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心內(nèi)科 | 斑馬魚模型在心血管疾病研究中的應用

來源:武琳, 楊明, 陳忠. 斑馬魚模型在心血管疾病研究領域的應用及進展[J]. 現(xiàn)代醫(yī)學, 2018, 46(3): 354-357. | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時間: 2023-07-22 | 2006 次瀏覽 | 分享到:

心血管疾病（CVD）是一類涉及心臟或血管的疾病。CVD包括冠心病（CAD）、心力衰竭、高血壓心臟病、風濕性心臟病、心肌病、異常心律、先天性心臟病、瓣膜性心臟病、心臟炎、主動脈瘤、外周動脈疾病、血栓栓塞性疾病和靜脈血栓形成等。世界衛(wèi)生組織2004年全球疾病負擔報告指出，心血管疾病是全球頭號殺手，2004年全球有17000萬人死于心血管疾病，到2030年之前，死亡人數(shù)預計超過兩千三百萬。

前言

心血管疾病一直是基礎和臨床研究的熱點和重點，斑馬魚作為一種重要的模式生物，在該研究領域也發(fā)揮著重大的作用。接下來從斑馬魚在心血管疾病研究中的優(yōu)勢以及應用兩方面對其進行介紹。

斑馬魚在心血管方向研究優(yōu)勢

1.大模式生物哺乳動物和鳥類實驗動物實驗周期長、成本高、難于大規(guī)模實驗和不適于活體觀察，斑馬魚具有體外受精、體外發(fā)育、體積小、產(chǎn)卵量高、發(fā)育迅速、胚胎及幼體透明、易于進行胚胎和遺傳學操作的特點。斑馬魚胚胎及幼體透明利于活體觀察，可觀察到像心跳、原腸期的細胞運動、血管的形成及血管的病變等事件。

2.斑馬魚胚胎和日齡較小的幼魚可通過皮膚彌散供氧，即使在外界供氧終斷的情況下胚胎仍能存活較長一段時間，這種優(yōu)勢在研究致死性心血管畸形及側(cè)枝動脈生成等方面是小鼠所不具備的。

3.斑馬魚容易進行轉(zhuǎn)基因和基因敲除等操作。血管內(nèi)皮表達綠色熒光蛋白( Fli1：EGFP) 、巨噬細胞表達綠色熒光蛋白( Lyz：EGFP) 和紅細胞表達紅色熒光蛋白( Gata1：dsＲed) 在心血管研究中常用于轉(zhuǎn)基因斑馬魚。

4.斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)以及血液在分子水平上與人類的相似度達 85%，尤其是心血管系統(tǒng)，早期的發(fā)育過程與人類極度相似。

斑馬魚發(fā)育過程

斑馬魚模型在心血管疾病研究領域的應用

藥物篩選模型

近幾十年來學者們成功構建了多種心血管疾病的斑馬魚研究模型，尤其是在心血管及其相關疾病的藥物篩選和毒性評價領域的研究極其活躍。心血管疾病是遺傳和環(huán)境相互作用的結果，涉及到多種細胞和因子，斑馬魚是篩選新的心血管藥物的重要模式動物。斑馬魚作為藥物篩選模型，具有高通量、樣品用量少、操作相對簡單和可以在體觀察等特點。斑馬魚作為高通量藥物篩選動物模型，促進了高通量藥物篩選技術的發(fā)展，避免了目標藥物選擇的不足，具有系統(tǒng)性和快速篩選藥的優(yōu)點。

促進或抑制血管生成藥物篩選模型

血管生成不足表現(xiàn)為無法滿足機體組織生長或修復需要，引起心血管疾病，如閉塞性動脈硬化、血栓性血管病、心肌梗死、冠心病等。研發(fā)促進血管再生的藥物有利于治療相關疾病。田麗莉等采用斑馬魚模式生物證實了莪術醇具有提高仔魚體血管內(nèi)皮生長因子 A 和血管內(nèi)皮生長因子受體 R2( VEGFR2) 基因的表達量，促進血管生成的活性。控制血管生成可以抑制腫瘤的生長和遷移，而抑制血管生成藥物的發(fā)現(xiàn)將有利于腫瘤性疾病的治療。陳錫強等研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸對斑馬魚生理性及移植瘤引起的血管生成有明顯抑制作用，這種抑制血管生成的作用與阻滯 VEGFＲ2相關。Bayliss 等利用成年斑馬魚證實使用小分子抑制劑可通過調(diào)控受體信號精確控制血管再生。

降血脂藥物篩選模型

高脂血癥是一種脂代謝紊亂疾病，可表現(xiàn)為血漿總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇( LDL-C)升高、高密度脂蛋白膽固醇降低。血脂異常與心腦血管疾病風險增加有關。給斑馬魚高膽固醇飲食建立高脂、動脈粥樣硬化模型是近年來醫(yī)學和生物學界研究的熱點。韓冰建立了斑馬魚高脂模型，并進行了藥物篩選，證實小檗胺具有降血脂作用。Stoletov等給轉(zhuǎn)基因 Fli1-EGFP 斑馬魚幼魚喂食熒光標記的高膽固醇食物，建立動脈粥樣硬化模型，發(fā)現(xiàn)Ezetimibe 能夠明顯改善血管壁脂質(zhì)沉積。

抗炎癥藥物篩選模型

炎癥學說認為動脈粥樣硬化斑塊形成至少有兩個途徑。其中一種是由機械性、LDL-C、免疫性、毒素等原因引起的內(nèi)皮損傷，繼而內(nèi)皮細胞分泌生長因子并吸引單核細胞黏附于內(nèi)皮下。遷移入內(nèi)皮下間隙后，單核細胞攝取脂質(zhì)形成脂紋并釋放血小板源性生長因子樣生長因子。有學者認為，斑馬魚是在基因組上研究人類炎癥免疫性疾病相關的病理生理學及在活體內(nèi)進行高通量藥物篩選的良好模式生物。斑馬魚抗炎藥物篩選模型的建立促進了心血管疾病治療學的發(fā)展。目前已成功構建了中性粒細胞和巨噬細胞 EGFP或ＲFP 標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚炎癥模型。但成麗等基于轉(zhuǎn)基因斑馬魚炎癥模型對人參提取物抗炎活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)人參提取物石油醚和乙酸乙酯對轉(zhuǎn)基因斑馬魚炎癥模型中巨噬細胞向損傷尾部聚集有顯著的抑制作用，具有明顯的抗炎活性。

毒性評估

斑馬魚作為模式生物的優(yōu)勢，還體現(xiàn)為斑馬魚在毒性評估方面應用廣泛。毒性評估可分為藥性毒性評估和環(huán)境污染物毒性評估。

藥性毒性評估

藥物的心血管毒性占其全部毒性反應的26%?；诎唏R魚與人類基因高度同源性，斑馬魚是一個很好的驗藥系統(tǒng)，其心臟已被廣泛應用于評估化合物的毒性。Orfanidou 等研究了抗癌藥物阿霉素的心血管毒性，觀察到如果評價涉及心臟收縮力和心臟收縮頻率兩個指標，阿霉素具有嚴重的心臟毒性副作用，而若只考慮心臟收縮頻率，心臟毒性則與藥物濃度有關。

環(huán)境污染物毒性評估

雙酚類物質(zhì)是環(huán)境中廣泛分布的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，雙酚 A( BPA) 是其中的一種。研究表明斑馬魚膽汁對 BPA 具有較強的蓄積能力。BPA 對早期發(fā)育斑馬魚具有生殖和神經(jīng)內(nèi)分泌毒性及非特異性免疫毒性。BPA 可導致脂代謝紊亂、葡萄糖耐受不良及胰島素抵抗。環(huán)境污染物苯甲酸芐酯是酞酸酯類一員，Sun 等研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸芐酯會導致斑馬魚心臟缺陷、血壓升高、胚胎心率降低，并且與心臟發(fā)育相關的 Nkx2.5 和 T-box 轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，殺菌劑三唑酮可導致斑馬魚形態(tài)畸形、心包水腫、心動過緩、心臟輸出量顯著減少，通過QPCR 進一步確定這種毒性會導致鈣信號通路相關基因下降。除草劑乙草胺可致使斑馬魚循環(huán)缺陷和血栓形成，NKX2.5 和 GATA4 表達下調(diào)。Duan 等還通過斑馬魚胚胎證實了二氧化硅納米粒子通過VEGFR2 介導的 MAPK 信號通路抑制巨噬細胞活性和血管生成。

疾病模型構建

心肌病

心肌病是指由心肌異常導致心臟功能障礙的一類疾病。常見心肌病主要有擴張性心肌?。?/span>DCM）和肥厚型心肌病（HCM）兩類。HCM 一般被認為與遺傳密切相關，患者一級親屬的患病率遠遠超過普通人；相比之下，DCM 只有約 30% 與遺傳相關。雖然斑馬魚的心臟和人類的心臟有不同的結構，但仍能夠把斑馬魚作為研究人類心血管疾病的模型。Schonberger 等發(fā)現(xiàn)在 DCM 家族中，轉(zhuǎn)錄激活輔助因子 EYA4 發(fā)生了突變。隨后他們又利用 MO 技術敲低了 EYA4 的表達，發(fā)現(xiàn)此時的斑馬魚心臟確實出現(xiàn)功能下降的趨勢，與他們之前的研究相符。Xu 等研究發(fā)現(xiàn)，類似于 titin 的基因突變同樣可導致斑馬魚心肌病的發(fā)生。斑馬魚心臟 mlc2 和 titin 兩基因突變所產(chǎn)生的表型類似。Troponin T 的突變會導致心室收縮異常。有研究表明，Troponin T 突變是導致人類 HCM 發(fā)生的主要原因之一。

炎癥反應

炎癥反應在哺乳動物或斑馬魚的心血管疾病中起著重要的作用。斑馬魚在其生命周期當中可能和人類接觸著不同的病原體，但其免疫系統(tǒng)與人類相似。斑馬魚在 2dpf（受精后天數(shù)）開始出現(xiàn)先天性免疫，體外可觀察到巨噬細胞和中性粒細胞的遷移，4~6 周后適應性免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟。斑馬魚巨噬細胞和噬中性粒細胞對機體損傷的響應方式與人類基本相同，例如，在斑馬魚尾鰭受損以后，尾鰭部位的噬中性粒細胞的數(shù)量會急劇上升并在損傷后 6 小時達到頂峰，48 小時時恢復正常。這和哺乳動物肺噬中性粒細胞對炎癥的反應有著相同的過程。斑馬魚較小鼠類炎癥模型的最大優(yōu)勢在于可在體外直接觀察炎癥細胞的存在。Renshaw 等采用報道基因技術標記斑馬魚的噬中性粒細胞。在將這種轉(zhuǎn)基因魚的尾鰭損傷后，他們清晰地觀察到帶綠色熒光的噬中性粒細胞向損傷部位遷移、聚集和消散，這與人類免疫系統(tǒng)對損傷的反應相一致。

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）

AS是一種人類常見病和多發(fā)病。由于血漿中高密度脂蛋白水平遠遠高于低密度和極低密度脂蛋白水平，因此斑馬魚一般不會自發(fā)形成 AS。在用含高脂食物持續(xù)喂養(yǎng)的情況下，斑馬魚血漿中低密度和極低密度脂蛋白的水平顯著提高，同時伴有脂蛋白的氧化和血管內(nèi)皮細胞結構以及功能的紊亂現(xiàn)象，這與人類 AS 早期的病理變化相同，從而提示斑馬魚可作為人類 AS 研究的動物模型。斑馬魚幼體透明的軀體允許研究者在體外實時地觀察 AS 的形成和發(fā)展。做法是在斑馬魚的高脂飼料當中添加熒光膽固醇脂類物質(zhì)，喂食后再在共聚焦顯微鏡下觀察斑馬魚活體血管內(nèi)粥樣硬化的整個發(fā)展過程。最近的研究表明，臨床上常用的兩類降脂藥物依折麥布（ezetimibe）和辛伐他?。?/span>simvastatin），可以減少高脂飲食的斑馬魚血液中的膽固醇含量及血管壁的脂質(zhì)沉積，說明斑馬魚與人類存在著相似的脂質(zhì)代謝過程，斑馬魚將來也可以作為篩選調(diào)脂類藥物的動物模型。

結語

斑馬魚模式生物近年來在心血管疾病研究領域得到了更多的應用，促進了心血管相關疾病發(fā)病機制的研究、藥物篩選以及環(huán)境污染物對心血管系統(tǒng)毒性的評價等研究。隨著研究的深入，斑馬魚在生命科學研究領域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用已無可質(zhì)疑。其作為生物醫(yī)學研究模型的這一扇新的窗戶已經(jīng)被打開，而下一步更要求我們再接再厲，相信在不久的將來，以斑馬魚作為動物疾病模型在研究人類疾病的發(fā)生機制、藥物篩選以及基因治療等方面將獲得更大的突破。

以上部分內(nèi)容參考自《現(xiàn)代醫(yī)學》雜志發(fā)表的武琳、楊明、陳忠題為”斑馬魚模型在心血管疾病研究領域的應用及進展”的論文。