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骨科 | 斑馬魚模型在骨相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用

來源:黃桂才, 黃維琛, 郭禮躍, 等. 斑馬魚在骨相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展[J]. 風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎, 2017, 6(9): 71-75. | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時間: 2023-07-22 | 1624 次瀏覽 | 分享到:

據(jù)《中國外科年鑒》統(tǒng)計，中國每年骨科創(chuàng)傷病例高達(dá)2000萬例，其中79.35%需要進(jìn)行手術(shù)治療。中國每年新增的整體骨科類疾病發(fā)病率居高不下的原因，除了近年來，中國慢慢步入老齡化社會，老年人所占人口總量比重的擴(kuò)大之外，日常生活中人們諸多不健康的生活及運動習(xí)慣，都會引發(fā)骨科上的相關(guān)疾病。

前言

在骨骼疾病的動物實驗研究中，最常用的模式動物包括大鼠、小鼠、兔等。傳統(tǒng)的動物模型有一系列難以克服的缺點，如造模用藥周期長、費用高、工作量大等，研究人員在不斷尋找新的動物模型來克服以上缺點。近年來，模式動物-斑馬(zebrafish) 逐漸進(jìn)入了我們的視野。斑馬魚上世紀(jì) 80 年代~90 年代初被確立為一種新的模式動物。經(jīng)過近 30 年的發(fā)展，斑馬魚已成為一種常用的模式生物，也是目前被認(rèn)為可用于提升科研效率的最好的動物模型之一。在骨骼疾病研究中，斑馬魚以其獨特的結(jié)構(gòu)與生理，提供了一種全新的、高效而靈活的動物模型。接下來從斑馬魚在骨相關(guān)疾病研究的優(yōu)勢及應(yīng)用兩方面對其進(jìn)行介紹。

斑馬魚在骨相關(guān)疾病研究的優(yōu)勢

斑馬魚在骨相關(guān)疾病研究方面具備如下優(yōu)勢：

1、與人類基因、骨骼發(fā)育相似度高。斑馬魚基因序列組合與人類基因相似度達(dá)到 87％，即約70％的人類基因至少有一個明顯的斑馬魚直系同源物。且斑馬魚能夠直接從間充質(zhì)細(xì)胞和軟骨前體育出骨骼，在解剖學(xué)上類似于哺乳動物骨骼，提供了一種有用的骨骼研究動物模型。

2、斑馬魚繁殖快、耗時短、成本低、生物安全性好，不易傳染疾病。通過對比斑馬魚與鼠、兔等哺乳動物在治療骨相關(guān)疾病的藥物毒性發(fā)育中研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚較鼠、兔具有測試成本低、速度快等優(yōu)點，證明脊椎動物斑馬魚已成為高通量藥物篩選的易處理模型生物。

3、胚胎發(fā)育迅速、易于觀察。由于斑馬魚能夠體外受精和發(fā)育，胚胎透明，且胚胎發(fā)育過程清晰可見。斑馬魚顱面骨骼的骨化開始于受精后 3d，受精約 120h 后斑馬魚各組織、臟器、骨骼均已發(fā)育完全，在顯微鏡下可直接觀察其胚胎發(fā)育情況，在第 8 天可使用茜素紅染色通過目視檢查在標(biāo)準(zhǔn)解剖顯微鏡上分析胚胎，拾取不顯示軟骨缺陷的特異性骨突變體，具有耗時短，對骨骼發(fā)育畸形易于觀察的優(yōu)勢。

4、可塑性強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚骨模型較鼠、猴骨模型在基因轉(zhuǎn)錄與敲除等方面可塑性強(qiáng)，應(yīng)被視為越來越有價值的骨模型。

總之，斑馬魚骨模型相對傳統(tǒng)的鼠、兔、猴動物模型具有繁殖快、成本低、耗時短、效率高、靈敏度高等優(yōu)勢，被廣泛運用于胚胎發(fā)育、遺傳與基因?qū)W、藥物篩選、人類疾病模型的研究，目前已有神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腫瘤及骨相關(guān)疾病系統(tǒng)等人類疾病模型建立，因該生物的骨骼系統(tǒng)發(fā)育迅速，被眾多研究者稱為研究脊椎動物發(fā)育的理想模式。

斑馬魚模型在骨相關(guān)疾病中的研究

骨發(fā)育方面研究

人類骨骼發(fā)育是由間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生，從胚胎早期間充質(zhì)干細(xì)胞骨原基起始。目前，骨的發(fā)生方式主要有膜內(nèi)成骨和軟骨成骨兩種方式，由于斑馬魚與人類骨骼發(fā)育相似度高，故在骨發(fā)育基因遺傳疾病、骨生長信號通路、成骨不全、脊柱側(cè)彎等方面均有研究。

有研究通過使用 wehTp85c 作為研究鐵缺乏的骨代謝模型，發(fā)現(xiàn) wehTp85c 突變幼魚表現(xiàn)出骨形成缺陷，同樣得出斑馬魚模型可用于骨骼發(fā)育的基因研究。由于斑馬魚的基因序列組合在許多方面與人類相似，骨骼和礦化組織也不例外，故在與人類疾病同源的骨礦化障礙中，斑馬魚模型可以對遺傳性骨骼疾病調(diào)查的小鼠和組織培養(yǎng)系統(tǒng)形成補(bǔ)充。

此外，該幼魚的光學(xué)透明度允許體內(nèi)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的可視化，能夠測試化合物對破骨細(xì)胞的影響。斑馬魚由于遺傳資源發(fā)育良好，對脊柱曲率具有天然易感性，已成為研究特發(fā)性脊柱側(cè)凸（IS）的強(qiáng)大系統(tǒng)，被運用于 IS 的遺傳和生物學(xué)模型的效用研究中，有望進(jìn)一步投入預(yù)防嚴(yán)重的脊柱側(cè)凸疾病的基礎(chǔ)研究中。目前，斑馬魚模型在骨發(fā)育方面的研究應(yīng)用優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。

骨質(zhì)疏松方面研究

斑馬魚的骨骼具有與人類骨骼相似的性質(zhì)，這表明它們可以用作研究人類哈弗斯（Haversian）系統(tǒng)的礦化特征以及人類骨骼疾病的模型，并具有研究脊椎動物骨骼正常和病理發(fā)育以及礦化的潛在機(jī)制的適用性和優(yōu)勢，尤其在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型研究方面發(fā)展迅速。

對于糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥（GIOP）的發(fā)病機(jī)制主要有影響鈣穩(wěn)定，抑制骨形成，影響性激素等，其中 Rankl/OPG 通道在發(fā)病機(jī)制中影響較大。To 等研究發(fā)現(xiàn)，在激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型中由 Rankl 的過度表達(dá)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥，并通過體內(nèi)成像方法證實了 Rankl 在硬骨魚中的破骨細(xì)胞發(fā)生中的保守作用。通過運用地塞米松使斑馬魚頭骨骼礦化量和骨密度顯著降低，成功誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生骨質(zhì)疏松，建立起糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型，解決了 GIOP 的傳統(tǒng)動物造模既緩慢又昂貴的問題。黃覓等將淫羊藿苷單體混合物對潑尼松龍誘導(dǎo)的 GIOP 斑馬魚模型進(jìn)行干預(yù)，采用茜素紅染色對斑馬魚幼魚頭骨發(fā)育積分評價發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能有效促進(jìn)斑馬魚顱骨礦化和防止?jié)娔崴升堈T導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥，類似的研究同樣表明中藥丹參酮能影響成骨細(xì)胞特異性基因和活性氧（ROS）的表達(dá)，從而起到抗 GIOP 的作用。

總而言之，斑馬魚模型具有評價周期短、成本低、藥物篩選活性高等特點，在中藥藥物活性篩選、中藥抗 GIOP 療效評估等方面具有傳統(tǒng)動物模型不可替代的優(yōu)勢。

骨腫瘤方面研究

基于斑馬魚與人類癌癥之間高度的遺傳相似性，提出了斑馬魚作為允許調(diào)查多種候選基因缺陷的快速模型系統(tǒng)，并可作為骨相關(guān)癌癥研究的綜合模式，被運用于骨肉瘤、骨髓瘤、脊索瘤等方面，鑒于研究腫瘤方式的多樣化，斑馬魚胚胎還可運用于新藥物遞送器和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑的組合來篩選藥物方案。

Mohseny等通過用斑馬魚胚胎在體內(nèi)外建立多個骨肉瘤模型，證實該生物具有研究的實用性和新穎性。Roccaro 等通過觀察斑馬魚衍生的 CD41-HSCs歸巢到與 MM 細(xì)胞相同的區(qū)域，表明斑馬魚可用于研究造血細(xì)胞的人類骨髓瘤細(xì)胞的歸巢模型。而Burger 等通過建立脊索瘤的斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)，mTORC1 抑制劑雷帕霉素可延遲斑馬魚模型中的腫瘤發(fā)生并提高存活率，從而推測 RASV12 驅(qū)動的斑馬魚模型可以使?jié)撛诘闹委焺└咄亢Y選并有助于治療該病。綜上可見，斑馬魚模型在骨腫瘤方面的優(yōu)勢已逐漸顯現(xiàn)，值得臨床進(jìn)一步深入研究。

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）方面研究

斑馬魚在 OA 模型方面研究在國內(nèi)尚屬新興領(lǐng)域，國外已有報道。由于 OA 軟骨發(fā)生的某些變化概括了軟骨內(nèi)骨化的發(fā)展過程，而斑馬魚是經(jīng)過遺傳研究和發(fā)育生物學(xué)驗證的模型，越來越多的證據(jù)表明 OA 具有很強(qiáng)的遺傳成分，該模型在 OA 中的運用或?qū)⒂兄陉U明該病的發(fā)病機(jī)制。

Mitchell 等發(fā)現(xiàn)斑馬魚幼魚中六種 OA 易感基因的表達(dá)模式，并在不同的成熟階段產(chǎn)生了兩條標(biāo)記軟骨細(xì)胞的新轉(zhuǎn)基因品系，繼而明確了該模型在 OA 中發(fā)揮作用的基因效用，進(jìn)一步證實該模型的基因高通量篩優(yōu)勢。相似的研究通過分析 OA 斑馬魚模型之間的年齡，并評估其胸鰭關(guān)節(jié)以發(fā)現(xiàn) OA 的跡象，通過番紅染色，發(fā)現(xiàn)較老的斑馬魚始終顯現(xiàn) OA 的常見癥狀（包括骨骼軟骨、軟骨鈣化、軟骨細(xì)胞增殖、蛋白聚糖染色增加等），得出類似于曼金評分的得分方法評估斑馬魚 OA 的嚴(yán)重程度，證實該模型的胸鰭、肩鰭可用于肩胛關(guān)節(jié) OA 的研究。此外，還發(fā)現(xiàn)該模型表達(dá)出幾種 OA 新的生物標(biāo)志物（Tgf-β1，Mmp13，Ddr2 和 Htra-1）。由此推測，該模型可作為研究 OA 的模型生物體，并將有助于該模型的技術(shù)推廣，通過斑馬魚 OA 模型的建立和推廣或?qū)⒂兄谥委?OA 的藥物研究或前瞻性的遺傳篩選，為臨床治療該病提供指導(dǎo)。

以上研究皆表明，可以利用斑馬魚作為一種人類骨關(guān)節(jié)病理學(xué)研究的動物模型，并證實斑馬魚可作為研究人類病因復(fù)雜骨疾病的理想模型。

其他骨相關(guān)疾病方面研究

斑馬魚還可運用于佩吉特氏骨病、骨再生、布魯克綜合征（BS）、脊髓性肌萎縮（SMA）等骨相關(guān)疾病的研究。Silva 等通過斑馬魚模型研究 SQSTM1 基因在佩吉特氏骨?。?/span>PDB）和骨骼發(fā)育中的生物學(xué)起重要作用。

此外，以尾鰭為代表的成年斑馬魚部分組織在截肢或受傷后擁有再生的能力。尾鰭由基底部骨骼、放射狀鱗質(zhì)鰭條(骨組織) 、軟組織和血管組成。放射狀鱗質(zhì)鰭條不含細(xì)胞，為膜內(nèi)骨化，可實現(xiàn)完全再生，因此被用于研究成熟骨組織的修復(fù)和再生能力。且斑馬魚尾鰭透明度高，有利于活體染色和放射學(xué)觀察，為研究帶來了便利條件，目前已有多種轉(zhuǎn)基因品系用于骨再生與修復(fù)。

結(jié)語

斑馬魚以其獨特的結(jié)構(gòu)與生理，為骨骼疾病的研究提供了一種全新的、高效而靈活的動物模型，經(jīng)過數(shù)十年的不斷研究，在分子、基因水平均得到了長足的進(jìn)展，越來越成為人類骨骼疾病基因分析與臨床治療、藥物開發(fā)研究方面的重要工具。在中醫(yī)藥研究中，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)理論，斑馬魚將成為一種快速、高通量篩選中藥的一個重要模型，為全面開展藥效學(xué)、毒理學(xué)及藥物代謝學(xué)等全方面多角度的研究打下基礎(chǔ)。

以上部分內(nèi)容參考自《風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎》雜志發(fā)表的黃桂才、黃維琛、郭禮躍、梁江、盧云題為”斑馬魚在骨相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展”的論文。