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雜志：Frontiers in?Cell and Developmental Biology

影響因子：5.5（2022-2023）

年份：2023

原文：Ma M, Brunal A A, Clark K C, et al. Deficiency in the cell-adhesion molecule dscaml1 impairs hypothalamic CRH neuron development and perturbs normal neuroendocrine stress axis function[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2023, 11: 1113675.

通訊作者：Y. Albert Pan

摘要

下丘腦中表達(dá)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的神經(jīng)元是神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)途徑(即下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。由于CRH神經(jīng)元的發(fā)育脆弱性會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)和行為功能障礙，因此確定CRH神經(jīng)元正常和異常發(fā)育的機(jī)制至關(guān)重要。在斑馬魚中，我們發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子like-1 (dscaml1)是CRH神經(jīng)元發(fā)育的完整介質(zhì)，也是建立正常應(yīng)激軸功能所必需的。在dscaml1突變動(dòng)物中，與野生型對(duì)照相比，下丘腦CRH神經(jīng)元具有更高的crhb(斑馬魚中的CRH同源物)表達(dá)，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞死亡減少。生理上，dscaml1突變動(dòng)物具有較高的基線應(yīng)激激素(皮質(zhì)醇)水平和對(duì)急性應(yīng)激源的反應(yīng)減弱。總之，這些發(fā)現(xiàn)確定dscaml1是應(yīng)激軸發(fā)育的重要因素，并表明HPA軸失調(diào)可能有助于人類DSCAML1相關(guān)神經(jīng)精神疾病的病因?qū)W。

關(guān)鍵詞：下丘腦-垂體-腎上腺軸，斑馬魚，CRH神經(jīng)元，下丘腦，發(fā)育

前言

下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)表達(dá)神經(jīng)元是神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)通路的中樞調(diào)節(jié)器，在哺乳動(dòng)物中被稱為下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸或在魚類中被稱為下丘腦-垂體-腎間(HPI)軸。當(dāng)暴露于環(huán)境干擾(即壓力源)時(shí)，與壓力相關(guān)的神經(jīng)輸入?yún)R聚到下丘腦CRH神經(jīng)元上，激活激素級(jí)聯(lián)，最終導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的釋放，從而廣泛影響認(rèn)知、情感、代謝和免疫功能。

CRH神經(jīng)元的發(fā)育對(duì)HPA和HPI軸(統(tǒng)稱為應(yīng)激軸)的功能有深遠(yuǎn)的影響。CRH神經(jīng)元的發(fā)育擾動(dòng)，特別是在生命早期，會(huì)導(dǎo)致CRH神經(jīng)元功能的長(zhǎng)期變化。此外，嚙齒動(dòng)物模型表明，CRH神經(jīng)元的失調(diào)會(huì)增加焦慮和抑郁樣表型。這些研究強(qiáng)調(diào)需要識(shí)別介導(dǎo)CRH神經(jīng)元發(fā)育的基因和分子，并確定發(fā)育擾動(dòng)如何影響應(yīng)激軸功能。

在發(fā)育早期，下丘腦CRH神經(jīng)元由腹側(cè)間腦的祖細(xì)胞產(chǎn)生。分泌因子包括FGF10、SHH、bmp和Nodal首先定義下丘腦前背區(qū)域;在這個(gè)區(qū)域內(nèi)，CRH神經(jīng)元逐漸由一系列關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子組合指定，包括Fezf2、Otp、Sim1、Arnt2和Brn2。一旦被指定，CRH神經(jīng)元將經(jīng)歷進(jìn)一步的分化，如神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生、突觸發(fā)生、表觀遺傳編程和細(xì)胞死亡，以建立一個(gè)功能性的應(yīng)激反應(yīng)神經(jīng)回路。這些神經(jīng)元分化的后期階段是由膜定位的細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用形成的。然而，介導(dǎo)CRH神經(jīng)元發(fā)育信號(hào)的特定細(xì)胞粘附分子尚不清楚。

為了解決這一知識(shí)缺口，我們使用斑馬魚作為模型。哺乳動(dòng)物HPA軸和硬骨動(dòng)物HPI軸的結(jié)構(gòu)和功能高度保守。在哺乳動(dòng)物中，主要參與hpa軸激活的CRH神經(jīng)元位于下丘腦室旁核(PVN)中。在硬骨魚(鰩魚)中，神經(jīng)內(nèi)分泌視前區(qū)(NPO)與PVN具有同源性，NPO內(nèi)的CRH神經(jīng)元與其哺乳動(dòng)物的對(duì)應(yīng)區(qū)域具有相似的作用。斑馬魚其他下丘腦區(qū)域(如中間下丘腦)的CRH神經(jīng)元也可能調(diào)節(jié)HPI軸。斑馬魚的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是其快速的外部發(fā)育。HPI軸的發(fā)育開始于受精后1-2天(dpf)，應(yīng)激誘導(dǎo)的皮質(zhì)醇信號(hào)和行為可以在4-5 dpf觀察到。斑馬魚的快速發(fā)育和半透明使得在完整的、發(fā)育中的動(dòng)物中直接觀察CRH神經(jīng)元的發(fā)育成為可能。

在這項(xiàng)研究中，我們研究了一個(gè)保守的神經(jīng)元信號(hào)分子-唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子樣1(斑馬魚基因:dscaml1;小鼠基因:Dscaml1;人基因:DSCAML1;蛋白質(zhì):DSCAML1)。DSCAML1是脊椎動(dòng)物中兩個(gè)DSCAM家族成員之一，另一個(gè)是DSCAM。與無脊椎動(dòng)物的DSCAMs不同，脊椎動(dòng)物的DSCAMs沒有明顯的選擇性拼接。在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中，DSCAML1阻止細(xì)胞之間的過度聚集并促進(jìn)發(fā)育中的細(xì)胞死亡。DSCAML1還可以改善突觸特異性和突觸數(shù)量。在人類中，DSCAML1的罕見變異與幾種神經(jīng)發(fā)育障礙有關(guān)，包括自閉癥譜系障礙、皮質(zhì)異常和癲癇。遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究也表明DSCAML1與暴力經(jīng)歷的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。然而，DSCAML1與應(yīng)力軸之間的關(guān)系尚不清楚。

我們之前利用斑馬魚研究了DSCAML1如何影響神經(jīng)通路和系統(tǒng)功能。我們發(fā)現(xiàn)dscaml1缺乏會(huì)導(dǎo)致各種生理和行為缺陷，包括色素沉著變深、光適應(yīng)變慢和眼球運(yùn)動(dòng)(掃視)變慢。有趣的是，正如斑馬魚糖皮質(zhì)激素受體(gr)突變體所見，色素沉著變深和光適應(yīng)變慢也可能是由異常的糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)引起的，這表明應(yīng)激軸可能在dscaml1突變體中功能失調(diào)。

在這里，我們報(bào)道了斑馬魚的dscaml1缺乏會(huì)擾亂下丘腦CRH神經(jīng)元的發(fā)育并損害HPI軸的正常功能。這些發(fā)現(xiàn)表明DSCAML1是應(yīng)激軸發(fā)育所必需的，并提高了應(yīng)激功能障礙導(dǎo)致人類DSCAML1相關(guān)疾病的可能性。

斑馬魚飼養(yǎng)：

所有年齡的斑馬魚在28.5°C的14/10光照/黑暗周期下飼養(yǎng)。胚胎和幼蟲在E3緩沖液(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)中飼養(yǎng)。本研究使用的斑馬魚均為AB和TL野生型混合背景(斑馬魚國(guó)際資源中心)。在本研究中使用的階段(0-6 dpf)，性別不是一個(gè)相關(guān)變量，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室斑馬魚在2周齡之前性別未分化。

轉(zhuǎn)基因和突變斑馬魚系：

dscaml1vt1功能缺失等位基因包含7個(gè)堿基對(duì)缺失，導(dǎo)致幀移位和過早停止密碼子。用于活體成像的動(dòng)物是純合子珠層(mitfa)突變背景，以防止色素的形成。小膠質(zhì)細(xì)胞RFP細(xì)胞系[Tg(mpeg1:Gal4;UAS:NTR-mCherry)]由杜克大學(xué)John Rawls博士提供。crhb:LoxP-RFP-LoxP-GFP系使用CRISPR介導(dǎo)的敲入產(chǎn)生，如Kimura等人所述。crhb敲入位點(diǎn)的sgRNA序列為AGCTCGCGTCTGCGCAGAG。所有組間比較(突變體與對(duì)照組)均在兄弟姐妹之間進(jìn)行。

RNA-seq和差異基因表達(dá)分析：

雜合dscaml1突變親本的后代在3.5-4 dpf時(shí)麻醉并收獲。使用RNA Miniprep Kit(Zymo)對(duì)動(dòng)物前半部分進(jìn)行RNA制備。后半部分用于基因分型。每組分析3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含有6-11只動(dòng)物的RNA。所有樣品的RIN≥8.0，使用Illumina的TruSeq mRNA HT樣品準(zhǔn)備試劑盒(rs -122 - 2103;Illumina的NextSeq 75測(cè)序儀進(jìn)行后續(xù)的聚類生成和測(cè)序。序列數(shù)據(jù)處理、比對(duì)、讀取計(jì)數(shù)、映射和質(zhì)量控制如前所述進(jìn)行。使用R-package DESeq2中的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR) (Benjamini-Hochberg)校正似然比檢驗(yàn)(LRT)檢驗(yàn)差異表達(dá)的顯著性。在FDR<0.01和0.001時(shí)，238個(gè)和116個(gè)基因的reads計(jì)數(shù)差異顯著。原始序列數(shù)據(jù)已存儲(chǔ)在NCBI的基因表達(dá)Omnibus中，可通過GEO系列登錄號(hào)GSE213858訪問。

熒光原位雜交和免疫組織化學(xué)：

采用前面描述的方法進(jìn)行了單次和雙次全載熒光原位雜交(FISH)。探針使用DIG和熒光素RNA標(biāo)記混合物(Roche)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成。DIG和熒光素標(biāo)記探針采用抗DIG或抗熒光素pod共軛Fab片段(Roche)和Cy3或熒光素TSA-plus試劑(Akoya Biosciences)進(jìn)行檢測(cè)。crhb的質(zhì)粒模板由加州理工學(xué)院的David Prober博士提供。dscaml1探針是按照前面的描述生成的。

如前所述進(jìn)行免疫組化。小鼠抗ERK1/2(4696S;細(xì)胞信號(hào)技術(shù))?；罨腸aspase 3用兔抗裂解caspase 3 (559565;BD生物科學(xué))。細(xì)胞核用TOTO-3碘染色(ThermoFisher)。RFP用雞抗RFP (600-901-379S, Rockland)或兔抗RFP (PM005, MBL Life Science)染色。用rabbit anti-GFP (598, MBL Life Science)染色。CRH采用Salk研究所P. Sawchenko和J. Vaughan提供的兔抗CRH (PBL rC68)染色。所有FISH和免疫組化樣品均在1.5%低熔瓊脂糖溶液中置于玻璃底培養(yǎng)皿中(P50G-1.5-14-F;MatTek)，并使用尼康A(chǔ)1直立共聚焦顯微鏡成像。

皮質(zhì)醇提取及ELISA：

皮質(zhì)醇提取和ELISA的詳細(xì)方案在線提供(補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S4)。在4.5 dpf時(shí)，根據(jù)dscaml1-/-動(dòng)物較深的色素沉著，將dscaml1?/?和對(duì)照動(dòng)物分開。每個(gè)培養(yǎng)皿中放置30-35只動(dòng)物進(jìn)行皮質(zhì)醇提取。上午基線(無應(yīng)激)樣本采集時(shí)間為光照后15-30分鐘(08:15-08:45)，下午樣本采集時(shí)間為14:30-16:00。高滲應(yīng)力和攪拌應(yīng)力實(shí)驗(yàn)時(shí)間為14:30-15:30。針對(duì)每種基因型(dscaml1-/-和對(duì)照)和應(yīng)激條件(上午基線、下午基線、攪拌應(yīng)激、滲透應(yīng)激)，收集了6個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含30只動(dòng)物。每次實(shí)驗(yàn)都對(duì)突變體和對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行并排測(cè)試。

用自旋磁攪拌棒制造渦流水流，產(chǎn)生攪拌應(yīng)力。將一個(gè)小磁性攪拌棒放入100 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有35只動(dòng)物和20 mL E3培養(yǎng)基。攪拌棒在微孔板上以300轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5分鐘。通過增加培養(yǎng)基中的鹽濃度誘導(dǎo)高滲應(yīng)激。30只動(dòng)物置于8ml E3培養(yǎng)基中。然后，在培養(yǎng)基中加入2 mL預(yù)熱好的1.25 M NaCl，使終濃度為250 mM，靜置20 min。

按照Yeh等人的描述進(jìn)行樣品均質(zhì)和皮質(zhì)醇提取。簡(jiǎn)單地說，用冰冷的E3培養(yǎng)基快速固定5只dpf幼蟲，然后在?80°C下快速冷凍。收集完所有樣品后，用乙酸乙酯(33211-1L-R;Sigma-Aldrich)。使用商用ELISA試劑盒測(cè)量皮質(zhì)醇濃度，遵循制造商的說明(500360;開曼群島化學(xué))。用微孔板閱讀器(FilterMax F3;MicroDevices)初始開發(fā)后90-120分鐘。

CRH神經(jīng)元的實(shí)時(shí)成像：

通過在胚胎1細(xì)胞期注射Cre mRNA誘導(dǎo)crhb:LRLG轉(zhuǎn)基因重組。為了實(shí)現(xiàn)CreER介導(dǎo)的部分重組，在1細(xì)胞期注射~30pg CreER mRNA，在6 hpf (10 μM)的胚胎培養(yǎng)基中加入4-羥基他莫昔芬(4-OHT)，然后在24 hpf的E3培養(yǎng)基中沖洗。為了實(shí)現(xiàn)Cre介導(dǎo)的完全重組，約50pg體外轉(zhuǎn)錄Cre。將zf1 mRNA (#61391, Addgene)注射到胚胎中。

為了進(jìn)行共聚焦實(shí)時(shí)成像，3只dpf動(dòng)物用0.01%三卡因甲磺酸鈉(MS-222, Sigma)麻醉，包埋在1%低熔點(diǎn)瓊脂糖中，背側(cè)放在玻璃底培養(yǎng)皿內(nèi)的玻璃表面(P50G-1.5-14-F;MatTek)。然后用含有0.01%三卡因甲磺酸鹽(MS-222, Sigma)的E3培養(yǎng)基填充培養(yǎng)皿。在尼康A(chǔ)1共聚焦顯微鏡上每隔15或30分鐘采集共聚焦z堆棧，持續(xù)12小時(shí)。

雙光子實(shí)時(shí)成像是在定制的布魯克雙通道雙光子顯微鏡上完成的?？烧{(diào)諧鈦藍(lán)寶石激光器(變色龍視覺II;調(diào)到980 nm，同時(shí)激發(fā)RFP和GFP。78只HPF動(dòng)物被麻醉并以與共聚焦活體成像相同的方式植入，但背部遠(yuǎn)離覆蓋玻璃。分別在78、84、96、108和120 hpf下成像(圖6A)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，將成像的幼蟲輕輕從瓊脂糖中取出，在正常晝夜循環(huán)下，在28.5°C的E3培養(yǎng)基中恢復(fù)。在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后，為所有成像動(dòng)物制備基因組DNA并進(jìn)行基因分型。

圖像處理和統(tǒng)計(jì)分析：

使用開源圖像處理軟件fiji對(duì)圖像進(jìn)行處理。對(duì)于FISH圖像，對(duì)圖像進(jìn)行卷積(kernel = 12)以增強(qiáng)細(xì)胞邊界，并使用ROI manager工具手動(dòng)標(biāo)記每個(gè)細(xì)胞的中心。細(xì)胞數(shù)量等于每只動(dòng)物的roi數(shù)量。每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度定義為給定動(dòng)物中所有roi信號(hào)強(qiáng)度的中位數(shù)。使用ROI manager工具對(duì)crhb:LRLG動(dòng)物的RFP+細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，不進(jìn)行卷積。對(duì)于共聚焦實(shí)時(shí)成像，使用降噪對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理。尼康元素軟件中的AI功能。對(duì)于雙光子成像，使用“正確3D漂移”功能對(duì)來自不同時(shí)間點(diǎn)的z堆棧進(jìn)行對(duì)齊。RFP和GFP通道之間的光譜重疊線性未混合。在斐濟(jì)，使用MTrackJ插件跟蹤單個(gè)細(xì)胞。

所有統(tǒng)計(jì)分析均在GraphPad Prism (Version 9)軟件中進(jìn)行。對(duì)于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用參數(shù)檢驗(yàn)(t檢驗(yàn)或方差分析)。對(duì)于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney)。采用Holm-Sidak后驗(yàn)法對(duì)多重比較進(jìn)行校正，并顯示調(diào)整后的p值。除非另有說明，所有數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。當(dāng)p < 0.05時(shí)，認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯著。

凋亡細(xì)胞(AC3+)的定量采用MAP-map定量和Z-Brain注釋法，但使用Anti-AC3代替抗磷酸化的ERK1/2。所有MAP-map處理程序(如CMTK、MATLAB腳本)均按照Randlett等人的描述執(zhí)行。NPO在Z-Brain中沒有這樣的注釋，但“間腦- Otpb集群2”ROI符合NPO的定義，因?yàn)樗枥L了表達(dá)Otpb的視前區(qū)背側(cè)區(qū)域。

dscaml1缺乏導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌因子過度表達(dá)

為了獲得dscaml1缺失導(dǎo)致的分子變化的公正觀點(diǎn)，我們使用RNA測(cè)序(RNA-seq)比較了dscaml1純合突變(dscaml1?/?)和對(duì)照(野生型)組之間的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。利用Illumina下一代測(cè)序儀對(duì)受精后3.5-4天(dpf) dscaml1?/?和對(duì)照幼蟲的cDNA進(jìn)行測(cè)序。使用至少兩倍變化的閾值和小于0.01的調(diào)整p值，我們確定了25個(gè)上調(diào)基因和79個(gè)下調(diào)基因(圖1A, 補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S1)。

在dscaml1?/?動(dòng)物中上調(diào)的25個(gè)基因中，有7個(gè)是下丘腦或垂體中表達(dá)的分泌神經(jīng)肽/激素:促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素b(crhb)、甲狀旁腺激素2 (pth2)、生長(zhǎng)肌動(dòng)素β (smtlb)、可卡因和安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物3 (cart3)、黑素原皮質(zhì)激素a (pomca)、精氨酸加壓素(avp)和spexin激素(spx)。其中三個(gè)(crhb, avp, pomca)是HPI軸的核心調(diào)節(jié)因子。crhb編碼斑馬魚的CRH;avp編碼控制滲透壓、血壓的神經(jīng)肽AVP，并與CRH協(xié)同促進(jìn)皮質(zhì)醇釋放;pomca編碼促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，這是觸發(fā)糖皮質(zhì)激素釋放的主要垂體激素。此外，兩個(gè)參與細(xì)胞凋亡的基因:BCL2凋亡調(diào)節(jié)因子b (bcl2b)和phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸鹽誘導(dǎo)蛋白1(pmaip1/noxa)上調(diào)。用PANTHER進(jìn)行蛋白質(zhì)類分類分析，發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞間信號(hào)分子”是最大的一類(4個(gè)基因，16%)(圖1B)。

與上調(diào)基因相比，dscaml1?/?動(dòng)物中下調(diào)的79個(gè)基因在功能上更加多樣化。用PANTHER進(jìn)行蛋白質(zhì)分類分析，發(fā)現(xiàn)最大的蛋白質(zhì)類別是代謝物相互轉(zhuǎn)換酶(12個(gè)基因，15.19%)、蛋白質(zhì)結(jié)合活性調(diào)節(jié)劑(9個(gè)基因，11.39%)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(8個(gè)基因，10.13%)和防御/免疫蛋白(6個(gè)基因，7.59%)(圖1C)。我們注意到79個(gè)下調(diào)基因中有30個(gè)(38%)在肝臟中高表達(dá)，其中10個(gè)基因參與先天免疫和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)(圖1A, 補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S2)。這些結(jié)果表明，dscaml1突變體可能會(huì)抑制肝功能和先天免疫。

為了確定受dscaml1缺失影響的信號(hào)通路，我們使用統(tǒng)計(jì)富集檢驗(yàn)(PANTHER Classification System, version 17.0)分析了所有差異表達(dá)基因(p <0.01, 210個(gè)定位基因)。所有顯著富集(FDR < 0.05)的基因個(gè)體發(fā)生(GO)分子功能項(xiàng)都與親本GO項(xiàng)激素活性相關(guān)(圖1D)。PANTHER通路分析還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)顯著的應(yīng)激調(diào)節(jié)神經(jīng)肽，腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1b (adcyap1b，也稱為PACAP)顯著上調(diào)(0.66倍變化，調(diào)整后p < 0.0001)。

總之，我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，dscaml1缺乏導(dǎo)致神經(jīng)肽/激素信號(hào)的上調(diào)以及肝臟和先天免疫功能的下調(diào)。肝臟和免疫功能的抑制是應(yīng)激軸激活的標(biāo)志，這與參與應(yīng)激軸的主要神經(jīng)肽(crhb、avp、pomca和adcyap1b)的過度表達(dá)一致。

圖1 dscaml1缺陷斑馬魚的差異基因表達(dá)分析。(A)與對(duì)照動(dòng)物相比，dscaml1?/?相對(duì)基因表達(dá)的火山圖。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的基因，彩色點(diǎn)代表圖表上顯示的基因組。虛線表示顯著性水平(調(diào)整p < 0.01)和倍數(shù)變化(增加或減少2倍或更多)閾值(B, C)。上調(diào)(B)和下調(diào)(C)基因的蛋白類分類分析。(D)分子功能顯著富集(p < 0.05)氧化石墨烯項(xiàng)表。

dscaml1缺失改變了NPO中CRH神經(jīng)元的發(fā)育

為了進(jìn)一步研究dscaml1突變體的應(yīng)激軸是否受到干擾，我們首先檢測(cè)了NPO中CRH神經(jīng)元的發(fā)育(CRHNPO神經(jīng)元)(圖2A)，這些神經(jīng)元位于背視前區(qū)，以crhb的表達(dá)為特征。我們重點(diǎn)研究了三個(gè)發(fā)育階段(2、3和5 dpf)，它們跨越了NPO中crhb+神經(jīng)元首次出現(xiàn)(2 dpf)和應(yīng)激軸反應(yīng)(4-5 dpf)之間的時(shí)期。所有比較均采用同胞對(duì)照。

使用熒光原位雜交(FISH)，我們發(fā)現(xiàn)在2 dpf時(shí)，dscaml1?/?和野生型(WT)動(dòng)物之間的crhb表達(dá)模式最初相似(圖2B, B ')。在3 dpf時(shí)，我們開始在dscaml1?/?動(dòng)物的NPO中看到較高的crhb表達(dá)(圖2C, C′)，并且在5 dpf時(shí)，dscaml1?/?動(dòng)物的NPO中crhb表達(dá)仍然較高(圖2D, D′)。CRHNPO神經(jīng)元中crhb FISH信號(hào)強(qiáng)度的量化顯示，與WT動(dòng)物相比，dscaml1?/?動(dòng)物中的crhb表達(dá)更高(圖2E)。每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度因發(fā)育階段和基因型而有顯著差異，并且發(fā)育階段和基因型之間存在顯著的交互作用(雙向方差分析，補(bǔ)充表SI)。配對(duì)與Holm-Sidak校正比較發(fā)現(xiàn)，在3和5 dpf處顯著增加，但在2 dpf處沒有增加(圖2E)。

除了crhb表達(dá)水平的變化，dscaml1缺失也增加了表達(dá)crhb的CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量。在WT動(dòng)物中，CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量隨著時(shí)間的推移而增加，從14.78個(gè)細(xì)胞(2 dpf)到18.85個(gè)細(xì)胞(3 dpf)到26.60個(gè)細(xì)胞(5 dpf)(圖2B-D, F)。在dscaml1?/?動(dòng)物中，CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量以更高的速度增加，從12.67個(gè)細(xì)胞(2 dpf)到19.46個(gè)細(xì)胞(3 dpf)到36.39個(gè)細(xì)胞(5 dpf)(圖2B '，C '，D '，F(xiàn))。分期和基因型之間存在顯著的交互作用(雙向方差分析，補(bǔ)充表SI)。采用Holm-Sidak校正的兩兩比較發(fā)現(xiàn)，dscaml1?/?和WT動(dòng)物在5 dpf時(shí)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，但在2和3 dpf時(shí)沒有增加(圖2F，調(diào)整后的p值如圖所示)。

總的來說，我們發(fā)現(xiàn)與WT相比，dscaml1?/?突變體中crhb表達(dá)和CRHNPO神經(jīng)元中細(xì)胞數(shù)量顯著增加。這些表型不是由于dscaml1?/?動(dòng)物的視覺缺陷，因?yàn)樵诤诎抵酗曫B(yǎng)的動(dòng)物中也觀察到類似的表型(補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S1)。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明dscaml1對(duì)CRHNPO神經(jīng)元的正常發(fā)育軌跡至關(guān)重要。

圖2 dscaml1缺失改變了CRHNPO神經(jīng)元的發(fā)育。(A)斑馬魚幼體大腦示意圖(側(cè)視圖)，吻側(cè)向左。NPO用藍(lán)色突出顯示。用于CRHNPO神經(jīng)元分析的成像平面顯示(淺藍(lán)色平面)(B-D’)CRHNPO神經(jīng)元的發(fā)育軌跡，用crhb FISH(綠色)標(biāo)記，并與抗erk1/2(洋紅色)共染色。在每個(gè)發(fā)育階段，顯示了包含NPO的代表性共聚焦子堆棧，NPO(框狀區(qū)域)擴(kuò)大，顯示在右圖中，沒有ERK1/2共染色。野生型(WT)動(dòng)物如圖B、C和(D)所示。dscaml1?/?動(dòng)物如圖B’、C’和D’所示(E-F)每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度(E)和細(xì)胞數(shù)量(F)的量化。多重比較校正后的p值如圖所示。WT: n = 9 (2 dpf)， 13 (3 dpf)， 15 (5 dpf)。dscaml1?/?:n = 9 (2 dpf)， 13 (3 dpf)， 18 (5 dpf)。標(biāo)尺尺寸為20μm。顯示了平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差和校正后的p值。

dscaml1缺乏會(huì)損害下丘腦中部和吻側(cè)CRH神經(jīng)元的發(fā)育

為了測(cè)試其他下丘腦CRH神經(jīng)元是否受到與CRHNPO神經(jīng)元相似的影響，我們檢查了另外兩個(gè)表達(dá)CRH的下丘腦區(qū)域。在斑馬魚中，中間下丘腦(IH) CRH神經(jīng)元(CRHIH神經(jīng)元)調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和對(duì)光的情緒效價(jià)的感知(圖3A)。在5 dpf的IH中，我們沒有觀察到dscaml1?/?和WT動(dòng)物之間的crhb表達(dá)水平(FISH強(qiáng)度)有任何顯著差異(圖3B-D)。然而，dscaml1?/?動(dòng)物的CRHIH神經(jīng)元數(shù)量明顯更高(未配對(duì)t檢驗(yàn)，圖3E)。

除了IH，我們還在下丘腦吻側(cè)(RH)發(fā)現(xiàn)了一致的crhb表達(dá)(圖3F)。CRH神經(jīng)元在RH (CRHRH神經(jīng)元)中的作用尚不清楚，但它們可能參與了吻側(cè)下丘腦-視頂蓋通路。在5 dpf的RH中，與WT相比，dscaml1?/?動(dòng)物的CRHRH表達(dá)水平和CRHRH細(xì)胞數(shù)量都更高(未配對(duì)t檢驗(yàn)，圖3G-J)。因此，dscaml1在調(diào)節(jié)發(fā)育中的下丘腦CRH神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量方面是廣泛需要的，但dscaml1缺乏僅影響RH和NPO中crhb的表達(dá)。

圖3 dscaml1缺失改變了下丘腦中部和吻側(cè)CRH神經(jīng)元的發(fā)育。(A)幼蟲大腦示意圖，IH以橙色突出顯示。用于CRHIH神經(jīng)元分析的成像平面(淺藍(lán)色平面)所示。(B, C)用crhb FISH(綠色)標(biāo)記CRHIH神經(jīng)元，并與抗ERK1/2(洋紅色)共染色。顯示含有IH的代表性共聚焦亞層，IH(框狀區(qū)域)擴(kuò)大，顯示在沒有ERK1/2共染色的右圖中。圖B顯示W(wǎng)T腦，圖c顯示dscaml1?/?腦。(D - E)每個(gè)細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度(D)和細(xì)胞數(shù)量(E)的量化。(F)幼蟲腦示意圖，RH以粉紅色突出顯示。用于CRHRH神經(jīng)元分析的成像平面為(淺藍(lán)色平面)。(G-H)用crhb FISH(綠色)標(biāo)記CRHRH神經(jīng)元，并與抗ERK1/2(洋紅色)共染色。顯示含有RH的代表性共聚焦亞層，RH(框狀區(qū)域)放大，顯示在沒有ERK1/2共染色的右圖中。圖G顯示的是WT腦，圖h顯示的是dscaml1?/?腦。(I-J)每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度(I)和細(xì)胞數(shù)量(J)的量化。Dscaml1?/?:n = 18。標(biāo)尺尺寸為20μm。顯示了平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差和p值。

dscaml1突變體減少了下丘腦的程序性細(xì)胞死亡

已知DSCAM家族蛋白通過促進(jìn)哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜PCD減少神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。此外，我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，dscaml1突變體表達(dá)更高水平的凋亡調(diào)節(jié)基因bcl2b和pmaip1(圖1A)。因此，我們假設(shè)dscaml1缺失可能損害發(fā)育中的下丘腦的PCD。

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用抗活化的caspase 3 (AC3)抗體來標(biāo)記凋亡細(xì)胞。在野生型動(dòng)物中，我們看到神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在細(xì)胞凋亡，在3 dpf處達(dá)到峰值(圖4A-A”)，與先前使用TUNEL的結(jié)果一致。我們發(fā)現(xiàn)，與野生型同胞對(duì)照相比，dscaml1?/?動(dòng)物在3和5 dpf時(shí)ac3陽性細(xì)胞減少(圖4B-B”)。為了量化特定下丘腦區(qū)域的細(xì)胞死亡數(shù)量，我們使用Map-map計(jì)算和Z-Brain解剖圖譜。在這種方法中，單個(gè)共聚焦圖像堆棧被注冊(cè)到Z-Brain參考大腦;然后按基因型分組，使用Mann-Whitney u統(tǒng)計(jì)量(WT n = 14;dscaml1?/?n = 21)。具有顯著z分?jǐn)?shù)的體素，要么在WT中較高(WT over dscaml1)，要么在dscaml1?/?中較高(dscaml1 over WT)，被映射到感興趣的區(qū)域(ROI)，每個(gè)ROI中的平均體素值被計(jì)算并使用綠-品紅色標(biāo)度顯示(綠色:在WT中較高;品紅色:dscaml1?/?較高(圖4C)。

總的來說，與dscaml1?/?(即許多綠色區(qū)域和很少的品紅roi)相比，整個(gè)大腦的WT中AC3信號(hào)更高。在Z-Brain中注釋的293個(gè)roi中，178個(gè)具有顯著的dscaml1信號(hào)WT(平均信號(hào)=1,384.90)的體素(WT over dscaml1 sheet，補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S3)。相比之下，只有65個(gè)roi的體素在WT信號(hào)上具有顯著的dscaml1(平均信號(hào)= 84.23)(dscaml1 over WT sheet, 補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S3)。

在下丘腦crhb表達(dá)區(qū)對(duì)應(yīng)的ROI中，NPO (Z-Brain ROI:間腦- otpb Cluster 2) (dscaml1信號(hào)上的WT = 5688.06;dscaml1 over WT信號(hào)= 0)，IH(間腦-中間下丘腦)(WT over dscaml1 signal = 673.56;dscaml1信號(hào)比WT = 36.40)， RH(間腦-下丘腦吻側(cè))(dscaml1信號(hào)比WT = 916.95;dscaml1 / WT信號(hào)= 0.70)與dscaml1?/?相比，在WT中都有更高的AC3信號(hào)(圖4D-F)。總之，這些結(jié)果表明，dscaml1-/-動(dòng)物的PCD降低可能導(dǎo)致下丘腦中CRH神經(jīng)元數(shù)量增加。

dscaml1對(duì)正常的CRHNPO神經(jīng)元細(xì)胞死亡至關(guān)重要

為了進(jìn)一步確定dscaml1是否會(huì)影響下丘腦CRH神經(jīng)元的存活，當(dāng)dscaml1?/?和WT動(dòng)物之間的細(xì)胞數(shù)量開始分化時(shí)，我們使用體內(nèi)延時(shí)成像技術(shù)在3至5 dpf時(shí)追蹤了單個(gè)CRHNPO神經(jīng)元的命運(yùn)。為了可視化活斑馬魚中的CRHNPO神經(jīng)元，我們使用crispr介導(dǎo)的基因組插入生成了CRHNPO敲入熒光報(bào)告系(圖5A)。在crhb的第一個(gè)外顯子上游35個(gè)堿基對(duì)處插入一個(gè)可切換的hsp-LoxP-RFP-LoxP-GFP盒，以RFP(默認(rèn))或GFP(直接重組)的表達(dá)來標(biāo)記內(nèi)源性表達(dá)crhb的細(xì)胞(圖5B)。由此獲得的轉(zhuǎn)基因品系crhb:LoxP-RFP-LoxP-GFP (crhb:LRLG)的RFP和GFP表達(dá)模式與其他報(bào)道的內(nèi)源性crhb轉(zhuǎn)錄物表達(dá)模式相匹配(圖5C, D)。為了驗(yàn)證熒光報(bào)告基因表達(dá)的保真度，我們檢測(cè)了NPO中crhb:LRLG標(biāo)記的細(xì)胞是否表達(dá)CRH蛋白。在未暴露于Cre(默認(rèn)RFP表達(dá))的動(dòng)物中，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)RFP+神經(jīng)元呈CRH免疫陽性(84.71%±2.19%，補(bǔ)充圖2a - b)?？傊?，這些結(jié)果表明，crhb:LRLG系可靠地標(biāo)記了CRHNPO神經(jīng)元。

在crhb:LRLG動(dòng)物中，dscaml1缺失增加了RFP標(biāo)記的CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量(圖5E-F’)。發(fā)育階段和基因型之間存在顯著差異，無顯著相互作用(雙向方差分析，補(bǔ)充表SI)。dscaml1突變體在5 dpf時(shí)RFP陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，而在3 dpf時(shí)則沒有(圖5G，采用Holm-Sidak校正的多重比較檢驗(yàn))。這一結(jié)果證實(shí)了我們的crhb FISH結(jié)果，即dscaml1突變體中CRHNPO神經(jīng)元數(shù)量增加(圖2F)。

利用crhb:LRLG線，我們首次對(duì)麻醉動(dòng)物進(jìn)行了延時(shí)成像。我們?cè)?細(xì)胞期將CreER mRNA注射到crhb: LRLG動(dòng)物中，并加入4-羥基他莫昔芬(4-OHT)在6-24 hpf下激活CreER，從而誘導(dǎo)CreER部分介導(dǎo)重組(圖5B)。在3-4 dpf處，共聚焦成像可以在NPO中看到混雜的GFP+和RFP+細(xì)胞(圖5H-H”和補(bǔ)充視頻S1)。隨著時(shí)間的推移，一些被標(biāo)記的細(xì)胞離開了CRHNPO神經(jīng)元簇。正如之前在斑馬魚研究中看到的那樣，這些細(xì)胞很可能是被小膠質(zhì)細(xì)胞帶走的垂死細(xì)胞。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們?cè)谒衏rhb: LRLG標(biāo)記的細(xì)胞中誘導(dǎo)GFP表達(dá)(通過注射密碼子優(yōu)化的Cre mRNA)，并用mpeg1:mCherry轉(zhuǎn)基因標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞(圖5-i-i”和補(bǔ)充視頻S2)。事實(shí)上，mCherry+小膠質(zhì)細(xì)胞向GFP+細(xì)胞簇遷移，吞噬GFP+CRHNPO神經(jīng)元，并帶走被吞噬的細(xì)胞。在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)大液泡內(nèi)可以看到被吞噬細(xì)胞的殘余(圖5J, J′)。這種類型的吞噬事件發(fā)生在3.5-4 dpf之間的5只動(dòng)物中有3只。這些結(jié)果表明，CRHNPO神經(jīng)元經(jīng)歷了PCD，死亡細(xì)胞被小膠質(zhì)細(xì)胞迅速移除。

圖5 CRHNPO神經(jīng)元的熒光標(biāo)記和實(shí)時(shí)成像。(A) CRISPR介導(dǎo)的hsp-Lox-RFP-Lox-GFP盒在位于crhb外顯子1上游35bp的sgRNA靶點(diǎn)上的敲入示意圖。插入的方向和連接結(jié)構(gòu)尚未確定。(B) crhb:LRLG表達(dá)示意圖。每個(gè)圓圈代表一個(gè)熒光細(xì)胞。沒有Cre(默認(rèn))，RFP在所有細(xì)胞中表達(dá)。完全重組后，所有細(xì)胞均表達(dá)GFP。部分重組導(dǎo)致了馬賽克RFP和GFP標(biāo)記。(C)部分重組的固定5 dpf crhb:LRLG幼蟲的背視圖，用抗rfp(品紅色)和抗gfp(綠色)染色。框內(nèi)區(qū)域標(biāo)記NPO。(D) NPO的高倍圖像。RFP和gfp陽性神經(jīng)元均可見。(E-F’)未重組的抗rfp染色crh:LRLG動(dòng)物圖像。圖中顯示了代表性的WT (E-E ')和dscaml1?/?(F-F ') NPO神經(jīng)元。(G) rfp陽性細(xì)胞在3和5 dpf時(shí)的定量。WT: n = 5 (3 dpf)， 16 (5 dpf)。dscaml1?/?:n = 11 (3 dpf)， 17 (5 dpf)。顯示了平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差和校正后的p值。(H-H”)部分重組的crhb:LRLG活幼蟲在72 ~ 84 hp成象。這里顯示了三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。兩個(gè)細(xì)胞(箭頭，一個(gè)綠色，一個(gè)洋紅色)隨著時(shí)間的推移而消失。(I-I ")活體crhb:LRLG;mpeg1:Gal4;UAS:NTR-mCherry幼蟲，帶有GFP(綠色)標(biāo)記的CRH神經(jīng)元和mCherry(品紅)標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞。在這個(gè)圖像系列中，一個(gè)CRH神經(jīng)元(箭頭)被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬(I ')，然后被移除(I ')。圖像是共聚焦光學(xué)切片。(J, J ')顯示(I ')中框框區(qū)域的放大視圖的面板，有(J)或沒有(J ') mCherry通道。小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)仍能看到CRH神經(jīng)元的殘余(箭頭)。比例尺尺寸為100 μm (C圖)或20μm(其他圖)。

接下來，為了追蹤單個(gè)CRHNPO神經(jīng)元的命運(yùn)，我們對(duì)部分cre介導(dǎo)重組的crhb:LRLG動(dòng)物進(jìn)行了3至5 dpf的雙光子成像(圖6A)。為了盡量減少應(yīng)激對(duì)PCD的潛在影響，我們?cè)诔上衿陂g對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉和固定。在成像期間，允許每只動(dòng)物在正常的光暗循環(huán)下，在12孔板的單個(gè)孔中恢復(fù)。在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(78 hpf)出現(xiàn)的細(xì)胞在隨后的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(84、96、108和120 hpf)被跟蹤，并被分類為持續(xù)(在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn))或丟失(在以下任何時(shí)間點(diǎn)丟失)(圖6B-B“)?？傮w而言，我們觀察到dscaml1+/?和dscaml1?/?動(dòng)物中細(xì)胞損失減少的趨勢(shì)(卡方檢驗(yàn)趨勢(shì)，p = 0.0398)(圖6C，所示的跟蹤細(xì)胞總數(shù))。在WT動(dòng)物中，16.41%的細(xì)胞丟失，而dscaml1+/-和dscaml1-/-分別為10.91%和7.53%。

最后，考慮到細(xì)胞丟失的時(shí)間，我們繪制了每種基因型CRHNPO神經(jīng)元的存活曲線。同樣，在細(xì)胞丟失的趨勢(shì)上存在顯著差異(Logrank檢驗(yàn)趨勢(shì)，p=0.0098)， dscaml1?/?動(dòng)物一致顯示出更高的存活率(圖6D)。綜上所述，這些結(jié)果表明dscaml1缺失降低了CRHNPO神經(jīng)元的PCD。

圖6 CRHNPO神經(jīng)元細(xì)胞命運(yùn)的實(shí)時(shí)跟蹤。(A)延時(shí)雙光子(2P)成像實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸。4-OHT在6-24 hpf下誘導(dǎo)crhb:LRLG部分重組，并在78、84、96、108和120 hpf下進(jìn)行成像。動(dòng)物在成像期間被短暫麻醉，并在成像期間恢復(fù)。(B-B”)單個(gè)CRHNPO神經(jīng)元的跟蹤。下面給出了三個(gè)時(shí)間框架示例。單個(gè)熒光細(xì)胞可以隨時(shí)間跟蹤，并分為兩類:持續(xù)(白色箭頭)或丟失(粉紅色箭頭)。標(biāo)尺尺寸為20μm。(C)保留和丟失的CRHNPO神經(jīng)元百分比的量化。每種基因型的樣本量(細(xì)胞數(shù))。(D)各基因型組CRHNPO神經(jīng)元個(gè)體存活曲線。

應(yīng)激軸功能在dscaml1突變動(dòng)物中受到干擾

考慮到下丘腦CRH神經(jīng)元的發(fā)育擾動(dòng)以及與應(yīng)激軸激活相關(guān)的基因表達(dá)的全局變化，我們接下來確定應(yīng)激軸的激素輸出-皮質(zhì)醇-是否被改變。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)5只dpf動(dòng)物(每個(gè)樣本30只動(dòng)物，每種條件6個(gè)樣本)的勻漿進(jìn)行皮質(zhì)醇水平測(cè)定。所有動(dòng)物均在標(biāo)準(zhǔn)化條件下，以相同的密度飼養(yǎng)，并具有正常的晝夜周期(14 h晝/10 h夜)。在這種晝夜節(jié)律周期下，dscaml1突變動(dòng)物表現(xiàn)出與野生型動(dòng)物相似的晝夜運(yùn)動(dòng)節(jié)律。

在5 dpf時(shí)，對(duì)基線和應(yīng)激條件進(jìn)行測(cè)試，以評(píng)估對(duì)照組(WT和dscaml1+/?)和dscaml1?/?組中皮質(zhì)醇的潛在變化。為了測(cè)量基線皮質(zhì)醇，我們?cè)诠庹蘸?0分鐘(授時(shí)時(shí)間0,ZT0)和下午(ZT6-8)收集了未受干擾的動(dòng)物。為了測(cè)量應(yīng)激誘導(dǎo)的皮質(zhì)醇，將動(dòng)物暴露在ZT6-8的攪拌應(yīng)激(旋轉(zhuǎn)水，5分鐘)或高滲應(yīng)激(250 mM NaCl, 20分鐘)中。這些急性應(yīng)激源具有良好的特征，可與斑馬魚幼蟲在自然棲息地中經(jīng)歷的水流和鹽度變化相媲美。

在基線時(shí)，dscaml1?/?動(dòng)物的皮質(zhì)醇水平明顯高于對(duì)照動(dòng)物(多重曼-惠特尼檢驗(yàn)，霍爾姆-西達(dá)克校正)。調(diào)整后的p值如圖7A所示。在ZT0時(shí)，dscaml1突變體的基線皮質(zhì)醇水平比對(duì)照組高2.7倍(中位數(shù)為350.06 pg/mL對(duì)129.80 pg/mL)。在ZT6-8時(shí)，皮質(zhì)醇的差異不太明顯，但dscaml1突變體在基線時(shí)的皮質(zhì)醇水平仍比對(duì)照組高2倍(中位數(shù)為238.51 pg/mL對(duì)118.52 pg/mL)。

在急性暴露于應(yīng)激源后，我們發(fā)現(xiàn)dscaml1突變動(dòng)物表現(xiàn)出減弱的皮質(zhì)醇誘導(dǎo)。我們通過將皮質(zhì)醇水平正?；较嗤蛐驮谙嗤瑫円箷r(shí)間(ZT6-8)的基線皮質(zhì)醇水平來評(píng)估應(yīng)激誘導(dǎo)皮質(zhì)醇產(chǎn)生的程度。在對(duì)照組中，攪拌應(yīng)激和高滲應(yīng)激分別使皮質(zhì)醇比對(duì)照基線增加1.88倍和1.95倍(灰色條形圖，圖7B)(未歸一化的皮質(zhì)醇數(shù)據(jù)見補(bǔ)充圖S3)。對(duì)高滲脅迫的響應(yīng)(p = 0.0113, Multiple Mann-Whitney test with Holm-Sidak correction)比攪拌脅迫產(chǎn)生的響應(yīng)更強(qiáng)(p = 0.0546)。在dscaml1?/?組中，攪拌應(yīng)激和高滲應(yīng)激分別僅使皮質(zhì)醇比dscaml1?/?基線增加1.29倍和1.4倍(紅條，圖7B)。這些增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(攪拌脅迫p >0.9999，高滲脅迫p = 0.9768)。

總之，這些結(jié)果表明，dscaml1缺乏會(huì)提高皮質(zhì)醇的基線水平，損害對(duì)急性應(yīng)激源的反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明dscaml1對(duì)于建立應(yīng)力軸的正常功能至關(guān)重要。

圖7皮質(zhì)醇水平和對(duì)外源性糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)。(A-B) 5只dpf幼蟲的皮質(zhì)醇譜。對(duì)于每個(gè)樣本(點(diǎn))，皮質(zhì)醇是從30只動(dòng)物的池中提取的。各組N=6。顯示了中位數(shù)、四分位數(shù)范圍和校正后的p值。(A)對(duì)照組(黑色)和dscaml1?/?(紅色)動(dòng)物的基線皮質(zhì)醇。(B)對(duì)照(黑色)和dscaml1?/?(紅色)動(dòng)物基線標(biāo)準(zhǔn)化皮質(zhì)醇折疊變化。(C)定量CRHNPO神經(jīng)元中每個(gè)細(xì)胞的crhb信號(hào)強(qiáng)度。載體:n=10 (WT)， 11 (dscaml1?/?)。Dex: n=7 (WT)，11 (dscaml1?/?)。顯示了平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差和校正后的p值。

dscaml1突變體對(duì)糖皮質(zhì)激素有反應(yīng)

dscaml1突變體中應(yīng)激軸相關(guān)表型的某些方面類似于斑馬魚糖皮質(zhì)激素受體(gr)突變體。特別是，gr和dscaml1突變體都表現(xiàn)出升高的基線皮質(zhì)醇和crhb。這種相似性提出了一種可能性，即dscaml1突變表型可能是由于糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)不足造成的。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們研究了dscaml1突變體是否能對(duì)外源性糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。我們檢查了crhb在NPO中的表達(dá)，因?yàn)樗艿教瞧べ|(zhì)激素-糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)的反饋控制。野生型組作為對(duì)照。

將合成的糖皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑地塞米松(dexamethasone, Dex)以2 μM的終濃度添加到胚胎培養(yǎng)基中，從4到5 dpf (24 h)。用載體(0.02%乙醇)處理的兄弟姐妹進(jìn)行比較。對(duì)于CRHNPO神經(jīng)元中crhb轉(zhuǎn)錄水平，我們發(fā)現(xiàn)Dex處理和基因型導(dǎo)致了顯著差異，兩者之間存在顯著的相互作用(雙向方差分析，補(bǔ)充表SI)。多次比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Dex顯著降低了dscaml1?/?動(dòng)物的crhb轉(zhuǎn)錄物水平，但在野生型動(dòng)物中沒有(Holm-Sidak校正，圖7C, p值如所示)。這些結(jié)果表明，dscaml1缺乏不會(huì)導(dǎo)致CRHNPO神經(jīng)元糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性的喪失。相反，dscaml1缺乏可能使動(dòng)物對(duì)糖皮質(zhì)激素的抑制作用更敏感。

討論

本研究證明dscaml1調(diào)節(jié)下丘腦CRH神經(jīng)元的發(fā)育，是正常應(yīng)激軸功能所必需的。在轉(zhuǎn)錄組水平上，斑馬魚的dscaml1缺乏導(dǎo)致基因表達(dá)變化，表明應(yīng)激軸過度激活。在細(xì)胞水平上，我們發(fā)現(xiàn)dscaml1?/?下丘腦CRH神經(jīng)元增加應(yīng)激軸相關(guān)神經(jīng)肽(crhb)表達(dá)，增加細(xì)胞數(shù)量，減少細(xì)胞死亡。在生理上，dscaml1缺乏會(huì)損害正常的神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激軸功能，這可能是由下丘腦CRH神經(jīng)元發(fā)育缺陷以及激素/神經(jīng)肽信號(hào)的全身性改變引起的?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)將DSCAML1與壓力軸的發(fā)展聯(lián)系起來，并為人類DSCAML1相關(guān)精神健康狀況的潛在病因?qū)W提供了新的線索。

DSCAML1是一種新的CRH神經(jīng)元發(fā)育的細(xì)胞間信號(hào)分子

本研究的一個(gè)主要發(fā)現(xiàn)是DSCAML1是下丘腦CRH神經(jīng)元發(fā)育所必需的。據(jù)我們所知，DSCAML1是第一個(gè)與CRH神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)的細(xì)胞間信號(hào)分子。我們的發(fā)現(xiàn)也提供了DSCAML1和下丘腦發(fā)育之間的第一個(gè)聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)，與視網(wǎng)膜神經(jīng)元類似，PCD對(duì)下丘腦CRH神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)是一個(gè)dscaml1介導(dǎo)的過程。需要進(jìn)一步的研究來確定DSCAML1功能的其他方面，如細(xì)胞間距和突觸發(fā)生的調(diào)節(jié)，是否參與CRH神經(jīng)元的發(fā)育。此外，考慮到dscaml1在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，包括CRH神經(jīng)元和非CRH神經(jīng)元(補(bǔ)充圖S4)，解決DSCAML1是否在CRHNPO神經(jīng)元中細(xì)胞自主作用將是重要的。

DSCAML1對(duì)CRH神經(jīng)元細(xì)胞死亡的調(diào)控

在發(fā)育過程中，PCD對(duì)于消除瞬態(tài)細(xì)胞類型、匹配輸入和輸出細(xì)胞種群以及保持細(xì)胞間距至關(guān)重要。據(jù)推測(cè)，下丘腦的PCD可能指定神經(jīng)回路組裝和形狀輸出活動(dòng)。與這一觀點(diǎn)一致的是，早期生活壓力導(dǎo)致的下丘腦PCD降低與成年后對(duì)急性壓力源的敏感性增加有關(guān)。

作為細(xì)胞間信號(hào)分子，DSCAML1可能轉(zhuǎn)導(dǎo)PCD的細(xì)胞外信號(hào)。一個(gè)潛在的線索是突觸活動(dòng)，這對(duì)神經(jīng)元在發(fā)育過程中的存活至關(guān)重要。在培養(yǎng)中，DSCAML1定位于興奮性突觸，當(dāng)過表達(dá)時(shí)抑制興奮性突觸發(fā)生。在CRH神經(jīng)元中，DSCAML1缺失是否會(huì)增加興奮性突觸傳遞并激活活性依賴性細(xì)胞存活通路仍有待確定。

值得注意的是，CRH神經(jīng)元細(xì)胞死亡可能不是dscaml1影響CRH神經(jīng)元數(shù)量的唯一機(jī)制。我們?cè)赿scaml1突變體中觀察到，神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量或增殖能力的變化可能有助于CRH神經(jīng)元數(shù)量的增加。此外，dscaml1缺失導(dǎo)致的crhb高表達(dá)可能導(dǎo)致更多的細(xì)胞被鑒定為CRH神經(jīng)元。需要進(jìn)一步的工作來確定這些因素在發(fā)育過程中如何控制CRH神經(jīng)元數(shù)量。

DSCAML1缺陷動(dòng)物的應(yīng)激軸功能障礙

dscaml1?/?動(dòng)物在基線時(shí)表現(xiàn)出應(yīng)激軸激活的多種跡象，包括皮質(zhì)醇升高和免疫相關(guān)基因的抑制?；€皮質(zhì)醇水平升高可能導(dǎo)致對(duì)急性應(yīng)激源的反應(yīng)減弱，類似于慢性皮質(zhì)醇管理下的動(dòng)物。這些表型的一個(gè)可能原因是crhb的過度表達(dá)。在小鼠中，CRH的廣泛過度表達(dá)導(dǎo)致皮質(zhì)酮(嚙齒動(dòng)物的應(yīng)激糖皮質(zhì)激素)升高，并產(chǎn)生與庫欣綜合征相似的表型，庫欣綜合征是一種由皮質(zhì)醇過量產(chǎn)生引起的人類疾病。

除了下丘腦神經(jīng)元和CRH信號(hào)的功能障礙外，更廣泛的神經(jīng)失衡也可以激活應(yīng)激軸。例如，癲癇發(fā)作已被證明會(huì)激活下丘腦軸，從而增加未來癲癇發(fā)作的可能性。據(jù)報(bào)道，Dscaml1突變大鼠和DSCAML1功能喪失變異體的人類患者表現(xiàn)出神經(jīng)元過度激活和癲癇發(fā)作。因此，在斑馬魚dscaml1突變體中，下丘腦外區(qū)域的興奮-抑制不平衡可能導(dǎo)致下丘腦CRH神經(jīng)元放電增加。需要進(jìn)一步研究dscaml1的細(xì)胞類型特異性功能，以了解dscaml1?/?動(dòng)物應(yīng)激軸過度激活的確切原因。

皮質(zhì)醇信號(hào)與CRH神經(jīng)元發(fā)育之間的相互作用

促進(jìn)和反饋是應(yīng)力軸的特征。當(dāng)CRH神經(jīng)元控制皮質(zhì)醇水平時(shí)，皮質(zhì)醇信號(hào)也影響CRH神經(jīng)元的發(fā)育。斑馬魚基因突變體具有與dscaml1-/-動(dòng)物相似的表型，包括緩慢的視覺背景適應(yīng)、緩慢的光起反應(yīng)、升高的皮質(zhì)醇和增加的crhb表達(dá)。令人驚訝的是，dscaml1-/-動(dòng)物的糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)并沒有減少(如在突變體中)，而是具有完整的糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)，地塞米松對(duì)NPO中的crhb表達(dá)有很強(qiáng)的抑制作用。因此，盡管表面上的表型相似，潛在的信號(hào)機(jī)制在dscaml1和gr突變體之間是不同的。

鑒于DSCAML1在調(diào)節(jié)突觸形成中的已知作用，crhb表達(dá)的增加可能是由上游應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)輸入的過度激活引起的。在嚙齒類動(dòng)物中，各種慢性應(yīng)激模式通常會(huì)導(dǎo)致PVN中CRH的上調(diào)。應(yīng)激相關(guān)突觸活動(dòng)引起的轉(zhuǎn)錄激活可能克服了糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)介導(dǎo)的負(fù)反饋。需要進(jìn)一步的工作來澄清皮質(zhì)醇紊亂和發(fā)育缺陷之間的關(guān)系。一種可能的方法是通過基因消融腎間細(xì)胞(即，基因腎上腺切除術(shù))和補(bǔ)充恒定水平的外源性皮質(zhì)醇來使皮質(zhì)醇水平正?；?/span>

結(jié)語

總之，本研究表明DSCAML1在調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激軸的下丘腦神經(jīng)元的發(fā)育中是不可或缺的。我們將斑馬魚作為應(yīng)激軸發(fā)生的脊椎動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)dscaml1的缺失會(huì)導(dǎo)致CRH神經(jīng)元缺陷和應(yīng)激軸功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致人們承受及調(diào)節(jié)壓力的能力失衡，導(dǎo)致抑郁和焦慮的發(fā)生。這項(xiàng)研究不僅揭示了壓力誘發(fā)抑郁焦慮的潛在機(jī)制途徑，也為多種精神疾病的治療帶來新的探索方向（包括智力障礙、自閉癥譜系障礙、精神分裂癥、癲癇和應(yīng)激障礙等疾病中均發(fā)現(xiàn)了DSCAML1缺陷，這些疾病的發(fā)生可能同樣和應(yīng)激軸的發(fā)育缺陷有關(guān)）。

基金：本項(xiàng)目由聯(lián)邦研究商業(yè)化基金(ER14S-001LS to YAP)、弗吉尼亞-馬里蘭獸醫(yī)學(xué)院校內(nèi)研究基金、聯(lián)邦衛(wèi)生研究委員會(huì)撥款(# 208-06-21 to YAP)、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(R01MH131820)和弗吉尼亞理工大學(xué)資助。