運(yùn)動(dòng)沖動(dòng)性的爆發(fā)。lphn3.1突變體對(duì)ADHD特異性藥物的獨(dú)特反應(yīng)也表現(xiàn)為典型的ADHD行為，MPH和ATO都能使突變體恢復(fù)到控制活性水平。MPH和ATO拯救lphn3.1變形體運(yùn)動(dòng)行為的機(jī)制，如ADHD患者，尚不清楚。盡管MPH導(dǎo)致急性治療后lphn3.2表達(dá)水平升高，但ATO治療并未影響這兩種基因的表達(dá)(補(bǔ)充圖S12)。MPH和ATO處理對(duì)發(fā)育過程中PT DA神經(jīng)元的形成也沒有明顯影響，即使在慢性藥物治療后也是如此(補(bǔ)充圖S13)。因此，MPH和ATO不太可能通過全局改變lphn3基因表達(dá)水平或通過使DA神經(jīng)元的發(fā)育正?；瘉砀淖僡dhd相關(guān)行為。為了更好地了解MPH和ATO處理前后的機(jī)制，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，包括高效液相色譜測量，以更好地了解MPH和ATO修復(fù)Lphn3-MO1行為表型的機(jī)制。
結(jié)論
ADHD患者可能主要表現(xiàn)為注意力缺陷和伴隨的認(rèn)知控制失敗，結(jié)果是多動(dòng)癥和沖動(dòng)性增加。在動(dòng)物模型中評(píng)估注意力不集中是很復(fù)雜的，我們目前無法在斑馬魚幼蟲中進(jìn)行測量。然而，在大多數(shù)ADHD患者中，多動(dòng)癥和沖動(dòng)性增加的表型表達(dá)和我們?cè)谶@里提出的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，lphn3.1變異幼蟲至少是一些ADHD相關(guān)運(yùn)動(dòng)內(nèi)表型的有效模型。最后，lphn3.1突變體可能為篩選新的ADHD治療策略提供一個(gè)有用的平臺(tái)。
基金：Merlin Lange得到了法國教育部獎(jiǎng)學(xué)金的支持。LBC實(shí)驗(yàn)室的工作得到了巴黎神經(jīng)科學(xué)學(xué)院(ENP)、ANR(卓越主席ANR-08-cec-001-01)、FRM(項(xiàng)目DPR 20081214424)、PIME項(xiàng)目、斯倫貝謝協(xié)會(huì)(資助DLS/GP/LB090305)和歐盟項(xiàng)目NeuroXsys(資助協(xié)議FP7 2007-2013,no 223262)和ZF-Health(資助協(xié)議health-f1-2010-242048)的支持?？藙谒?彼得·萊施實(shí)驗(yàn)室的工作得到了德國科學(xué)研究委員會(huì)(DFG KFO 125,SFB 581和SFB TRR 58)和德國聯(lián)邦建筑與研究委員會(huì)(BMBF 01GV0605)的支持。
本文章原文：分子精神病學(xué)(2012)，1-9&2012 Macmillan Publishers Limited
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