国际完美世界下载,管理书籍排行榜

0512-8957 3668 / 18013764755

腎病科 | 斑馬魚模型在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

來源:陳朝紅, 劉志紅. 模式動物斑馬魚在腎臟疾病研究中的應(yīng)用[J]. 腎臟病與透析腎移植雜志, 2016, 25(2): 159. | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時間: 2023-07-22 | 1483 次瀏覽 | 分享到:

《柳葉刀》（Lancet）公布的一份數(shù)據(jù)顯示，中國慢性腎臟病患病人數(shù)達(dá)1.3億，也就是全國平均每10人里面就有一名慢性腎臟病患者，慢性腎臟病近年也逐漸脫離了所謂“老人病”的印象，年輕化趨勢越來越明顯。

前言

由于哺乳動物胚胎于體內(nèi)發(fā)育，腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以研究，人們對于腎臟發(fā)生和腎單位結(jié)構(gòu)分段的過程和機(jī)制了解較少。而斑馬魚腎臟在結(jié)構(gòu)、功能和分子組成上均與人類腎臟相似，且斑馬魚具有獨(dú)特的生理特征，如體外受精和體外發(fā)育，胚胎透明等，為人類腎臟發(fā)育和腎臟疾病的研究提供了可視化窗口。接下來，本文從斑馬魚在腎臟領(lǐng)域研究中的應(yīng)用對其進(jìn)行介紹，重點(diǎn)介紹斑馬魚在腎臟發(fā)育、腎小球疾病、急性腎損傷( AKI)和腎臟再生、多囊性腎病等領(lǐng)域中的應(yīng)用及進(jìn)展。

斑馬魚胚胎前腎結(jié)構(gòu)(背側(cè)觀)

圖源 | 文獻(xiàn)《斑馬魚在急性腎損傷研究中的應(yīng)用進(jìn)展》

斑馬魚模型在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

斑馬魚模型在腎小球疾病研究中的應(yīng)用

腎臟的發(fā)育和行使功能需要固有細(xì)胞協(xié)調(diào)作用，足細(xì)胞在腎小球毛細(xì)血管袢的形成中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)和功能完整的主要細(xì)胞之一，足細(xì)胞損傷與蛋白尿水平和腎小球硬化密切相關(guān)。Zhou 等和 Huang 等構(gòu)建了可誘導(dǎo)性損傷足細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型(pod：NTR-mCherry)，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚足細(xì)胞上高表達(dá)硝基還原酶(pod：NTR-mCherry)，在含有甲硝唑(MTZ)的溶液中時，硝基還原酶將甲硝唑的硝基還原為具有細(xì)胞毒性的氨基代謝物，特異性誘導(dǎo)表達(dá)硝基還原酶的足細(xì)胞損傷，斑馬魚出現(xiàn)嚴(yán)重足突融合，足細(xì)胞凋亡，隨著腎小球?yàn)V過屏障破壞，斑馬魚出現(xiàn)蛋白尿，眼周和心包水腫。這些表型與足細(xì)胞損傷的嚙齒類動物模型和人類腎病綜合征患者表型高度一致，進(jìn)一步支持了斑馬魚作為腎病動物模型的有效性。

此外，Gee 等應(yīng)用外顯子測序和純合子定位技術(shù)(homozygosity mapping and whole-exome sequencing)發(fā)現(xiàn)上皮膜蛋白 2 突變(EMP2) 單基因突變可致腎病綜合征。有研究人員應(yīng)用基因組編輯核酸酶TALEN 技術(shù)在對斑馬魚 EMP2 突變體的研究中，發(fā)現(xiàn) emp2 缺失可上調(diào)腎小球內(nèi)窖蛋白 1(Caveolin-1)的表達(dá)，并加重 MTZ 誘導(dǎo)的 NTR 轉(zhuǎn)基因魚的損傷。在足細(xì)胞上特異性高表達(dá)窖蛋白 1，能夠重現(xiàn) emp2斑馬魚突變體的表型，激素類藥物能減少 Caveolin-1基因在足細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而改善 emp2 突變體中足細(xì)胞損傷和蛋白尿。提示 Caveolin-1 基因可能是一個新的治療腎病綜合征和足細(xì)胞損傷的藥物靶點(diǎn)。

斑馬魚模型還是強(qiáng)大的高通量基因功能篩選評價(jià)平臺。在組學(xué)時代，腎小球?yàn)V過屏障功能或蛋白尿發(fā)生相關(guān)的基因不斷被發(fā)現(xiàn)。通過 morpholino 瞬時抑制斑馬魚基因表達(dá)，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)核孔蛋白107(Nucleoporin 107 kD，NUP107)，KANK (KN Motif And Ankyrin Repeat Domains)，TMEM234(Transmembrane Protein 234 )，鼠雙微體2( Murine double minute-2，MDM2 )，發(fā)動蛋白2(dynamin2)，Rho-GTPase 結(jié)合蛋白 IQGAP2 (IQ Motif Containing GTPase Activating Protein 2)，載脂蛋白L1 (APOL1)，ADCK4 (AarF Domain Containing Kinase 4)，ARHGDIA［Ｒho GDP Dissociation Inhibitor (GDI) Alpha］，Fan1 (FANCD2 /FANCI-Associated Nuclease 1)等基因缺失可模擬人類腎病表型。Morpholino 的結(jié)果還需要在斑馬魚基因突變體中進(jìn)一步驗(yàn)證，Sanger 斑馬魚基因組突變計(jì)劃顯示，只有約 20% morpholino 表型可在突變體中得到證實(shí)。得益于 CRISPR/Cas9 等基因組編輯技術(shù)的進(jìn)步，研究人員能夠更加迅速且準(zhǔn)確地編輯基因靶標(biāo)。

斑馬魚在 AKI 和腎臟再生研究中的應(yīng)用

AKI 是一種常見的臨床綜合征。Hentschel等首次建立了斑馬魚 AKI 模型，應(yīng)用慶大霉素或順鉑注射 50hpf 或 72hpf 的斑馬魚胚胎的心臟靜脈竇，可劑量依賴性誘導(dǎo)斑馬魚模型出現(xiàn)眼周和心包水腫，腎小球和腎小管擴(kuò)張，隨后脫落的上皮細(xì)胞堵塞管腔，造成梗阻；超微結(jié)構(gòu)可觀察到腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)溶酶體增加，這是氨基糖甙類藥物腎損傷的典型病理特征。在慶大霉素腎損傷斑馬魚血管內(nèi)注入菊粉或 10 kD 熒光素標(biāo)記葡聚糖，可發(fā)現(xiàn)斑馬魚菊粉清除率和近端腎小管重吸收葡聚糖能力明顯減弱，慶大霉素誘導(dǎo)的上述斑馬魚腎損傷表型與人AKI 的臨床表現(xiàn)相似。

目前，人們對 AKI 損傷后腎單位再生情況所知甚少。腎損傷分子 1(KIM-1) 是 T 細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子 4(TIMD4) 和甲型肝炎病毒的膜受體，在急性和慢性腎損傷情況下，近曲小管 KIM-1表達(dá)上調(diào)。斑馬魚的 KIM 家族包含 KIM-1，KIM-3和 KIM-4。Yin 等研究顯示，持續(xù)的 KIM-1 表達(dá)可通過 mTOR 通路導(dǎo)致斑馬魚慢性腎損害。慶大霉素誘導(dǎo)的斑馬魚腎臟急性損傷中，KIM-1 表達(dá)明顯上調(diào)，并且伴斑馬魚的生長抑制，斑馬魚腎小管組成型或誘導(dǎo)性表達(dá) Kim-1 可致小管刷狀緣脫落，GFR 降低，心包水腫，魚生長減緩和死亡率增加。由于 KIM-1 表達(dá)可激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 通路，研究人員應(yīng)用雷帕霉素抑制 mTOR信號通路可明顯提高斑馬魚模型的生存率。

視黃酸已應(yīng)用于 AKI 模型的治療，可減組織損傷和纖維化，但具體機(jī)制不明，

Chiba 等發(fā)現(xiàn)在小鼠和斑馬魚 AKI 模型中，視黃酸信號通路被激活，激活的視黃酸信號可影響 M1 和 M2 型巨噬細(xì)胞平衡。M1 型巨噬細(xì)胞參與促炎反應(yīng)，且在宿主防御細(xì)菌和病毒感染中發(fā)揮核心作用。M2 巨噬細(xì)胞與抗炎反應(yīng)、組織重構(gòu)、纖維化及腫瘤疾病發(fā)展相關(guān)。AKI 后局部視黃酸表達(dá)上調(diào)可抑制 M1 型促炎巨噬細(xì)胞，減輕 AKI 后巨噬細(xì)胞依賴的炎性損傷；同時活化 M2 型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)組織修復(fù)。因?yàn)橐朁S酸信號在腎臟發(fā)育中起重要作用，而在發(fā)育成熟的腎臟表達(dá)量低，這一發(fā)現(xiàn)提示胚胎發(fā)育相關(guān)信號通路參與 AKI 后的組織修復(fù)。

斑馬魚在囊性腎病發(fā)病機(jī)制及治療中的應(yīng)用

囊性腎病是最普遍的人類遺傳性疾病之一。常染色體顯性多囊腎(ADPKD)的致病基因有多囊蛋白 1(PKDl) 和多囊蛋白 2(PKD2) 。常染色體隱性多囊腎(ARPKD)的致病基因?yàn)?PKHDJ。這 3 種基因編碼的蛋白均位于腎小管上皮細(xì)胞的初級纖毛內(nèi)，提示纖毛結(jié)構(gòu)、功能異?？赡苁悄夷[形成的共同通路。纖毛擁有正向轉(zhuǎn)運(yùn)和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。纖毛行使雙向轉(zhuǎn)運(yùn)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)就是細(xì)胞纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(IFT)。IFT 表達(dá)異常與腎囊腫的發(fā)生密切相關(guān)。Lee 等用 morpholino 抑制斑馬魚 ift46 表達(dá)，可引起斑馬魚身體向腹部彎曲彎曲、腎囊腫，心包水腫和視網(wǎng)膜發(fā)育異常等典型的纖毛病表型，其他類型的IFT，如 IFT54，IFT57，IFT81 和 IFT172 等功能異常也可導(dǎo)致相同表型的病變。

在常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)中，PKD2基因突變可導(dǎo)致囊性纖維化轉(zhuǎn)膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)激活。CFTR是由 1480 個氨基酸組成的跨膜蛋白，主要參與膜內(nèi)外氯離子運(yùn)輸。CFTR介導(dǎo)離子和體液分泌入囊腔，導(dǎo)致囊腫不斷擴(kuò)大。Roxo-Rosa 等應(yīng)用斑馬魚枯否氏囊(Kupffer’s vesicle)這一在體模型研究 PKD2 對 CFTR 的作用?？莘袷夏沂且粋€充滿液體的囊狀器官，源自聚集于尾芽處的背部前驅(qū)細(xì)胞(DFCS)，短暫存在于斑馬魚胚胎早期(約 14 hpf)，后期發(fā)育成體腔。PKD2 morphant 可使 KV 體積明顯增大，CTFR 抑制劑(ouabain 或 CFTRinh-172)可以抑制囊腔的擴(kuò)大，而 CTFR 激動劑(forskolin 和 IBMX)則能使囊腔的體積進(jìn)一步擴(kuò)大，顯示 KV 囊腔的擴(kuò)大依賴于 CTFR 的活性。這一研究揭示了 CTFR 在多囊腎進(jìn)展中的重要作用，同時提出了多囊腎病的體內(nèi)研究模型，由于斑馬魚胚胎的透明性，可實(shí)時觀察和測量囊腔的體積，為多囊腎的研究提供了一個潛在的工具。

結(jié)語

斑馬魚腎臟的分子組成、結(jié)構(gòu)和功能與高等哺乳動物后腎高度保守，是連接體外細(xì)胞研究模型和傳統(tǒng)的嚙齒類動物模型的“橋梁”。斑馬魚已用于正向和反向遺傳學(xué)技術(shù)分析影響腎臟發(fā)育和疾病的基因及其功能，還包括藥物篩選等。較之小鼠模型，斑馬魚適合于多重復(fù)雜基因操作以及高通量基因功能篩查，是一種極具前景的動物模型，將在腎臟病發(fā)育、疾病研究和治療藥物的篩選中發(fā)揮重要作用。

以上內(nèi)容參考自《腎臟病與透析腎移植雜志》發(fā)表的陳朝紅、劉志紅題為“模式動物斑馬魚在腎臟疾病研究中的應(yīng)用”的論文。