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血液科 | 斑馬魚模型在血液疾病研究中的應(yīng)用

來源:郭佳妮, 劉帆, 王璐. 斑馬魚血液疾病模型及應(yīng)用[J]. 遺傳, 2020, 42(8): 725-738. | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時間: 2023-07-22 | 1294 次瀏覽 | 分享到:

血液系統(tǒng)是維持機體生命活動重要的系統(tǒng)之一，為機體提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，通過物質(zhì)交換維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時提供免疫防御與保護。血液系統(tǒng)包含紅系細胞、髓系細胞以及淋系細胞等多種成熟血細胞，而這些血細胞均由造血過程產(chǎn)生。造血過程是造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)及各類血細胞產(chǎn)生、分化及發(fā)育成熟的過程，開始于胚胎發(fā)育早期并貫穿整個生命過程。

前言

血液病是原發(fā)于血液系統(tǒng)，或影響造血系統(tǒng)伴發(fā)血液異常的一類疾病。血液病種類繁多，且多數(shù)為難治性或惡性疾患，近年來發(fā)病率有逐漸增高的趨勢，其中白血病的發(fā)病率和死亡率更是居于我國惡性腫瘤前10位。因此，針對疾病臨床需求深入開展基礎(chǔ)研究，解析疾病發(fā)病機制具有重要意義。

應(yīng)用模式動物，針對關(guān)鍵致病因子構(gòu)建疾病模型，對于人類疾病機制研究、治療及藥物評價至關(guān)重要。斑馬魚造血過程及調(diào)控機制與哺乳動物高度保守，結(jié)合體外受精、早期胚胎透明、豐富的轉(zhuǎn)基因魚系等獨特優(yōu)勢，斑馬魚已成為造血發(fā)育以及人類疾病研究的常用模式動物之一。在斑馬魚體內(nèi)模擬致病因子異常變化構(gòu)建相關(guān)血液疾病模型，可用于腫瘤發(fā)生發(fā)展可視化研究及高通量化學篩選。以下為大家系統(tǒng)的總結(jié)了斑馬魚模型在血液疾病研究中的應(yīng)用。

1.斑馬魚血液疾病模型

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPNs）

可分為3個亞型：真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）和原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF），這些亞型均伴有血栓形成和出血等疾病相關(guān)并發(fā)癥。JAK2、MPL、CALR或CSF3R等基因的突變常見于MPNs患者。盡管存在治療策略，但對JAK2抑制劑等藥物的耐藥性仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

在人類MPNs患者中JAK2基因的功能突變（V617F）是最為常見的。為了在斑馬魚身上建立這種疾病的模型，通過位點定向誘變成功構(gòu)建了人類JAK2v617f的同源物。突變體與人類真性紅細胞增多癥具有高度相似性，主要表現(xiàn)為紅細胞增多。另一種常見的突變基因為CALR，它編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白。通過mRNA注射在斑馬魚胚胎表達突變的人類CALR基因，可以導(dǎo)致血小板生成增加，類似于ET患者中觀察到的表型。這兩個品系都為篩選靶向Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（the Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions，JAK/STAT）信號通路的治療藥物提供了可靠的模型。

急性髓系白血?。?/span>acute myeloid leukemia，AML）

該病是成人最常見的急性白血病，是一個具有高度異質(zhì)性的疾病群，其特征是白血病母細胞在骨髓、外周血等器官不受控制的增殖和積聚。常發(fā)生在老年人，并且在臨床過程中出現(xiàn)進行性現(xiàn)象。AML治療的主要障礙是初期誘導(dǎo)治療的難度大，同時在緩解后復(fù)發(fā)的現(xiàn)象也非常常見。

最早的 AML模型是在斑馬魚胚胎中短暫表達人融合癌基因，然而這些模型均存在早期致死現(xiàn)象，無法在成體期進行研究。第一個成功的非胚胎致死AML模型是用spi1啟動子驅(qū)動MYST3-NCOA2融合基因表達，該模型中髓系前體細胞廣泛侵襲斑馬魚腎臟，然而AML發(fā)病率低、潛伏期長。在時間上控制致癌基因的表達可以有效解決胚胎死亡問題。

在斑馬魚胚胎中熱激處理誘導(dǎo) AML1-ETO融合基因表達可模擬人AML部分癥狀，機制研究表明AML1-ETO通過scl影響紅-髓系祖細胞分化，促進粒細胞產(chǎn)生。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因魚系Tg(spi1-loxP-EGFP-loxP-NUP98-HOXA9)與 Tg (hsp70：Cre)雜交，可以特異性地在髓系細胞中誘導(dǎo)致癌基因表達。胚胎期過表達NHA9可干擾早期造血發(fā)育，導(dǎo)致髓系前體占優(yōu)勢；而在成體期過表達NHA9可導(dǎo)致23%的轉(zhuǎn)基因魚在19~23個月時出現(xiàn)骨髓增殖性腫瘤(myeloprolifera tive neoplasms, MPN)。

利用此模型，加拿大戴爾豪斯大學Jason Berma 團隊發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與組蛋白去乙?；敢种苿┙Y(jié)合可恢復(fù)NHA9過表達胚胎的正常血液發(fā)育，該發(fā)現(xiàn)揭示了NHA9與表觀遺傳調(diào)控之間的聯(lián)系，展示了協(xié)同藥物組合在NHA9誘導(dǎo)的髓系疾病中的治療潛力。

急性淋巴細胞白血?。?/span>acute lymphocytic leukemia，ALL）

這是一種影響兒童和成人的淋巴祖細胞的惡性腫瘤性疾病，可分為急性T淋巴細胞白血病和急性B淋巴細胞白血病。近40年來，對兒童ALL的基礎(chǔ)和臨床研究取得了巨大成就。目前存在著聯(lián)合藥物化療方案，兒童的治愈率可>90%，成人為40%。

急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）的特征是未成熟的T細胞祖細胞異常增殖，在兒童ALL病例中占15%，在成人ALL病例中占25%。許多急性T淋巴細胞白血病病例中，Myc表達上調(diào)。Langenau等使用特異性的淋巴細胞啟動子rag2來驅(qū)動癌基因c-Myc表達，首先構(gòu)建了斑馬魚急性T淋巴細胞白血病模型。c-Myc是常用的致癌基因，將其與淋巴細胞啟動子rag2融合表達已經(jīng)成功構(gòu)建了多個急性T淋巴細胞白血病疾病模型。這些斑馬魚疾病模型和哺乳動物之間具有很高的相似性，使得進一步研究白血病轉(zhuǎn)化機制成為可能。

急性B淋巴細胞白血病是一種由未成熟B細胞前體異常增殖引起的血液惡性腫瘤，在人類ALL病例中約占75%。目前已報道一種前B細胞急性淋巴細胞白血病疾病模型，它是通過融合癌基因TEL-AML1整體表達來誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生。然而，該模型還有白血病發(fā)病率低、潛伏期長等缺陷，表明誘發(fā)白血病可能還需要其他基因的突變。

Diamond-Blackfan綜合征（DiamondBlackfan syndrome, DBA）

為遺傳性疾病，僅不足10%患者有家族史，其余多數(shù)患者呈散發(fā)性?；颊叩闹饕卣魇峭ǔＴ?/span>1歲前出現(xiàn)紅細胞發(fā)育不良，同時還伴有各種體型異常，如骨骼變形和身材矮小。超過50%的DBA患者攜帶編碼核糖體蛋白基因的突變。Danilova等通過MO敲低rps19，構(gòu)建出了DBA的第1個斑馬魚模型。此外，其他的核糖體蛋白功能缺失也能引起DBA，如rps14、rpl11、rps29。這些基因最初是通過MO敲低構(gòu)建了模型，后來通過轉(zhuǎn)錄激活因子樣效物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）建立了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。

此外，斑馬魚還可應(yīng)用于骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）、重癥先天性中性粒細胞減少癥（severe congenital neutropenia, SCN）、Shwachman綜合征（Shwachman syndrome, SDS）、遺傳性貧血等血液相關(guān)疾病的研究，隨著基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，疾病模型的數(shù)量正在增加，性能也更加穩(wěn)定。以上研究皆表明，可以利用斑馬魚作為研究人類病因復(fù)雜血液疾病的理想模型。

2.移植評價

應(yīng)用斑馬魚進行血液腫瘤細胞移植可以用來定義和量化白血病增殖細胞以及探究其啟動白血病的潛能。斑馬魚的移植評價實驗具有諸多優(yōu)勢：使用受精后4周內(nèi)的斑馬魚胚胎進行移植不需要免疫抑制，因為該時期斑馬魚缺乏成熟的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)；透明的胚胎或成體魚Casper與多種熒光轉(zhuǎn)基因品系相結(jié)合，促進了活體成像技術(shù)在腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的應(yīng)用。

斑馬魚移植受體的免疫系統(tǒng)可被地塞米松或γ射線短暫抑制，卻無法進行長期移植；且僅可用于同源移植，限制了移植模型的廣泛應(yīng)用。為了解決這些問題，美國哈佛大學 David Langenau 團隊構(gòu)建了免疫缺陷斑馬魚模型—rag2^E450fs突變體。該突變體中功能性T細胞和B細胞數(shù)量減少，但仍能存活和繁殖，并且可進行多種組織與癌細胞長期穩(wěn)定移植。但是該模型純合子斑馬魚不能繁殖，以及個體間B細胞缺陷差異極大，可能影響植入潛能。

免疫缺陷斑馬魚模型 jak3^P369fs突變體和prkdc^D3612fs突變體，分別導(dǎo)致T細胞與NK細胞、成熟T細胞和B細胞的缺失，兩種突變體均具有植入能力，但只有prkdc純合突變體可以繁殖，并且在細胞移植后存活。斑馬魚prkdc^–/–，il2rg^–/–雙突變體中T細胞、B細胞和NK 細胞缺陷，David Langenau 團隊應(yīng)用該免疫缺陷突變體建立并評估了腫瘤移植模型，能夠重現(xiàn)多種病人來源的腫瘤生長遷移等情況，并可在單細胞水平進行活體實時研究。

3.藥物篩選

斑馬魚模型是進行高通量藥物篩選的理想選擇，主要基于兩個優(yōu)點：(1)整體動物模型，可以針對特定生物學事件發(fā)現(xiàn)活性化合物和藥物靶標；(2)全面評估化合物的活性和副作用，排除具有明顯毒副作用的化合物，縮短藥物研發(fā)周期。

美國猶他大學 Nikolaus Trede 團隊應(yīng)用淋系轉(zhuǎn)基因斑馬魚進行藥物篩選，確定小分子化合物 Lenaldekar(LDK)可以有效消除不成熟的T細胞而不影響正常細胞的細胞周期，且可延長大部分T-ALL成魚的生存期。同時對于直接取自臨床原發(fā)性白血病（包括難治性B-ALL和慢性粒細胞白血病）患者的樣本，LDK可以殺死其中大部分的白血病細胞。這項工作證明了使用斑馬魚篩選抗腫瘤藥物的實用性，同時LDK的發(fā)現(xiàn)也為白血病靶向治療提供了新方向。

接受異種移植的斑馬魚也是藥物篩選的一個重要模型。將人類白血病細胞移植到斑馬魚胚胎中用于篩選非致畸的白血病治療藥物，結(jié)果顯示伊馬替尼和奧沙福林可消除白血病細胞，且對受體胚胎無毒性；而全反式維甲酸和4EGI-1表現(xiàn)出致畸作用，不能作為抗白血病藥物。

結(jié)語

斑馬魚和哺乳動物的血液系統(tǒng)是高度保守的，在斑馬魚中的研究成果有可能適用于人類。斑馬魚的高繁殖力，體外胚胎產(chǎn)生、發(fā)育以及胚胎和幼體的透明性，為斑馬魚的非侵入性體內(nèi)分析提供便利，使多種遺傳和藥物篩選方法的應(yīng)用成為可能，并可以幫助我們理解疾病病理生理學、基因型和表型相關(guān)性，并最終發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和模式?？傊?，斑馬魚具有其獨特的優(yōu)勢，可以與哺乳動物模型互補，幫助我們進一步理解正常造血和血液疾病，并有望極大地促進新藥物的發(fā)現(xiàn)。

以上內(nèi)容參考自《遺傳》雜志發(fā)表的郭佳妮、劉帆、王璐題為”斑馬魚血液疾病模型及應(yīng)用”的論文；《發(fā)育醫(yī)學電子雜志》發(fā)表的明邦發(fā)、王歡、陳柳蓉、賈海波、王雅琴題為”斑馬魚血液疾病模型”的論文。