研究表明，斑馬魚的脂質(zhì)代謝過程和NAFLD的發(fā)生機(jī)制與人類相似，肝臟代謝紊亂會引起人類和斑馬魚的脂肪肝，比如高脂肪或高糖的飲食、禁食、毒素暴露、蛋氨酸消耗和遺傳因素。在極少數(shù)情況下，先天性代謝紊亂和其他遺傳病也可引起脂肪肝。最重要的是人類和斑馬魚FLD模型具有許多相似的特征，包括肝細(xì)胞的增大和膨脹、甘油三酯的積累、激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的分泌通路功能障礙以及活性氧（ROS）的增加等。此外，氧化應(yīng)激和脂肪因子超載可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重肝細(xì)胞損傷、血管改變和纖維化。截止到目前，研究者利用轉(zhuǎn)基因、化學(xué)誘導(dǎo)和飲食誘導(dǎo)等方法建立的斑馬魚NAFLD模型被應(yīng)用于臨床研究和藥物評價中，而且斑馬魚在脂質(zhì)代謝研究方面的潛力得到了積極的報道。

圖2 斑馬魚NAFLD的病理機(jī)制及主要模型

飲食誘導(dǎo)模型：斑馬魚攝入的脂質(zhì)被肝臟分泌的膽汁乳化，并被腸道吸收，這與人類的過程相似。目前有幾種飲食NAFLD模型，包括斑馬魚高脂飲食(HFD)、高膽固醇飲食(HCD)、果糖飲食(FD)，以及過度喂養(yǎng)模型和饑餓誘導(dǎo)模型。

飼喂含有13%-16%大豆油的飼料后，斑馬魚血漿TG水平和肝臟組織脂質(zhì)積累顯著增加。另一種常用的HFD含有8%棕櫚酸(PA)，一種飽和脂肪酸，在斑馬魚中引起肥胖、高脂血癥和高血糖表型，并促進(jìn)炎癥相關(guān)因子如腫瘤壞死因子α (tnfa)和白細(xì)胞介素1β (il1b)的表達(dá)。同樣，細(xì)胞死亡相關(guān)基因DNA斷裂因子亞基α (dffa)、纖維化相關(guān)基因膠原蛋白、I型、α 1a (col1a1a)和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因CD36分子(CD36)、低密度脂蛋白受體(ldlr)和脂蛋白脂肪酶(lpl)的表達(dá)水平顯著升高。誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體損傷最終導(dǎo)致肝臟脂肪變性和器官損傷加重。

HCD模型的優(yōu)點(diǎn)是可以在2-3周內(nèi)誘導(dǎo)NAFLD從脂肪肝到NASH的全面過程。以TC水平、TG水平和尼羅紅染色作為脂質(zhì)代謝指標(biāo)，通過檢測全身ROS、MDA、SOD水平來判斷氧化應(yīng)激程度。油紅O染色和H&E染色檢測肝臟脂肪變性程度是NAFLD藥物篩選最直接的指標(biāo)。高膽固醇水平也可能影響斑馬魚的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和胰島素敏感性，為NAFLD中糖脂代謝的研究提供了良好的模型。

HFD聯(lián)合HCD模型顯示斑馬魚的脂肪變性更為嚴(yán)重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂解分子(atf6、hspa5、hsp90b1、pparab、cpt1a和acox3)的表達(dá)水平顯著上調(diào)，22表明這些混合飲食在較短的時間內(nèi)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，從而有助于肝臟脂肪變性的研究和藥物篩選，具有較好的可靠性和實(shí)用價值。

流行病學(xué)研究表明，使用果糖作為食品添加劑與肥胖和NAFLD患病率有關(guān)。與此一致的是，短時間攝入果糖會導(dǎo)致炎癥和脂肪生成基因(如cidec和lipin1)以及脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子srebf1的激活。該模型表現(xiàn)出脂肪性肝炎的特征，包括線粒體異常和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)缺陷，這表明果糖導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝臟脂肪變性。因此，F(xiàn)D模型可以作為NAFLD炎癥途徑和氧化應(yīng)激的研究工具。

過度喂食模型也被廣泛使用，它是通過給斑馬魚喂食更多的食物或更頻繁的食物來實(shí)現(xiàn)的。在過度喂食模型中，斑馬魚被喂食正常飲食攝入量的六倍，以模擬高熱量的攝入。脂質(zhì)生成和糖代謝相關(guān)基因如lipin1、srebf1和irs2a mRNA表達(dá)降低，過量飼喂飼料對斑馬魚氨基酸代謝和自噬激活有較大影響。NAFLD的過度喂養(yǎng)模型還顯示出與核糖體生物發(fā)生、嘧啶代謝、脂肪酸代謝、α -亞麻酸代謝和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路的顯著相關(guān)性。相比之下，在耗盡蛋黃供應(yīng)的營養(yǎng)后5-10天禁食斑馬魚幼蟲，通過促進(jìn)肝外脂肪酸攝取和新生脂肪生成，有助于肝臟脂肪變性，從而建立饑餓誘導(dǎo)的NAFLD模型。

化學(xué)誘導(dǎo)模型：目前，化學(xué)誘導(dǎo)的斑馬魚NAFLD模型主要是通過肝毒性藥物或氧化劑如tunicamycin、valinomycin等抗生素治療而產(chǎn)生的。這些處理引起肝細(xì)胞蛋白異常折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活肝星狀細(xì)胞(HSCs)和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，進(jìn)一步引起肝脂肪變性。

硫乙酰胺具有急性肝毒性。它可以被氧化并產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性和壞死。經(jīng)硫乙酰胺處理后，斑馬魚肝臟組織出現(xiàn)脂滴聚集和脂肪變性，并伴有細(xì)胞凋亡。因此，該模型可應(yīng)用于與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)相關(guān)的NAFLD研究。

突變模型：通過正向遺傳篩選或反向遺傳方法已鑒定出許多突變株，它們表現(xiàn)出與NAFLD相似的肝臟表型，可用于相關(guān)分子機(jī)制的研究。

foigr突變體中的突變基因trappc11編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物的一個亞基，該亞基在膜運(yùn)輸、外源生物代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。foigr突變斑馬魚(trappc11hi1532bTg)表現(xiàn)出肝臟肥大表型和蛋白n-糖基化減少，這是由于脂聯(lián)寡糖(LLO)合成受到抑制，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌蛋白的積累，從而誘導(dǎo)脂肪肝的形成。

cdipt是合成磷脂酰肌醇(PtdIns)的關(guān)鍵基因，PtdIns是磷脂酰肌醇(PIs)的主要來源，磷脂酰肌醇是鈣穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)分泌的重要調(diào)節(jié)因子。cdipt缺陷斑馬魚(cdipthi559Tg)表現(xiàn)出與NAFLD相似的病理肝臟結(jié)構(gòu)，包括肝臟腫大、脂質(zhì)積累和肝細(xì)胞變性、氧化應(yīng)激增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞。

dtp突變體(ahcyp14nb)被鑒定為具有s-腺苷型同型半胱氨酸水解酶(ahcy)基因中保守殘基的突變。ahcy活性降低會增加s-腺苷型同型半胱氨酸(SAH)水平，導(dǎo)致脂質(zhì)攝取增強(qiáng)以及對Tnfα的炎癥反應(yīng)。此外，突變引發(fā)線粒體功能障礙和肝臟脂肪變性。

slc16a6a編碼一種酮體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，研究表明，高蛋白低碳水化合物生酮飲食可導(dǎo)致斑馬魚rmn突變體(slc16a6as951)發(fā)生大規(guī)模肝臟脂肪變性，并伴有肝組織中總脂、TG和游離脂肪酸(FFAs)的顯著增加，而血脂、血糖和肝臟膽固醇水平無變化。

轉(zhuǎn)基因模型：轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛應(yīng)用于將外源靶基因整合到動物基因組中，從而使新的生物學(xué)性狀在后代中穩(wěn)定地遺傳和產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因斑馬魚也可以進(jìn)行熒光標(biāo)記，可用于深入研究特定基因的功能、細(xì)胞遷移和分化以及NAFLD等疾病的發(fā)病機(jī)制。

大麻素受體1 (Cb1r)在轉(zhuǎn)基因品系Tg(-2.8fabp10a: tetooff-Cb1r-2a- egfp)two23的肝臟條件表達(dá)促進(jìn)肝臟脂質(zhì)積累和脂肪變性，在食物攝入、體重增加和與肥胖相關(guān)的一些病理特征中起關(guān)鍵作用。此外，Cb1r的過表達(dá)激活了脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c (Srebp-1c)及其靶酶乙酰輔酶a羧化酶1 (Acc1)和脂肪酸合成酶(Fas)以及從頭脂肪酸合成。

轉(zhuǎn)基因系Tg(-2.8fabp10a:GFP-Yy1)two16肝臟中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子陰陽1 (Yy1)過表達(dá)，通過抑制CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α同源蛋白10 (Chop-10)的表達(dá)水平，促進(jìn)Tg在肝臟中的積累，從而促進(jìn)肝臟氧化應(yīng)激和肝損傷。

轉(zhuǎn)基因系Tg(lfabp:dnFgfr1-EGFP)zf421在斑馬魚肝細(xì)胞中表達(dá)顯性陰性成纖維細(xì)胞生長因子受體1 (Fgfr1)。組織學(xué)分析表明，這種基因干預(yù)導(dǎo)致斑馬魚幼體肝臟發(fā)育缺陷。3月齡時，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，并進(jìn)一步發(fā)展為肝脂肪變性和膽汁淤積。

激活轉(zhuǎn)錄因子4 (Atf4)參與多種代謝疾病的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)基因系Tg(?-2.5actb1:Tetoff-Atf4-2A-mCherry)zf2124在缺乏多西環(huán)素(Dox)的情況下選擇性表達(dá)Atf4，從而上調(diào)參與脂質(zhì)生物合成和UPR激活的多個基因，從而影響斑馬魚幼魚細(xì)胞內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累和肝臟脂肪變性。此外，用HFD飼喂轉(zhuǎn)基因魚可誘導(dǎo)NASH樣病理改變的形成。

圖3 斑馬魚NAFLD模型的應(yīng)用

斑馬魚模型有助于NAFLD研究揭示特定基因和途徑在NAFLD進(jìn)展中的作用，評估藥物和外源性化學(xué)物質(zhì)的肝毒性，以及鑒定新的治療NAFLD的化合物。

長期飲酒是世界范圍內(nèi)慢性肝病的主要原因，酒精對肝臟的急性影響尤其令人擔(dān)憂。近年來，斑馬魚幼魚已成為一種新的酒精性肝病脊椎動物模型。

有研究報道了一種直接誘導(dǎo)斑馬魚急性乙醇性肝損傷的方法。具體來說，就是將肝臟發(fā)育后的幼魚暴露于乙醇中，其肝細(xì)胞中乙醇脫氫酶和細(xì)胞色P450（CYP）家族成員的表達(dá)水平就發(fā)生顯著改變。在最初的12h內(nèi)，乙醇能夠誘導(dǎo)斑馬魚出現(xiàn)肝腫大等表型，而且這些效應(yīng)會隨著時間的推移而逐步加劇。如果在24h內(nèi)去除乙醇，這些效應(yīng)是可逆的，但是隨著暴露時間的延長，這些效應(yīng)會加劇，甚至導(dǎo)致星形細(xì)胞的激活。此外，每一次斑馬魚成魚交配產(chǎn)生的胚胎數(shù)目足夠保證在每個實(shí)驗(yàn)中可以同時控制多個變量，如乙醇濃度和暴露時間。不僅如此，斑馬魚幼魚實(shí)驗(yàn)可以重復(fù)多次，展現(xiàn)出較強(qiáng)統(tǒng)計功能和詳細(xì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計的優(yōu)勢。因此，目前最有效的研究主要集中在幼魚對乙醇的急性效應(yīng)上。然而，由于年齡的顯著差異，幼魚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不能準(zhǔn)確地概括人類酗酒的狀況。因此，研究者逐步開始將斑馬魚成魚作為研究酒精肝的模式生物。

近期研究者發(fā)現(xiàn)，低濃度乙醇（0. 2%）處理成年斑馬魚4周能夠引起脂肪變性和肝細(xì)胞膨脹，促進(jìn)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、血糖和三酰甘油顯著升高。此外，結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)參與糖脂代謝、線粒體生物發(fā)生和功能、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的基因表達(dá)水平顯著上調(diào)?？傊诘蛣┝柯跃凭┞断?，成年斑馬魚很好地再現(xiàn)了ALD患者的病理、代謝和應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)。因此，低劑量慢性乙醇處理足以引起酒精誘導(dǎo)的成年斑馬魚肝脂肪變性和損傷。成年斑馬魚ALD模型可以作為研究人類慢性肝病的替代動物模型。

近些年，基于斑馬魚模型進(jìn)行的FLD的機(jī)制研究也取得了極大進(jìn)展。甘油三酯積累是急性和慢性酒精濫用中最常見的特征之一。與NAFLD相同，脂肪生成增加、脂質(zhì)降解減少和脂蛋白輸出失敗是酒精性脂肪變性的主要機(jī)制。平均而言，乙醇暴露處理24h能夠引起60%以上斑馬魚發(fā)生脂肪變性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果是由甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的脂肪生成所引起的，在某種程度上和老鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有極大的相似性。而且使用突變的斑馬魚阻斷甾醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的激活，能夠阻止乙醇誘導(dǎo)的脂肪變性。在這些研究中，即使沒有脂肪堆積，也會發(fā)生肝細(xì)胞功能障礙。

眾所周知，ROS能夠參與ALD發(fā)展過程中的每一個方面，而且還和肝細(xì)胞蛋白、細(xì)胞膜和DNA的氧化密切相關(guān)，因此二者被認(rèn)為是引起ALD患者肝細(xì)胞功能障礙的主要原因。體內(nèi)穩(wěn)定的ROS水平能夠限制饑餓介導(dǎo)的脂肪變性，相反，CYP介導(dǎo)的乙醇代謝能夠產(chǎn)生較高水平的ROS，進(jìn)而會導(dǎo)致線粒體功能紊亂，從而降低脂質(zhì)氧化，導(dǎo)致脂肪變性。在斑馬魚中，乙醇引起的肝臟損傷常常伴有氧化應(yīng)激損傷。與大鼠相似，阻斷乙醇代謝或服用抗氧化劑可減少斑馬魚的脂肪變性，改善肝臟功能。因此，氧化應(yīng)激是乙醇引起肝臟損傷的一個保守方面。雖然抗氧化劑對ALD或酒精性肝炎患者的作用不大，但斑馬魚可以為篩選治療方案或聯(lián)合治療提供一個平臺，以改善ALD患者的預(yù)后。

在酒精患者中，血清蛋白缺乏在一定程度上能夠反映肝細(xì)胞分泌受損情況。UPR激活（通常與ER應(yīng)激互換使用）可能是ALD分泌通路功能障礙的先兆。研究發(fā)現(xiàn)NAFLD斑馬魚體內(nèi)的UPR標(biāo)記物有較強(qiáng)的上調(diào)，而肝細(xì)胞分泌標(biāo)記物卻有顯著下降，說明乙醇處理能夠引起斑馬魚的肝臟分泌通路功能發(fā)生紊亂。在斑馬魚的遺傳學(xué)研究中，aft6是乙醇誘導(dǎo)脂肪變性的充分必要條件，UPR活化可以引起乙醇誘導(dǎo)的肝臟疾病。這些發(fā)現(xiàn)表明atf6是酒精誘導(dǎo)FLD的重要中介物質(zhì)。有趣的是，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)乙醇誘導(dǎo)的UPR-ome與atf6過表達(dá)誘導(dǎo)的基因幾乎完全重疊。因此，atf6可能作為一種機(jī)制，感知和介導(dǎo)肝細(xì)胞蛋白分泌對酒精的反應(yīng)，這有望能夠?qū)LD與FLD的其他病因區(qū)分來。IMRAN M等最近的研究使用斑馬魚幼魚來測試膜重塑對肝臟毒性的影響，結(jié)果表明將肥胖斑馬魚幼魚同時暴露于苯并芘和乙醇能夠通過膜重塑誘導(dǎo)斑馬魚肝臟毒性。

以上談到的研究結(jié)果都有助于促使科學(xué)家開發(fā)出一種治療脂肪肝疾病及其相關(guān)危險因素的方法。FLD的治療策略主要集中在肝臟脂質(zhì)調(diào)節(jié)和抗氧化方面。目前，斑馬魚NAFLD模型已經(jīng)被廣泛的用于中藥中具有顯著NAFLD治療活性的化合物的篩選和評價。