文獻(xiàn)：Philip AM, Wang Y, Mauro A, El-Rass S, Marshall JC, Lee WL, Slutsky AS, dosSantos CC, Wen XY. Development of a zebrafish sepsis model for high-throughput drug discovery. Mol Med. 2017 Jul;23:134-148. doi: 10.2119/molmed.2016.00188. Epub 2017 Jun 7. PMID: 28598490; PMCID: PMC5522968.
雜志：MOLECULAR MEDICINE
摘要
膿毒癥是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因。目前的治療方式在很大程度上是支持性的。由于對先天免疫反應(yīng)的復(fù)雜性和異質(zhì)性認(rèn)識不足，專注于抑制炎癥宿主反應(yīng)特異性介質(zhì)的干預(yù)策略在很大程度上是不成功的。此外，傳統(tǒng)的藥物開發(fā)管道耗時(shí)且昂貴，并且與基于細(xì)胞的篩選相關(guān)的低成功率強(qiáng)調(diào)了對整個(gè)生物體篩選策略的需求，特別是對于復(fù)雜的病理過程。在這里，我們建立了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的斑馬魚內(nèi)毒素血癥模型，該模型表現(xiàn)出人類膿毒癥的主要特征，包括水腫和組織/器官損傷，血管通透性增加和血管滲漏，伴隨著細(xì)胞連接蛋白表達(dá)改變，細(xì)胞因子表達(dá)增加，免疫細(xì)胞活化和活性氧(ROS)產(chǎn)生，循環(huán)減少和血小板聚集增加。我們使用三個(gè)主要讀數(shù):死亡率、血管滲漏和ROS產(chǎn)生，測試了該模型用于基于表型的藥物篩選的適用性。初步篩選確定法舒地爾，一種在小鼠模型中防止血管泄漏的藥物，作為先導(dǎo)打擊，從而驗(yàn)證了我們的模型在敗血癥藥物篩選中的實(shí)用性。該斑馬魚膿毒癥模型具有快速分析整個(gè)生物體中膿毒癥相關(guān)病理和細(xì)胞過程的潛力，以及篩選和驗(yàn)證許多可以在體內(nèi)改變膿毒癥病理的化合物。
介紹
敗血癥被定義為由宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。對感染的全身反應(yīng)在生物學(xué)上是復(fù)雜的、冗余的，可由感染性和非感染性觸發(fā)因素激活，對人類的了解很少。此外，由于某些組織或細(xì)胞類型無法進(jìn)入，許多免疫生物學(xué)不能在人體中進(jìn)行生理學(xué)檢查。依賴先驗(yàn)的生物學(xué)知識和干預(yù)措施的可用性來改變臨床前模型的結(jié)果在轉(zhuǎn)化為臨床時(shí)失敗了。
雖然對培養(yǎng)細(xì)胞的研究已經(jīng)帶來了新的見解，但對假定的候選者的更深入了解需要開發(fā)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，以便在更相關(guān)的器官背景下分析細(xì)胞間通信和組織-組織相互作用。盡管“芯片上的器官”等替代方法為研究不同細(xì)胞類型之間的相互作用提供了獨(dú)特的機(jī)會，但這些方法與整個(gè)動物的相關(guān)性仍然不足，在整個(gè)動物中，先天免疫功能障礙的影響可以在生物體水平上進(jìn)行研究。
傳統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)的方法是緩慢的，通常需要幾年的時(shí)間?？赡艿陌悬c(diǎn)列表是巨大的，而瞄準(zhǔn)其中任何一個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)致生存率顯著提高的機(jī)會很小。因此，需要更好的方法來加快藥物發(fā)現(xiàn)的管道。在整個(gè)生物體中基于表型的篩選允許對新化合物進(jìn)行測試，同時(shí)以無監(jiān)督和系統(tǒng)的方式在整個(gè)生物體水平上評估復(fù)雜的生物過程，從而增強(qiáng)了為臨床前和機(jī)制研究檢測更合理靶點(diǎn)的潛力。雖然小鼠在臨床前研究中仍然不可或缺，但小鼠生物學(xué)的幾個(gè)方面，如藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段所需的成本、時(shí)間和藥物數(shù)量，限制了其在藥物發(fā)現(xiàn)的大規(guī)模遺傳和治療篩選中的常規(guī)使用。
斑馬魚最近成為研究人類病理的強(qiáng)大脊椎動物模型。通過基因組測序，斑馬魚為疾病建模提供了獨(dú)特而強(qiáng)大的原型，因?yàn)?其在基本細(xì)胞生物學(xué)過程中與人類具有顯著的生理相似性和功能保守程度，相對容易的胚胎操作和全身成像，高繁殖力，低成本和透明度，各種分子工具的可用性，用于正向反向遺傳學(xué)和基因組編輯。斑馬魚和人類參考基因組之間的比較表明，大約70%的人類基因至少有一個(gè)明顯的斑馬魚同源基因。在藥物研究中，斑馬魚胚胎是高通量體內(nèi)藥物篩選的理想選擇，并且易于自動化。斑馬魚結(jié)合了體內(nèi)模型的生物復(fù)雜性，以及高通量篩選和快速評估潛在毒性和脫靶效應(yīng)的便捷性。預(yù)計(jì)從這種針對整個(gè)疾病途徑的體內(nèi)篩選中鑒定出的先導(dǎo)化合物將比基于細(xì)胞的體外篩選具有更高的成功率。
在過去的十年中，斑馬魚作為研究傳染病、炎癥性疾病、癌癥和其他免疫相關(guān)疾病的優(yōu)秀模型被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。斑馬魚擁有與哺乳動物相同的主要血統(tǒng)。它們的先天免疫系統(tǒng)在發(fā)育過程中變得活躍，在受精后16小時(shí)(HPF)和26小時(shí)(HPF)分別出現(xiàn)功能齊全的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。此外，它們的先天免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄特征類似于在哺乳動物和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中看到的。斑馬魚的適應(yīng)性免疫反應(yīng)直到發(fā)育大約三周后才變得活躍，這意味著在沒有T細(xì)胞和b細(xì)胞反應(yīng)的早期幼魚階段可以對其進(jìn)行分離研究。主要病原體識別受體(PRRs)及其下游信號通路和先天效應(yīng)機(jī)制在人和斑馬魚之間是保守的，這使得斑馬魚成為研究先天免疫系統(tǒng)疾病的絕佳模型。然而，關(guān)于魚類內(nèi)毒素識別的機(jī)制一直存在爭議。盡管脂多糖(LPS)在魚類研究中是一種公認(rèn)的免疫刺激劑，但有報(bào)道稱，與人類不同，魚類對LPS的識別并不通過TLR4進(jìn)行。事實(shí)上，大多數(shù)魚類(斑馬魚除外)缺乏TLR4，因此硬骨魚模型中涉及LPS信號傳導(dǎo)的分子機(jī)制尚不清楚。然而，下游信號分子如NFκB和MyD88的激活以及由此產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子的釋放似乎是硬骨魚和哺乳動物之間的保守反應(yīng)。
膿毒癥包括一系列反應(yīng)，從全身炎癥反應(yīng)到器官功能障礙，再到多器官系統(tǒng)衰竭，最終死亡。在疾病的最初階段，患者對感染表現(xiàn)出壓倒性的炎癥反應(yīng)。這主要是由于免疫細(xì)胞的激活和促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)和IL-8)在這一階段的釋放。這種系統(tǒng)性炎癥級聯(lián)是由各種細(xì)菌產(chǎn)物引發(fā)的，如內(nèi)毒素。這些反過來又在微血管和細(xì)胞水平上帶來許多變化，包括炎癥和凝血級聯(lián)的彌漫性激活、血管舒張、毛細(xì)血管內(nèi)皮滲漏、血管分布失調(diào)以及由此導(dǎo)致的細(xì)胞水平上對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的不正常利用。最終導(dǎo)致微血管血栓形成和微血管堵塞、灌注不足、缺血和組織損傷，進(jìn)而發(fā)展為多器官系統(tǒng)功能衰竭，最終死亡。雖然機(jī)體確實(shí)試圖通過產(chǎn)生抗炎介質(zhì)(IL-10)來調(diào)節(jié)初始的高炎癥狀態(tài)，但臨床觀察到這是一段免疫抑制期，這種低反應(yīng)狀態(tài)的持續(xù)與繼發(fā)感染和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。
內(nèi)毒素概括了膿毒癥的許多重要特征，包括血管完整性喪失、滲出性水腫的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞外滲、免疫細(xì)胞活化、促炎和活性氧(ROS)合成增加、微循環(huán)和凝血功能障礙。在這里，我們提出并驗(yàn)證了一種新的內(nèi)毒素血癥斑馬魚模型，我們希望它可以加速敗血癥藥物的發(fā)現(xiàn)，用于基于表型的化學(xué)篩選，以確定具有疾病改善潛力的新治療靶點(diǎn)和化合物。
材料與方法
斑馬魚品系與護(hù)理
成年和胚胎斑馬魚使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序飼養(yǎng)和維持。斑馬魚在28.5±0.5°C的光照/黑暗周期中飼養(yǎng)14 h/10 h。通過自然交配獲得胚，在胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本研究中的所有實(shí)驗(yàn)均按照圣邁克爾醫(yī)院動物委員會制定的倫理準(zhǔn)則進(jìn)行，并批準(zhǔn)了動物協(xié)議ACC660。大于24 HPF的胚胎用200μM 1-苯基-2-硫脲處理以阻止色素沉著
lps誘導(dǎo)的斑馬魚膿毒癥模型:生存曲線和表型分析
常用的小鼠膿毒癥模型是LPS和盲腸結(jié)扎穿刺模型?？紤]到實(shí)用性，本研究采用LPS制作斑馬魚膿毒癥模型。暴露于不同濃度LPS(大腸桿菌0111:B4;Sigma)。采用浸漬法將受精后3 d的幼魚暴露于LPS環(huán)境中。分別用25、50、75、100和200μg/mL LPS(溶解于胚液中)浸泡，在28.5℃下靜置2、7、9和24 h，每次處理的總?cè)莘e為2 mL。對照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中。試驗(yàn)采用3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)處理10只幼魚。在LPS暴露6小時(shí)后，對40只幼魚/LPS濃度進(jìn)行表型分析。
測量lps誘導(dǎo)的血管滲漏
微血管造影劑量子點(diǎn)(QD605)和異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖(4kd)用于觀察內(nèi)皮屏障功能喪失和血管滲漏。
將3只DPF Tg (flk1: GFP)和Tg (kdrl: mcherry)幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中，在28.5℃下靜浸6 h。對照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中。然后用丁香油和QD605麻醉幼魚(平均3次，每次處理9-14只幼魚)或FITC葡聚糖(4KD;采用標(biāo)準(zhǔn)顯微注射方案，將Tg (flk1: GFP)或Tg (kdrl: mcherry)幼魚分別注射到總主靜脈(CCV)中，每次處理平均3次，每次10-15只幼魚。將注射后的胚胎轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基中并使其恢復(fù)，然后在注射后30分鐘使用徠卡熒光顯微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)成像。為了實(shí)時(shí)觀察血管滲漏，注射fitc -葡聚糖恢復(fù)后，對照和lps處理的幼魚立即固定在低熔點(diǎn)瓊脂糖中，使用徠卡熒光顯微鏡進(jìn)行延時(shí)成像。
細(xì)胞因子和細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的測定
以伸長因子1α (EF1α)作為管家基因?qū)φ?，采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)評估細(xì)胞因子(平均3個(gè)試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)20只幼魚/處理)和細(xì)胞連接蛋白(平均3 - 5個(gè)試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)20只幼魚/處理)的相對表達(dá)。
RNA提取和cDNA合成。將3只DPF野生型斑馬魚幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中，在28.5℃下靜浸6 h。對照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中。采用RNeasy提取試劑盒(Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada)提取總RNA，每組20只，DNase處理。用NanoDrop?分光光度計(jì)在260/280 nm處測定總RNA的濃度。使用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明，從1μg總RNA合成第一鏈cDNA。
PCR條件。感興趣的基因和使用的引物對如表1所示。cDNA擴(kuò)增在94°C初始變性2分鐘后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，分別為變性(94°C 30秒)、退火(58°C 30秒)和延伸(72°C 1分鐘)，最后在72°C延伸10分鐘后終止。PCR總?cè)莘e為20μL，包括1 × PCR緩沖液，1.25 mM MgCl2, 0.25 mM dNTP, 1 U Taq聚合酶，0.5μM正向和反向引物，1μL cDNA。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。每個(gè)PCR產(chǎn)物的大小通過與100個(gè)堿基的DNA階梯進(jìn)行比較來確定。采用凝膠記錄系統(tǒng)和Fiji分析軟件對SYBR安全染色凝膠進(jìn)行密度分析，定量PCR產(chǎn)物。對于每個(gè)樣品處理，獲得的目標(biāo)基因特異性帶的綜合密度值除以EF1α帶獲得的信號，得到相對mRNA豐度值。EF1α波段的綜合密度值隨處理無顯著變化。每個(gè)基因至少重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。結(jié)果以n次試驗(yàn)的相對強(qiáng)度±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。
ZO-1免疫熒光分析
將3只DPF Tg (kdrl: mcherry)幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中，在28.5℃下靜浸6 h。對照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中。胚胎在2%多聚甲醛(PFA)的PBST(磷酸鹽緩沖鹽水+ 0.1% Tween 20)中于4°C下固定過夜。然后胚胎在室溫下PBST中洗滌4次，5分鐘，在PBST + 0.5% TritonX-100中透性30分鐘。然后將胚胎用PBST + 0.1% TritonX-100 + 10%正常山羊血清(NGS) + 1%牛血清蛋白(BSA)在室溫下封閉2小時(shí)。胚胎用一抗(兔抗zo -1 mid;Invitrogen #40 2200)在阻斷溶液(1:200)中，在4°C下過夜。然后在RT下PBST中洗滌6次，20分鐘，用二抗(山羊抗兔IgG Alexa flu488;1:1000)在阻斷液中孵育2小時(shí)。胚胎在PBST中孵育3次，孵育10分鐘，然后置于4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI) Vectashield中。圖像由蔡司共聚焦顯微鏡拍攝。平均3次試驗(yàn)，4 ~ 6只/處理，獲得定量數(shù)據(jù)。
測量免疫細(xì)胞的活化和ROS的產(chǎn)生
為了觀察中性粒細(xì)胞的活化和轉(zhuǎn)運(yùn)，將3只DPF Tg (mpx: GFP)幼魚在28.5°C下靜浸LPS(100μg/mL) 4 h，使用徠卡熒光顯微鏡(n = 7/處理)成像。為了可視化中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在lps誘導(dǎo)的組織損傷中所起的作用，3 DPF Tg (coro1a: eGFP;lyz: Dsred)雙轉(zhuǎn)基因幼魚(巨噬細(xì)胞顯示綠色熒光，中性粒細(xì)胞顯示綠色和紅色熒光)在28.5°C下靜態(tài)浸泡LPS(100μg/mL) 6 h，使用徠卡熒光顯微鏡(n = 7/處理)成像。使用Fiji分析軟件統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。
用2 '，7 ' -二氯二氫熒光素(DCFH-DA;Sigma-Aldrich)， ROS指標(biāo)(n = 4/組)。將野生型斑馬魚置于LPS(100μg/mL)中，在28.5℃下靜浸5 h，然后與100μM DCFH-DA一起在28.5℃下黑暗孵育1h，用胚水洗滌3次，孵育5 min。DCFH- da擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞酯酶去乙?；癁榉菬晒釪CFH，后者被ROS迅速氧化為高熒光的2’，7’-二氯熒光素。熒光強(qiáng)度與胞漿內(nèi)ROS水平成正比。為了證明觀察到的對ROS產(chǎn)生的影響是LPS特異性的，我們還進(jìn)行了LPS劑量反應(yīng)和由此產(chǎn)生的ROS產(chǎn)生的變化。野生型斑馬魚暴露于不同濃度的LPS(0、25、50、75和100μg/mL;n = 3/處理)在28.5°C下靜浸5 - 6 h，然后與100μM DCFH-DA在28.5°C下黑暗孵育1 h，用胚水洗滌3次，孵育5 min。使用徠卡DFC 300-FX相機(jī)和徠卡熒光顯微鏡拍攝照片，并使用Fiji分析軟件進(jìn)行處理。
校正總熒光(CTF)的計(jì)算公式如下:CTF =積分密度-(選定細(xì)胞面積×背景讀數(shù)的平均熒光)
測量循環(huán)缺陷
為了可視化lps誘導(dǎo)的循環(huán)變化，3 DPF Tg (flk1: GFP;gata-1: Dsred)雙轉(zhuǎn)基因幼魚在28.5°C下靜浸LPS(100μg/mL) 6 h，用徠卡熒光顯微鏡成像(平均3次試驗(yàn)，7只幼魚/處理)。對照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中。結(jié)果用鄰二苯胺(OD)染色技術(shù)對血紅蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。簡單地說，將LPS處理后固定在4% PFA中的幼魚在PBST中洗滌，然后在o- diisidine (OD)染色液(10 mL溶液中含有6 mg OD, 4 mL EtOH, 100μL 1M乙酸鈉和5.9 mL水)中黑暗孵育6分鐘。然后在PBST中洗滌3次，5分鐘，用明視野顯微鏡成像。
為了測量lps誘導(dǎo)的血管狹窄，使用徠卡熒光顯微鏡測量背主動脈(卵黃延伸尖端正上方)直徑的像素距離，然后使用斐濟(jì)分析軟件轉(zhuǎn)換為μm (n = 5-8 /處理)。
測量血小板聚集
為了觀察血小板，相當(dāng)于人類血小板(招募，聚集和可能形成微血管血栓)，將3只DPF Tg (CD41: GFP)幼魚在28.5°C下靜態(tài)浸泡6小時(shí)，暴露于LPS(100μg/mL)中，并使用徠卡熒光顯微鏡成像(平均3次試驗(yàn)，5-7只幼魚/處理)。
膿毒癥中免疫抑制狀態(tài)的表征
為了描述膿毒癥晚期常見的免疫抑制狀態(tài)，在lps治療后6-7小時(shí)對中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。將3只DPF Tg (mpx: GFP)幼魚在28.5°C下靜浸LPS(100μg/mL) 6-7 h，使用徠卡熒光顯微鏡(n = 7-12 /處理)成像。晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的轉(zhuǎn)錄水平也通過定量實(shí)時(shí)PCR測定，如前幾節(jié)所述。
斑馬魚膿毒癥+和NFκB的LPS信號傳導(dǎo)
TLR4a、TLR4b和MyD88的轉(zhuǎn)錄本豐度通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，如前幾節(jié)所述。利用Encinas等人的改進(jìn)方案，通過全胚胎免疫熒光觀察NFκB蛋白表達(dá)和核易位。簡單地說，將3只DPF幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中，在28.5°C下靜態(tài)浸泡2小時(shí)。對照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中。胚胎在2% PFA的PBST中于4°C下固定過夜。在PBST + 0.5% TritonX-100中，胚胎在RT下洗4次，5分鐘，RT下透性30分鐘。胚胎在PBST + 0.1% TritonX-100 + 10% NGS + 1% BSA中封閉2 h。胚胎用一抗(NFκB/p65 [Rel A] Ab-1，兔多克隆抗體;RB-1638-P0)在阻斷溶液(1:200)中在4°C下過夜。然后在RT下PBST中洗滌6次，20分鐘，用二抗(山羊抗兔IgG Alexa flu488;1:1000)在阻斷液中孵育2小時(shí)。胚胎最后在PBST中孵育3次，孵育10分鐘，并在DAPI Vectashield中孵育。圖像由蔡司共聚焦顯微鏡拍攝。平均3次試驗(yàn)，每次處理3 - 4只幼魚，獲得定量數(shù)據(jù)。
驗(yàn)證斑馬魚膿毒癥模型在高通量藥物篩選應(yīng)用中的實(shí)用性
內(nèi)部組裝的小分子藥物文庫與適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ找黄?，最初溶解?00%二甲基亞砜(DMSO)中，濃度為10 mg/mL，然后用無核酸酶的水進(jìn)一步稀釋。3只DPF野生型斑馬魚幼魚與LPS(100μg/mL)和小分子文庫(終藥濃度為1μg/mL;DMSO <0.01%)在28.5°C下，96孔設(shè)置過夜(暗壁板，底部透明;1幼魚/;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。在同一盤子上也設(shè)置了適當(dāng)?shù)膶φ?。篩選是使用我們內(nèi)部的高通量機(jī)器人藥物發(fā)現(xiàn)平臺完成的。初步篩選涉及96個(gè)小分子(分子量250-500)靶向表觀遺傳調(diào)節(jié)劑、免疫調(diào)節(jié)劑及其類似物(生命化學(xué)品)。這些分子既滿足Lipinski的“五法則”，也滿足Veber準(zhǔn)則和差異性評價(jià)。
在我們的高通量篩選中使用的三個(gè)主要讀數(shù)是:(1)小分子提高存活率的能力，(2)小分子挽救lps誘導(dǎo)的血管滲漏和由此導(dǎo)致的尾鰭水腫的能力(通過明場顯微鏡觀察)和(3)小分子挽救lps誘導(dǎo)的系統(tǒng)性ROS產(chǎn)生的能力(見上面的方案);使用ImageXpress Ultra共聚焦高含量分析系統(tǒng)(Molecular Devices)進(jìn)行成像和定量。
為了進(jìn)一步測試法舒地爾對LPS誘導(dǎo)的死亡、血管滲漏和ROS產(chǎn)生的影響，將3只DPF斑馬魚幼魚與LPS(100μg/mL)共孵育，在不同濃度的法舒地爾(0.01 ~ 75μM)下，獲得該藥物相對于生存的EC50(處理采用3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)處理10只幼魚)。fitc -葡聚糖注射(平均3次試驗(yàn)，每處理10只幼魚)和活性氧產(chǎn)生測定(見上面的方案;平均3個(gè)試驗(yàn)(3只幼魚/處理)來評估法舒地爾對lps誘導(dǎo)的血管滲漏和ROS生成的拯救能力。
統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。采用T檢驗(yàn)(對照與LPS實(shí)驗(yàn))和Tukey事后檢驗(yàn)的雙向方差分析(藥物搶救實(shí)驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，以確定治療差異。當(dāng)需要滿足正態(tài)性和等方差假設(shè)時(shí)，對原始數(shù)據(jù)或轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。概率水平P < 0.05為顯著性。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用graphpad Prism軟件進(jìn)行。
暴露于LPS引起的尾鰭水腫和死亡率
暴露于LPS的三只DPF斑馬魚幼魚顯示出劑量依賴性的死亡率增加(圖1A)。雖然較低濃度的LPS(25或50μg/mL)在前24小時(shí)內(nèi)沒有導(dǎo)致死亡，但50μg/mL組中5%的幼魚出現(xiàn)了腫脹的心包囊(圖1B)。暴露于75或100 μ g/mL的中高劑量LPS分別導(dǎo)致40%和93%的死亡率。暴露于50和75μg/mL LPS的幼魚心包腫脹。75μg/mL LPS組只有7.5%的幼魚出現(xiàn)尾鰭水腫和組織損傷，而100μg/mL LPS組92.5%的幼魚出現(xiàn)尾鰭損傷和水腫。此外，暴露于100μg/mL LPS下的幼魚尾鰭水腫和損傷隨著時(shí)間的推移而惡化(圖1C, D)。暴露于LPS后，最高劑量200μg/mL導(dǎo)致心包出血，2小時(shí)死亡率為37%，7小時(shí)死亡率為100%。所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用100 μ g/mL LPS劑量進(jìn)行，因?yàn)樵搫┝繉?dǎo)致適合基于表型的藥物篩選的尾部表型，如果不進(jìn)行干預(yù)，也會導(dǎo)致死亡率。
lps誘導(dǎo)斑馬魚幼魚血管滲漏
注射量子點(diǎn)(QD605)提供了明亮的生命標(biāo)記，顯示暴露于LPS(100μg/mL)后47%的斑馬魚幼魚(Flk1: GFP)血管滲漏增加(圖2A, B)。最明顯的QD滲漏發(fā)生在卵黃延伸尖端正上方的區(qū)域(圖2A)，沿著后基數(shù)靜脈(PCV)。由于量子點(diǎn)相對較大(約為大分子的大小~ 15-20 nm)，因此使用該方法無法識別較小的泄漏。為了解決這個(gè)問題，我們使用了分子量為4 KD(~ 14埃)的綠色標(biāo)記的fitc -葡聚糖來證明lps誘導(dǎo)的血管滲漏通過節(jié)間血管(isv)和fitc -葡聚糖在尾部尖端的積累，這與尾鰭中看到的水腫和組織損傷相對應(yīng)(圖2C)。fitc -葡聚糖注射后lps誘導(dǎo)的血管滲漏延時(shí)成像可以實(shí)時(shí)顯示體內(nèi)血管滲漏(見補(bǔ)充數(shù)據(jù))。注射fitc -葡聚糖檢測到97%的幼魚有血管滲漏，與量子點(diǎn)注射相比，這是一種更可靠的檢測lps誘導(dǎo)血管滲漏的方法(圖2D)。
LPS改變細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)和分布
內(nèi)毒素血癥后，血管滲漏被認(rèn)為是由微生物或/和宿主因子對內(nèi)皮細(xì)胞和/或其緊密和粘附連接的直接作用引起的(TJs和AJs，圖3A)。AJs是組織完整性的基礎(chǔ)，而tj則與屏障功能有關(guān)(27)。將斑馬魚幼魚暴露于100μg/mL LPS中，顯著降低TJ蛋白o(hù)ccludin A的轉(zhuǎn)錄水平(2.7倍;圖3B)， occludin B(2.4倍;圖3C)， claudin 5a(1.9倍;圖3D)和claudin 5b(1.8倍;圖3E)， claudin 2的表達(dá)增加(4倍;圖3F)，對AJ蛋白VE鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響(圖3G)。LPS也顯著降低(2.6倍;ZO-1是一種與跨膜TJ蛋白、細(xì)胞骨架和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相關(guān)的支架連接蛋白。ZO-1蛋白表達(dá)也明顯降低(圖3I)，并且在lps誘導(dǎo)的尾部水腫和組織損傷部位出現(xiàn)斷裂/碎片化(圖3J)。
LPS誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞血管外遷移
通過使用帶有熒光標(biāo)記的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，我們量化了白細(xì)胞從限定血管中的遷移。中性粒細(xì)胞在未處理的3 DPF幼魚中處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要位于主動脈背側(cè)(DA;圖4 Ai)。在炎癥的早期階段，暴露于LPS導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞從DA遷移到間隙(圖4i, B)。LPS還誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從血管內(nèi)空間遷移到水腫尾的血管外液體中(圖4C, D)。
暴露于LPS后ROS和炎癥介質(zhì)表達(dá)增加
它們的快速擴(kuò)散和多樣的生物活性使ROS成為確定彌漫性損傷和傷口到白細(xì)胞信號的存在和程度的良好候選者。LPS以劑量依賴的方式誘導(dǎo)ROS生成增加(補(bǔ)充圖S1)。LPS暴露后，與對照組相比，斑馬魚幼魚(暴露于100μg/mL LPS)的ROS產(chǎn)量迅速顯著增加(34倍)(圖5A, B)。LPS處理的幼魚尾部ROS產(chǎn)量增加與觀察到的尾部和組織損傷相對應(yīng)。間質(zhì)水腫和ROS生成的增加與關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子表達(dá)的適度增加和抗炎細(xì)胞因子IL-1表達(dá)的較大增加進(jìn)一步相關(guān)(1.2倍;圖5C)， IL-6(1.3倍;圖5D)， TNF(1.6倍;圖5E)， IL-8l1(1.5倍;圖5F)， IL-8l2(1.3倍;圖5G)和IL-10(5.5倍;圖5 h)。
補(bǔ)充1 LPS暴露顯著增加ROS的產(chǎn)生，且呈劑量依賴
圖5 LPS誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生ROS，增加促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)
LPS誘導(dǎo)血管狹窄，血流減少和血栓細(xì)胞聚集
通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚系和血紅蛋白染色，暴露于LPS后，>86%的3只DPF幼魚表現(xiàn)出腦毛細(xì)血管微血管循環(huán)減少，主要是在中央動脈(圖6A, B)。我們還通過DA和PCV觀察到循環(huán)不良和缺陷(圖6C)，并伴有DA狹窄(圖6D)。在超過80%的斑馬魚幼魚中，我們還觀察到與對照組相比，DA和PCV之間的CCV和胚胎尾側(cè)區(qū)域的血栓細(xì)胞聚集增加，這表明斑馬魚幼魚尾側(cè)區(qū)域有少量循環(huán)血栓細(xì)胞(圖6E, F)。
中性粒細(xì)胞數(shù)量減少和HMGB1表達(dá)增加提示斑馬魚膿毒癥模型處于免疫抑制狀態(tài)
在我們的斑馬魚膿毒癥模型中，我們觀察到炎癥后期(LPS治療后6-7小時(shí))中性粒細(xì)胞數(shù)量減少(補(bǔ)充圖S2A, S2B)， HMGB1表達(dá)增加(2.5倍)(補(bǔ)充圖S2C)，表明該模型的免疫抑制狀態(tài)與臨床膿毒癥中觀察到的相似。
斑馬魚膿毒癥模型中的LPS信號通路包括nf - κ b上調(diào)、核nf - κ b易位和升高M(jìn)yD88表達(dá)式
lps誘導(dǎo)的斑馬魚膿毒癥模型內(nèi)毒素血癥是通過NFκB和MyD88信號通路介導(dǎo)的。NFκB熒光主要定位于對照斑馬魚幼魚的細(xì)胞質(zhì)中。然而，熒光也出現(xiàn)在細(xì)胞核中，并且在LPS處理的幼魚(處理后2 h)中熒光強(qiáng)度增加，提示誘導(dǎo)了斑馬魚NFκB的易位和新合成(補(bǔ)充圖S3A, S3B)。這也與MyD88表達(dá)增加(2.8倍;補(bǔ)充圖S3C)，但TLR4轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有變化(補(bǔ)充圖S3D, S3E)。
內(nèi)毒素誘導(dǎo)的高通量藥物篩選參數(shù)評價(jià)
我們建立了一個(gè)方案，將健康的3只DPF幼魚分布在96孔板中，暴露于LPS和內(nèi)部組裝的不同藥物庫中14-16小時(shí)，以檢測候選化合物對LPS誘導(dǎo)的死亡、血管滲漏(以尾鰭水腫為特征)和ROS產(chǎn)生的影響。根據(jù)可重復(fù)性、易檢測性、可視化、量化和與膿毒癥病理生理的相關(guān)性，選擇內(nèi)毒素血癥嚴(yán)重程度的替代標(biāo)記物作為我們表型篩選的基礎(chǔ)。各種先導(dǎo)候選物降低了lps誘導(dǎo)損傷的主要(尾鰭水腫和ROS產(chǎn)生)和次要(死亡率)結(jié)果標(biāo)志物。從我們96個(gè)專有小分子化合物的初步篩選中，鑒定出10個(gè)化合物可以挽救所有三種表型。其中一種被確定的藥物是法舒地爾(圖7A, B)，一種已知可以挽救實(shí)驗(yàn)性膿毒癥小鼠模型中脂多糖誘導(dǎo)的血管滲漏的藥物。對法舒地爾的反應(yīng)被用來驗(yàn)證我們的模型在確定死亡率、血管泄漏和活性氧產(chǎn)生的新修飾因子方面的實(shí)用性。該藥物在斑馬魚中的進(jìn)一步測試表明，法舒地爾對lps誘導(dǎo)的死亡具有劑量依賴性，對存活的EC50為3.852μM(圖8A)。此外，雖然所有暴露于LPS并接受載藥處理的幼魚都出現(xiàn)尾部水腫和腫脹，并伴有血管滲漏和尾部fitc -葡聚糖的積累，但法舒地爾和LPS處理的幼魚中，88%的幼魚完全恢復(fù)了尾部表型和fitc -葡聚糖滲漏(圖8B, C)。法舒地爾本身對血管滲漏沒有影響，對斑馬魚幼魚沒有毒性作用。法舒地爾還能挽救脂多糖誘導(dǎo)的尾部ROS生成(圖8D、E)。有趣的是，與對照組、法舒地爾處理和脂多糖+法舒地爾處理的幼魚相比，脂多糖處理的幼魚魚鰾中的ROS減少(圖8F)。
討論
在這里，我們建立了一種新的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥和損傷斑馬魚模型，概括了人類敗血癥的主要生理和細(xì)胞特征。將斑馬魚幼魚暴露于高劑量LPS會導(dǎo)致血管滲漏，導(dǎo)致尾鰭水腫和組織損傷，并隨著時(shí)間的推移而惡化，在沒有干預(yù)的情況下，與高死亡率相關(guān)。尾巴表型還與量子點(diǎn)和葡聚糖從血管內(nèi)滲漏到間隙的增加有關(guān)，主要是沿著尾巴。血管通透性的喪失與緊密連接蛋白基因表達(dá)減少、水孔基因claudin2表達(dá)增加、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤增加、細(xì)胞因子表達(dá)增加和ROS產(chǎn)生增加有關(guān)。LPS暴露也與背主動脈收縮有關(guān)，有證據(jù)表明流向大腦的血流量受損，血小板聚集增加，表明大動脈血管收縮和血小板功能障礙。
PRRs及其下游信號通路和先天免疫效應(yīng)機(jī)制在人類和斑馬魚之間是保守的。脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。它是一種強(qiáng)效免疫刺激劑，已知在脊椎動物模型中可誘導(dǎo)器官功能障礙、血管麻痹甚至死亡。此外，大多數(shù)人類敗血癥病例與細(xì)菌感染有關(guān)，革蘭氏陰性菌常與嚴(yán)重?cái)⊙Y和感染性休克的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。雖然最近的研究使用微生物注射細(xì)菌提取物來誘導(dǎo)斑馬魚的炎癥和敗血癥樣病理生理，但我們使用了一種更簡單的技術(shù)(水媒暴露于LPS)，它更適合高通量藥物篩選。
血管通透性增加有助于膿毒癥的病理生理，以及多種其他疾病狀態(tài)。對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的間質(zhì)水腫形成的更深入的了解可能為屏障功能喪失的機(jī)制提供基本的見解。微注射量子點(diǎn)(QD605)和fitc -葡聚糖等微血管造影造影劑，可以實(shí)時(shí)直接觀察血管通透性的變化，并在體內(nèi)對靶向血管通透性的藥物進(jìn)行評價(jià)。在lps誘導(dǎo)的斑馬魚膿毒癥模型中，我們實(shí)時(shí)觀察到血管完整性的廣泛喪失和隨之而來的血管泄漏的增加。注射QD605有助于檢測主要滲漏，而注射fitc -葡聚糖有助于觀察isv的輕微滲漏，以及泄漏的fitc -葡聚糖在尾鰭的積累，這與這些幼魚的尾鰭水腫相吻合。
屏障完整性的破壞至少部分歸因于細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)和分布的改變。在我們的模型中，血管通透性增加伴隨著緊密連接蛋白o(hù)ccludin a和b、claudin 5a和b及其細(xì)胞內(nèi)伙伴ZO-1的表達(dá)減少。雖然在斑馬魚中claudin 5被認(rèn)為對內(nèi)皮細(xì)胞更具特異性，但其表達(dá)僅限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和玻璃狀血管。相反，claudin 5b在整個(gè)血管系統(tǒng)中表達(dá)。其他緊密連接蛋白如occludin和許多claudin家族成員不僅存在于內(nèi)皮細(xì)胞中，也存在于上皮細(xì)胞中。在這些細(xì)胞中，TJs有助于生成主要屏障，阻止溶質(zhì)通過細(xì)胞旁途徑擴(kuò)散)。
值得注意的是，我們測量了全身連接蛋白的表達(dá)，在我們的表達(dá)分析中沒有區(qū)分上皮和內(nèi)皮連接蛋白。我們的結(jié)果與小鼠膿毒癥模型的研究一致，也顯示occludin和claudin 5水平顯著降低。對膿毒癥小鼠的研究也表明，ZO-1表達(dá)減少，模式紊亂，碎片化程度更高，這與我們在斑馬魚膿毒癥模型中的發(fā)現(xiàn)相似。我們還發(fā)現(xiàn)，在小鼠多微生物膿毒癥模型中，形成孔隙的緊密連接蛋白claudin 2表達(dá)上調(diào))。有趣的是，我們沒有檢測到VE鈣粘蛋白表達(dá)的任何顯著差異，盡管這種AJ蛋白廣泛參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮完整性和通透性。這種差異可能是由于我們測量了VE鈣粘蛋白的總轉(zhuǎn)錄水平，而VE鈣粘蛋白介導(dǎo)的內(nèi)皮通透性的大多數(shù)變化是翻譯后變化的結(jié)果，即VE鈣粘蛋白磷酸化和快速內(nèi)化和裂解，這并不一定反映轉(zhuǎn)錄水平的變化。
誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6、TNF及IL-8的兩種同源物在處理后6 h暴露于病理濃度LPS的斑馬魚幼魚中表達(dá)適度升高。眾所周知，細(xì)胞因子水平在對感染的反應(yīng)中是暫時(shí)調(diào)節(jié)的，我們可能錯過了通常在免疫損傷后最初幾個(gè)小時(shí)觀察到的促炎細(xì)胞因子表達(dá)的峰值水平。此外，抗炎細(xì)胞因子IL-10的顯著高表達(dá)表明進(jìn)展為免疫抑制表型，通常與敗血癥后期繼發(fā)感染的原因有關(guān)。本研究中測量的細(xì)胞因子和趨化因子通常被用作硬骨魚免疫反應(yīng)的測量方法，并且先前已證明斑馬魚和哺乳動物之間相當(dāng)保守(序列保守和/或結(jié)構(gòu)保守)。然而，斑馬魚的許多細(xì)胞因子基因在進(jìn)化過程中獨(dú)立復(fù)制和分化，其功能含義尚不完全清楚。在人類以及內(nèi)毒素血癥和敗血癥的非靈長類動物模型中，這些促炎介質(zhì)已被證明協(xié)同作用，誘導(dǎo)以血管通透性增加、嚴(yán)重肺水腫和出血為特征的休克樣狀態(tài)。這些細(xì)胞因子和趨化因子以自分泌和旁分泌的方式激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集，激活凝血途徑并放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)。在我們的模型中，促炎介質(zhì)的上調(diào)與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移的增加有關(guān)，同時(shí)伴隨著ROS產(chǎn)生的增加，尤其是在尾部。在膿毒癥中，中性粒細(xì)胞在脈管系統(tǒng)和外周器官的積聚可導(dǎo)致肺、腎、膈、肝和腸等多個(gè)器官的非特異性細(xì)胞和組織損傷。此外，中性粒細(xì)胞還通過與內(nèi)皮壁的結(jié)合和血小板-白細(xì)胞聚集體的形成，促進(jìn)敗血癥相關(guān)的血液凝固和微血管堵塞。進(jìn)一步的研究將探討循環(huán)細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的組織損傷發(fā)病機(jī)制中的具體作用。
在敗血癥/感染性休克期間微循環(huán)發(fā)生巨大改變。局部小動脈收縮和內(nèi)皮通透性增加會破壞正常的血流。我們觀察到斑馬魚膿毒癥模型中通過腦毛細(xì)血管的循環(huán)非常少。血流分流可能導(dǎo)致毛細(xì)血管血流減慢，并與微血栓引起的毛細(xì)血管阻塞一起，可能減少向組織輸送氧氣，損害二氧化碳和廢物的清除。我們還觀察到主要血管(如DA和PCV)的循環(huán)減少，DA變窄。這伴隨著脈管系統(tǒng)中血小板的聚集，這可能是lps誘導(dǎo)的微血管血栓和與敗血癥相關(guān)的微血管堵塞的形成的指示，可能導(dǎo)致組織灌注減少。未來的機(jī)制研究旨在闡明與病理性暴露于LPS相關(guān)的血流動力學(xué)損害，目前正在進(jìn)行中。
死于敗血癥的患者也表現(xiàn)出免疫抑制狀態(tài)。這種全身性免疫抑制狀態(tài)不僅導(dǎo)致無法根除原發(fā)感染，還會導(dǎo)致致命的繼發(fā)感染。膿毒癥的免疫抑制與免疫細(xì)胞的衰竭和免疫調(diào)節(jié)分子如細(xì)胞因子水平的改變有關(guān)。在我們的模型中，雖然我們觀察到炎癥早期中性粒細(xì)胞外滲增加，但在lps誘導(dǎo)的炎癥后期，中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這與先前的數(shù)據(jù)一致，顯示嚴(yán)重膿毒癥患者中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少。有人提出，中性粒細(xì)胞數(shù)量的減少可能是由于中性粒細(xì)胞對抗入侵細(xì)菌的自我犧牲機(jī)制，稱為“NETosis”(NET:中性粒細(xì)胞胞外陷阱)。作為對炎癥刺激的反應(yīng)，中性粒細(xì)胞從循環(huán)中滲出到被感染的組織，并啟動NETosis，由此它們釋放顆粒蛋白，如中性粒細(xì)胞彈性酶和髓過氧化物酶，其作用是降解毒力因子和殺死細(xì)菌。在嚴(yán)重膿毒癥的情況下，許多中性粒細(xì)胞因此被消耗以消除細(xì)菌。雖然NETs通常被認(rèn)為是有益的，但過度形成也可能通過激活血小板對宿主造成意外傷害，導(dǎo)致微血管堵塞。中性粒細(xì)胞數(shù)量減少也可能為繼發(fā)性機(jī)會性感染鋪平道路。
HMGB1主要以其作為dna結(jié)合蛋白促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的作用而聞名，現(xiàn)在已被認(rèn)為是一種促炎細(xì)胞因子和炎癥的晚期介質(zhì)。有趣的是，在我們的斑馬魚膿毒癥模型中，HMGB1的表達(dá)在炎癥后期也顯著增加。已知HMGB1在人類敗血癥晚期的積累在敗血癥后免疫抑制的發(fā)展中起主要作用。此外，在小鼠膿毒癥模型中，治療性阻斷HMGB1已被證明可以提高死亡率。斑馬魚是否也有同樣的情況還有待研究。
硬魚體內(nèi)脂多糖信號傳導(dǎo)的機(jī)制存在廣泛爭議。許多硬骨魚缺乏TLR4受體，但仍然對LPS有反應(yīng)，這強(qiáng)調(diào)了硬骨魚中LPS信號傳導(dǎo)不是通過傳統(tǒng)的TLR4信號傳導(dǎo)途徑發(fā)生的事實(shí)。我們也沒有看到TLR4在LPS刺激下的表達(dá)有任何變化。然而，我們在此表明斑馬魚膿毒癥模型中對LPS的識別確實(shí)需要NFκB易位和MyD88，與之前的研究相似。
利用我們的斑馬魚內(nèi)毒素血癥模型，我們建立了一種新的篩選方案來篩選許多抗血管滲漏/抗內(nèi)毒素特性的化合物。所使用的三個(gè)主要讀數(shù)(挽救死亡率、挽救尾部表型和挽救ROS產(chǎn)生)非常直接，不需要侵入性手術(shù)。法舒地爾是一種RhoA/ rho激酶途徑的抑制劑，與內(nèi)皮屏障功能喪失和血管通透性增加有關(guān)，與內(nèi)毒素誘導(dǎo)的敗血癥有關(guān)。此外，法舒地爾在小鼠模型中也被證明可以挽救lps誘導(dǎo)的血管滲漏。
法舒地爾同時(shí)暴露于LPS可減少斑馬魚幼魚尾部水腫、葡聚糖泄漏和ROS產(chǎn)生。有趣的是，與其他三組相比，暴露于LPS的幼魚在魚鰾中產(chǎn)生的ROS減少。魚的魚鰾與四足動物的肺是同源的。在魚類中，這主要與流體靜力作用有關(guān)。氧氣是魚鰾中的主要?dú)怏w，該器官的組織經(jīng)常暴露于持續(xù)的高氧，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加。這可能解釋了我們在對照魚中觀察到的ROS產(chǎn)量增加。魚鰾也被認(rèn)為是氧氣儲存庫，血液可以在需要的時(shí)候從中吸取額外的氧氣。這也許可以解釋在脂多糖處理的斑馬魚幼魚中看到的低ROS水平，這表明氧氣可能來自魚鰾，以補(bǔ)償脂多糖引起的身體不同部位和遠(yuǎn)處組織的缺氧。
結(jié)論
綜上所述，給斑馬魚幼魚施用水性脂多糖可重現(xiàn)與人類敗血癥相關(guān)的許多表型和細(xì)胞變化。這些可以可靠地可視化，量化和逆轉(zhuǎn)管理的抗血管滲漏化合物，如法舒地爾。重要的是，臨床相關(guān)結(jié)果(如死亡率、血管滲漏和ROS產(chǎn)生)可以利用高通量方法篩選斑馬魚幼魚的各種化合物。
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