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前言

內(nèi)分泌和代謝性疾病的患病率逐年增加，已成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。由于這些疾病是包括遺傳和環(huán)境因素在內(nèi)的復雜疾病，并且沒有明確的治療方法，因此醫(yī)學界一直在尋找新的應對機制。

內(nèi)分泌和代謝性疾病機制的研究很大程度上依賴于相關(guān)動物模型的構(gòu)建，小鼠是最早開始應用的動物模型。然而利用小鼠進行實驗時，往往需要較大樣本量且需考慮相關(guān)倫理問題，所以尋找一種低等生物替代迫在眉睫，而斑馬魚則更符合動物實驗的“3R”原則。隨著全基因測序出現(xiàn)，斑馬魚與人類基因相似性較高，斑馬魚替代小鼠成為研究基因功能與內(nèi)分泌及代謝性疾病的優(yōu)良模型，如：肥胖、糖尿病、高血壓、脂肪肝等。

圖1 斑馬魚作為代謝和內(nèi)分泌疾病的模型

圖源|Arjmand B, Tayanloo-Beik A, Foroughi Heravani N, et al. Zebrafish for personalized regenerative medicine; a more predictive humanized model of endocrine disease[J]. Frontiers in Endocrinology, 2020, 11: 396.

斑馬魚模型在內(nèi)分泌及代謝疾病研究中的應用

斑馬魚模型在糖尿病研究中的應用

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起。糖尿病病因復雜，致病機制尚不完全明確，動物模型有助于了解糖尿病疾病進程和研發(fā)藥物。而斑馬魚模型具有其他動物模型所不具備的諸多優(yōu)勢，非常適合人類疾病研究。目前使用的糖尿病斑馬魚模型主要包括誘發(fā)性、自發(fā)性和基因修飾性模型等。此外，斑馬魚胰腺的基本結(jié)構(gòu)和功能與成年哺乳動物胰腺高度相似，斑馬魚還能使胰腺再生，目前已被用于研究1型糖尿?。?/span>T1DM）和2型糖尿病（T2DM）的發(fā)病機制。

T1DM是由于免疫介導或特發(fā)性胰島β細胞破壞，導致胰島素絕對缺乏。根據(jù)誘導β細胞減少的模式不同，可分為藥物誘導性和基因修飾誘導性T1DM模型。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）和四氧嘧啶（alloxan）可誘導胰腺β細胞凋亡，已應用于多種糖尿病實驗動物模型。此外，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，可在一定條件下靶向編輯基因，使斑馬魚達到高血糖狀態(tài)。有研究人員利用大腸桿菌的硝基還原酶基因（nitroreductase，NTR），構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（T2Kins：nfsB-mCherry），該斑馬魚胰腺β細胞表達NTR和mCherry的融合熒光蛋白，用甲硝唑（metronidazole，MTZ）處理轉(zhuǎn)基因魚，無毒性的MTZ被NTR還原為細胞毒性的代謝產(chǎn)物，特異性致死胰腺β細胞，最終引起血糖升高。

T2DM的主要特點是胰島素抵抗和β細胞胰島素分泌缺陷。T2DM斑馬魚模型可分為誘發(fā)性模型和自發(fā)性模型。成年斑馬魚的平均空腹血糖水平74±8.5mg/dl，高于三倍正常值被認為是高血糖（＞200mg/dI）。研究人員用2%和0%的葡萄糖溶液交替浸泡28天，通過高糖暴露法建立斑馬魚糖尿病模型，最終斑馬魚血糖呈波動性升高，合并視網(wǎng)膜病變。為了開發(fā)胰島素抵抗轉(zhuǎn)基因模型，使用CRISPR/Cas9特異性地敲低肝臟Tg中的胰島素受體（actb2：Cas9；(U6x：sgRNA（insra/b））），引起進食后高血糖和禁食時低血糖。最近，除了破壞β細胞并研究其再生外，還提出了另一種策略，即建立胰島炎癥模型（據(jù)報道，胰島炎癥參與了糖尿病的發(fā)病機制）并了解其保護機制。由于白細胞介素-1β（IL-1β）在炎癥中起關(guān)鍵作用，Tg（ins：il1b）斑馬魚被用來鑒定導致β細胞功能障礙及其后續(xù)后果（如高血糖）的潛在過程。此外，具有抗炎作用的天然產(chǎn)物wedellactone治療可以減少β細胞炎癥和免疫細胞的浸潤。因此，這項研究為研究β細胞功能障礙及其相關(guān)疾病的潛在治療方法打開了一扇新的窗口。

此外，斑馬魚胰腺的結(jié)構(gòu)、功能和糖代謝調(diào)控等與哺乳動物高度保守，已經(jīng)廣泛應用于胰腺發(fā)育生物學研究、不同類型糖尿病及其并發(fā)癥研究，以及糖尿病新藥篩選、藥物毒性等領(lǐng)域。多樣化的糖尿病斑馬魚模型仍在不斷構(gòu)建中，將在糖尿病疾病研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。

斑馬魚模型在肥胖研究中的應用

肥胖（obesity）是糖尿病、心血管疾病、癌癥等慢性疾病的重要危險因素，全球現(xiàn)約有20億人處于肥胖或超重的狀態(tài)，肥胖率高達39%。全球疾病負擔數(shù)據(jù)表明，到2025年，將有近4億的兒童和青少年處于超重或肥胖狀態(tài)。中國超重和肥胖的人數(shù)逐年增加，很大程度上解釋了慢性病在社會經(jīng)濟負擔中所占比例越來越大。目前構(gòu)建斑馬魚肥胖模型通常有兩種方法：（1）喂養(yǎng)誘發(fā)斑馬魚肥胖模型；（2）應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建斑馬魚肥胖模型。

人類是由于能量攝入過多導致脂肪堆積進而形成肥胖，因此通過喂養(yǎng)誘發(fā)構(gòu)建斑馬魚肥胖模型與人類更為接近。目前，喂養(yǎng)誘發(fā)斑馬魚模型主要有以下4種：正常飼料、高脂肪、高膽固醇和高蛋白，不同喂養(yǎng)誘發(fā)模型比較見圖2。飲食成功誘導的斑馬魚肥胖模型并沒有具體標準，大多數(shù)研究認為斑馬魚出現(xiàn)相關(guān)表型：體長增長、體重增加、BMI增高、脂肪肝等，則認為造模成功。

圖2 飲食誘發(fā)斑馬魚肥胖模型

圖源|劉露, 楊志康, 楊曉彤, 等. 斑馬魚肥胖模型的構(gòu)建及在降脂物質(zhì)中應用進展[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2021.

肥胖是一種成因復雜的疾病，越來越多的證據(jù)表明肥胖受到基因的調(diào)控。鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子效應核酸酶（TALENs）以及成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列（CRISPR/Cas9）等基因編輯技術(shù)已被廣泛應用于人類疾病研究。CRISPR/Cas9技術(shù)為構(gòu)建斑馬魚突變體提供了更高效的實驗手段，進一步為斑馬魚研究肥胖機制及藥物篩選提供實驗基礎(chǔ)。此外，也有將微核糖核酸結(jié)構(gòu)（miR-SP）技術(shù)應用于斑馬魚，幼魚表現(xiàn)出高脂血癥，肝脂肪變性和白色脂肪組織明顯增多。肥胖是一種復雜代謝性疾病，斑馬魚肥胖相關(guān)基因見圖3?；蚓庉嬎鶚?gòu)建肥胖斑馬魚的測量標準：通常取肝臟組織染色觀察、測量生化指標(甘油三酯、總膽固醇）以及肥胖基因表達水平，實驗組與對照組比較后，如出現(xiàn)明顯差異時，則認為該模型構(gòu)建具有意義。

圖3 斑馬魚轉(zhuǎn)基因肥胖模型

圖源|劉露, 楊志康, 楊曉彤, 等. 斑馬魚肥胖模型的構(gòu)建及在降脂物質(zhì)中應用進展[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2021.

斑馬魚模型在脂肪肝研究中的應用

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝臟中脂質(zhì)過度積累的結(jié)果，可導致 NASH、肝硬化和癌癥。已證實 nafld 與肥胖和胰島素抵抗有關(guān)，但其進展機制仍不清楚。為了進一步研究，有一些斑馬魚突變體被使用，例如導管系，s-腺苷同型半胱氨酸水解酶（AHCY）的突變，這是一種參與甲基化反應的基本代謝酶，顯示肝臟變性和肝臟脂肪變性。AHCY 缺乏 癥（一種罕見的遺傳疾?。┗颊卟粌H有肝功能障礙，而且在腦功能方面也有一些損傷，因此，該模型有助于為患者確定新的治療方案。此外，各種轉(zhuǎn)基因工具可用于研究肝細胞類型，甚至脂肪細胞，以更好地了解 NAFLD 的發(fā)病機制。因此，斑馬魚作為一個強大的模型和系統(tǒng)來探索導致 NAFLD 的途徑，并揭示關(guān)鍵部分。

此外，斑馬魚的垂體與人類相似，分為神經(jīng)垂體和腺垂體，腺垂體可以分辨出 ９ 種細胞類型，并可釋放相應的激素。另外斑馬魚中葉存在下丘腦-垂體-甲狀腺軸、下丘腦-垂體-腎上腺軸的反饋調(diào)節(jié)。說明斑馬魚模式生物在內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)中將有著巨大的科研應用前景，隨著各項技術(shù)的不斷更新和完善，相信有關(guān)內(nèi)分泌系統(tǒng)的發(fā)育和疾病的發(fā)生機制將得到更好的闡述。

結(jié)語

得益于斑馬魚模型，近年來人類疾病領(lǐng)域的研究有了顯著的進展。如今，利用斑馬魚進行精準醫(yī)學研究，特別是在內(nèi)分泌疾病方面，正在迅速興起。同時，斑馬魚模型在可視化方法、基因靶向和化學藥物篩選方面的優(yōu)勢可以助力未來臨床醫(yī)學的研究發(fā)展。