常用的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的建立方法都是將斑馬魚培養(yǎng)在適宜濃度造模藥物的生活環(huán)境中，處理一段周期后，使斑馬魚的骨密度發(fā)生改變。目前研究斑馬魚骨骼模型的最常用方法是通過經(jīng)典骨骼染色并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察

常用的化學(xué)染料有茜素紅 ( alizarin red ) 和鈣黃綠素( calcein) 等。茜素紅染色為固定染色，通過與骨中的鈣結(jié)節(jié)引起的顯色現(xiàn)象來檢測魚的骨形態(tài)和BMD，毒性強(qiáng)具有特異性，用于斑馬魚硬骨染色，但實(shí)驗(yàn)前期步驟較多，耗時(shí)較長。鈣黃綠素染色為活體染色，與骨骼中的鈣化離子結(jié)合，在熒光的照射下發(fā)出綠色熒光來顯示骨骼鈣化程度，熒光信號強(qiáng)、毒性弱、染色時(shí)間短，但無特異性，可以實(shí)時(shí)觀測胚胎骨所有時(shí)期的發(fā)育，需要注意染色過程要避光且要將染色液清洗干凈，防止對熒光信號產(chǎn)生影響。活體熒光染色主要研究斑馬魚幼魚的骨骼鈣化及成魚尾鰭的再生等，而影像學(xué)技術(shù)也被用于斑馬魚骨骼的觀察，如 X 線檢測、顯微 CT 等，能夠更精準(zhǔn)的評價(jià)骨的質(zhì)量，更適用骨質(zhì)疏松癥的早期檢測。

圖3 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型藥物造模的建立方法

雖然目前OP的模型很少，但有各種斑馬魚突變系可以準(zhǔn)確地模擬人類骨骼發(fā)育不良，包括膠原病和成骨不全的形式，其特征是骨骼脆性和頻繁的低沖擊骨折。在許多骨骼發(fā)育不良的情況下，斑馬魚不僅可以模擬人類的狀況，而且可以從機(jī)理上洞察基因變化如何導(dǎo)致細(xì)胞變化，從而支持疾病癥狀。因此，斑馬魚為新的骨質(zhì)疏松基因位點(diǎn)的功能研究提供了令人興奮的前景。

圖4 利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對斑馬魚進(jìn)行快速高效的誘變

圖5 斑馬魚突變體、轉(zhuǎn)基因插入突變體和顯示骨骼礦化改變的變形體

以尾鰭為代表的成年斑馬魚部分組織在截肢或受傷后擁有再生的能力。尾鰭由基底部骨骼、放射狀鱗質(zhì)鰭條( 骨組織) 、軟組織和血管組成。尾鰭的基底部骨骼為軟骨內(nèi)骨化，切除后不能再生。放射狀鱗質(zhì)鰭條不含細(xì)胞，為膜內(nèi)骨化，可實(shí)現(xiàn)完全再生，因此被用于研究成熟骨組織的修復(fù)和再生能力。由于鰭和鱗片是半透明的，很容易成像，因此可以使用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡詳細(xì)觀察細(xì)胞及其鈣化基質(zhì)。在切除鰭(通常是尾鰭)后，傷口愈合反應(yīng)導(dǎo)致表形胚的形成，該胚能以可控的方式再生被切除器官的所有受影響組織，包括骨。在這種炎癥反應(yīng)之后，成骨細(xì)胞經(jīng)歷去分化和增殖以形成胚基。這些幼年成骨細(xì)胞分泌介于軟骨和骨之間的基質(zhì)，然后由成熟的成骨細(xì)胞和招募的破骨細(xì)胞重塑為成熟的骨。這些鰭也可以通過低溫?fù)p傷，將-196°C的刀垂直放置在尾鰭射線上，以便研究骨吸收反應(yīng)。這些技術(shù)為比較成人的骨形成和骨重塑提供了很好的視角。此外，通過使用糖皮質(zhì)激素潑尼松龍?zhí)幚碓偕挘C明了鰭再生試驗(yàn)用于檢測生物活性化合物的有效性。

OP的一個(gè)主要問題是由于骨結(jié)構(gòu)較弱導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，因此需要確定能夠改善骨折愈合的治療方法。斑馬魚表現(xiàn)出骨折愈合反應(yīng)，包括骨痂形成，與哺乳動物有很強(qiáng)的相似性。斑馬魚的鰭可以通過簡單的外部壓力誘發(fā)骨折。由于魚鰭約有300條骨射線，單個(gè)魚鰭可誘發(fā)多處骨折。骨折后2天形成骨痂并開始新生骨形成，同時(shí)runx2和sp7/osx等成骨細(xì)胞基因表達(dá)增加。由于鰭是平的，因此可以使用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或用AR和鈣黃蛋白標(biāo)記骨形成在細(xì)胞分辨率下動態(tài)跟蹤骨折修復(fù)過程。此外，還可以在再生組織中添加藥理學(xué)制劑，從而測試潛在的骨合成代謝化合物在體內(nèi)骨折修復(fù)中的有益作用。

圖6 鰭再生和骨折試驗(yàn)，可視化和量化活骨形成和修復(fù)

此外，斑馬魚的身體覆蓋著由鈣化的真皮骨組成的彈性樣鱗片，由于該鱗片含有生物活性的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，包括神經(jīng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此它們的使用為在成熟環(huán)境下研究骨細(xì)胞行為提供了機(jī)會，并作為骨骼化合物的主要藥理篩選工具提供了巨大的潛力。

圖7 斑馬魚鱗片結(jié)構(gòu)與骨細(xì)胞類型

圖8 成骨細(xì)胞活性如何從鱗片上量化