摘要
背景:冠狀動脈阻塞后的缺血性心臟病導(dǎo)致心臟組織死亡和纖維化疤痕的形成。與成年哺乳動物相比，斑馬魚的心臟在損傷后可以再生，這使得研究潛在機(jī)制成為可能。成年斑馬魚心臟損傷后最早的反應(yīng)之一是冠狀動脈血管重建術(shù)。這一過程中的缺陷導(dǎo)致心肌細(xì)胞再生受損和瘢痕形成。因此，識別和研究促進(jìn)冠狀動脈血運(yùn)重建的因素具有很大的治療潛力。
方法:我們使用整體成像、免疫組織化學(xué)和組織學(xué)來評估斑馬魚心臟再生的各個方面。深入的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析使我們能夠確定Vegfc(血管內(nèi)皮生長因子C)信號的靶標(biāo)和潛在效應(yīng)物。我們使用新生成的功能喪失和功能獲得遺傳工具來研究Emilin2a(彈性蛋白微纖維界面2a)和Cxcl8a(趨化因子(C-X-C)基序配體8a)- cxcr1(趨化因子(C-X-C)基序受體1)信號在心臟再生中的作用。
結(jié)果:我們首先表明，再生的冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞在成年斑馬魚心臟損傷時上調(diào)vegfc，并且vegfc信號是其再生過程中增殖所必需的。值得注意的是，阻斷Vegfc信號還能顯著減少心肌細(xì)胞的去分化和增殖。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，我們確定了emilin2a是Vegfc信號的靶點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)操縱emilin2a的表達(dá)可以調(diào)節(jié)冠狀動脈血運(yùn)重建和心肌細(xì)胞增殖。機(jī)制上，Emilin2a在心外膜源性細(xì)胞中誘導(dǎo)趨化因子基因cxcl8a的表達(dá)，而cxcl8a受體基因cxcr1在冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。我們進(jìn)一步表明，在心臟再生過程中，Cxcl8a-Cxcr1信號傳導(dǎo)也是冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖所必需的。
結(jié)論:這些數(shù)據(jù)表明，心臟損傷后，冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)vegfc，促進(jìn)冠狀動脈網(wǎng)絡(luò)重建和心臟再生。在機(jī)制上，Vegfc信號上調(diào)心外膜emilin2a和cxcl8a的表達(dá)，促進(jìn)心臟再生。這些研究有助于理解斑馬魚冠狀動脈血運(yùn)重建的機(jī)制，對促進(jìn)受傷人類心臟的血運(yùn)重建和再生具有潛在的治療意義。
關(guān)鍵詞:冠狀血管、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌梗死、再生、斑馬魚。
前言
缺血性心臟病是由冠狀動脈狹窄引起的流向心臟的血液減少引起的。冠狀動脈阻塞導(dǎo)致心肌梗死(MI)，導(dǎo)致下游組織死亡。這些事件導(dǎo)致心臟纖維化和重塑，因此，鑒于成年哺乳動物心臟無法再生，這給醫(yī)學(xué)帶來了重大挑戰(zhàn)。在人類心肌梗死后，新的毛細(xì)血管通過血管生成從原有的毛細(xì)血管中生長出來，以幫助受傷組織重新充氧。此外，在動脈生成過程中，心外膜側(cè)支通過預(yù)成型側(cè)支的擴(kuò)大和增寬而發(fā)育，以幫助缺血區(qū)域。與側(cè)支形成程度較小的患者相比，側(cè)支形成程度較大的患者在心肌梗死后表現(xiàn)出更好的預(yù)后。這些觀察結(jié)果促使研究人員開發(fā)血管生成和動脈生成療法來治療心肌梗死，然而，臨床試驗證明是無效的。因此，了解在再生環(huán)境中調(diào)節(jié)冠狀動脈網(wǎng)絡(luò)重建的機(jī)制可能最終導(dǎo)致有益的臨床結(jié)果。在過去的二十年里，斑馬魚被廣泛用作研究心臟再生的模式生物，因為它的心臟具有非凡的再生能力。最近的研究表明，受損組織的冠狀動脈血運(yùn)重建對于完整的再生反應(yīng)至關(guān)重要。在斑馬魚心臟損傷后，冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(cECs)迅速進(jìn)入細(xì)胞周期并重建損傷組織。再生的冠狀動脈從先前存在的血管表面和心室內(nèi)發(fā)芽，形成一個支架，供心肌細(xì)胞重新填充受傷的組織。阻斷這一過程會減少心肌細(xì)胞的增殖和受傷組織的再生，以及增加疤痕?？紤]到冠狀動脈血運(yùn)重建的重要性，確定有助于這一過程的分子具有巨大的治療潛力。
最近的研究強(qiáng)調(diào)了血管分泌因子在組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中的重要性。血管分泌分子由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，可對鄰近組織產(chǎn)生各種影響。在眾多血管分泌分子中，Vegfc(血管內(nèi)皮生長因子C)在心室冷凍損傷和切除后其基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)，并且在成年小鼠心臟心肌梗死后，腹腔注射VEGFC可以改善心輸出量和表現(xiàn)。Vegfc調(diào)節(jié)小鼠和斑馬魚發(fā)育過程中以及成年斑馬魚心臟中的淋巴管生成。VEGFC還調(diào)節(jié)不同發(fā)育環(huán)境下的血管新生。例如，添加VEGFC可以刺激雞胚胎和小鼠角膜的血管新生發(fā)芽。在斑馬魚中，使用morpholinos抑制vegfc可減少節(jié)間血管發(fā)芽。相反，在斑馬魚胚胎中，過表達(dá)一種構(gòu)成活性形式的人類VEGFC導(dǎo)致節(jié)段間血管過度增生，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了vegfc在調(diào)節(jié)血管新生中的作用。最近的研究也表明VEGFC在調(diào)節(jié)冠狀動脈發(fā)展中起重要作用。Vegfc突變小鼠的心室顯示心外膜下冠狀動脈的覆蓋范圍和分支顯著減少。此外，冠狀動脈疾病患者的隊列研究進(jìn)一步表明，高水平循環(huán)VEGFC的患者預(yù)后更好。此外，心肌內(nèi)給藥VEGFC促進(jìn)了豬心肌梗死后側(cè)支動脈的形成。然而，VEGFC信號誘導(dǎo)心臟損傷后冠狀動脈血運(yùn)重建或側(cè)支形成的機(jī)制尚不清楚。
本研究表明，成年斑馬魚心臟損傷后，Vegfc信號通過正向調(diào)節(jié)emilin2a(一種編碼細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的基因)的表達(dá)，促進(jìn)cEC和心肌細(xì)胞增殖。使用組織特異性功能增益工具，我們發(fā)現(xiàn)Emilin2a也是一種誘導(dǎo)cEC增殖和疤痕消退的促再生因子。在機(jī)制上，Emilin2a誘導(dǎo)心外膜源性細(xì)胞(EPDCs)中趨化因子基因cxcl8a的表達(dá)，而其受體cxcr1在再生的cECs中表達(dá)。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，Cxcl8a-Cxcr1信號同樣是冠狀動脈血運(yùn)重建和疤痕消退所必需的?？偟膩碚f，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了血管分泌分子Vegfc在調(diào)節(jié)基質(zhì)相關(guān)因子中的作用，從而為成年斑馬魚的心臟再生創(chuàng)造更寬松的環(huán)境。
材料和方法
斑馬魚的處理符合機(jī)構(gòu)(MPG)和國家動物福利立法，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行維護(hù)(https://zfin.org)。涉及動物的程序按照達(dá)姆施塔特地區(qū)委員會獸醫(yī)部門的規(guī)定進(jìn)行并經(jīng)其批準(zhǔn)。本研究大部分使用長度為27-28毫米的3個月大的雄性和雌性斑馬魚。除圖S2E-F外，在所有情況下都使用了野生型(WT)。我們使用了先前發(fā)表的細(xì)胞系Tg(hsp701:slft4)bns82、Tg(hsp701:vegfaa121-F17A)bns100(以下簡稱Tg(hsp701:dn-vegfaa))、Tg(-0.8flt1:RFP)hu5333、Tg(my17:DsRed)s879、TgBAC(tcf21:NTR-mCherry) pd10879(以下簡稱Tg(tcf21:mCherry))、TgBAC(tcf21:CreERT2)pd42、Tg(-5.2lyve1b:DsRed)nz101、Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)wz2、vegfchu5055、vegfdbns257和cxcr1sa14414。如前所述進(jìn)行冷凍損傷。通過將斑馬魚置于預(yù)熱系統(tǒng)水(39?C)中每12小時進(jìn)行1小時的熱休克處理，誘導(dǎo)hsp70l驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。Tg (hsp70l: sflt4);TgBAC(tcf21:CreERT2)、Tg(hsp701:loxP-CFP-loxPemilin2a-p2A-mCherry);在冷凍損傷前連續(xù)3天，在成年斑馬魚中腹腔注射10μl 1.25 mM 4-羥他莫昔芬(Sigma (Cat#H7904))或載體(乙醇)，然后在39?C下每天熱休克1小時，每12小時。Tg(-0.8flt1:RFP)斑馬魚用SB225002 (Sigma (Cat#182498-32-4))或DMSO注射20μl 0.01 mM DMSO (Sigma (Cat#D4540))或20μl 0.01 mM SB225002(溶解在DMSO中，用水稀釋)。在心內(nèi)注射Qdots 705 (Qtracker Q21061MP, Thermo Fisher Scientific)時，先用0.02%的三卡因麻醉斑馬魚。切開一個小切口露出心室，用微注射器將5μl Qdots 705注射到心臟組織中。斑馬魚被留在水中恢復(fù)。然后在注射后90分鐘內(nèi)解剖心臟。
突變和轉(zhuǎn)基因系的構(gòu)建
為建立Tg(hsp701:emilin2a, cryaa:CFP)bns504系，在單細(xì)胞期向WT斑馬魚胚胎注射25 pg/nl的hsp701:emilin2a, cryaa:cerulean質(zhì)粒DNA和I-Sce酶(NEB (Cat# R0694S))。將注射后的胚胎培養(yǎng)至成年，通過檢測CFP在幼魚眼中的表達(dá)來篩選奠基者。為了建立Tg(hsp701:loxP-CFP-loxP-emilin2a-p2A-mCherry)bns510系(以下簡稱Tg(hsp701:LCLemilin2a-p2A-mCherry))，在單細(xì)胞期向WT斑馬魚胚胎注射30 pg/nl的hsp701:loxP-CFP-loxP-emilin2a-p2A-mCherry質(zhì)粒DNA和50 ng/μl的Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA。培養(yǎng)注射胚胎，進(jìn)行2次39℃高溫沖擊，每次1小時，通過異種雜交篩選胚胎中CFP的表達(dá)。如前所述，使用CRISPR-Cas9技術(shù)使用兩個gRNAs分別靶向外顯子1和9，序列為AGCAGTGCGGACCAAGGCCA和TACCCGTCAAGTCTGTTCCA，生成emilin2abns556全位點(diǎn)缺失等位基因。使用該方法，刪除了31.1 kb的基因組區(qū)域，并使用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR主混合物(Thermo Fisher Scientific (Cat# F415S))和以下程序進(jìn)行PCR鑒定突變體:在50°C孵育2分鐘，在95°C預(yù)擴(kuò)增10分鐘，然后在95°C和60°C分別進(jìn)行40次擴(kuò)增10秒和30秒。引物序列列于表S2。使用序列為CCTTGATGACAACTGGAC的gRNA生成了cxcl8avu660等位基因，該基因在第3外顯子上缺失了28個堿基對，插入了12個堿基。合成gRNA時，將2.5 μL含BSA的2x NEB緩沖液2與1μL 10μM的通用寡核苷酸t(yī)tttgcaccgactcggtgccacttttcaagttgataacactccttttcaagttgattctctaaaa和1 μL 10μM的位點(diǎn)特異性寡核苷酸t(yī)aatacactcactataggccttgatgacaactggacgttttagagctagaaatagcaag混合。寡核苷酸使用以下程序退火:98?C 1分鐘，冷卻到37?C，斜坡速度為- 0.1?C/s。500 μM的dNTP和T4 DNA聚合酶(NEB (Cat# M0203S))加入到退火混合物中，在12?C下孵育20分鐘。在75℃下孵育20分鐘，使T4 DNA聚合酶失活。使用MEGA短腳本T7試劑盒(Invitrogen (Cat# AM1354))按照制造商的方案合成gRNA。使用PrimeStar (Takara (Cat# R045))進(jìn)行PCR鑒定突變體，程序如下:95°C預(yù)擴(kuò)增2分鐘，然后在95°C、60°C和72°C分別進(jìn)行40次擴(kuò)增，擴(kuò)增時間為10秒、60°C和72°C(引物序列列于表S2)，然后對ms11酶擴(kuò)增子進(jìn)行限制性酶解(NEB (Cat# R0571S))。
組織學(xué)分析、成像和定量
解剖斑馬魚心臟，在4%多聚甲醛室溫下固定1小時。將心臟包埋在OCT (Tissue-Tek)中，切成8μm的切片。對于每個生物重復(fù)，使用3個非淺表非連續(xù)正中矢狀面切片進(jìn)行成像和定量。如前所述進(jìn)行免疫染色。使用的一抗:抗me2 (Santa Cruz Biotechnology, Cat#sc-313, AB_631920)， 1:20)，抗n2.261 (DSHB, RRID: AB_531790, 1:20)，抗gfp (Aves Labs (Cat#GFP-1010, AB_2307313)， 1:50)，抗rfp (Rockland (Cat# 600-401-379,AB_2209751)， 1:20)，抗pcna (Santa Cruz Biotechnology, Cat#sc-56, AB_628110, 1:500)和抗fli1a (Abcam (Cat#ab133485, AB_2722650)， 1:100)。使用的二抗:Alexa Fluor 488山羊抗雞IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat# A-11039, AB_142924)， 1:500)， Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat#A-11029, AB_138404)， 1:500)， Alexa Fluor 568山羊抗小鼠IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat# A-11004, AB_2534072)， 1:500)， Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat# A-21244, AB_2535812)， 1:500)。對照實驗通過從免疫染色過程中省略一抗來進(jìn)行。使用LSM700顯微鏡(蔡司)獲得共聚焦圖像。對于cEC的增殖分析，使用ZEN Blue軟件計算損傷組織和損傷邊界區(qū)域200μm內(nèi)cEC總數(shù)的比值，計算增殖cEC的百分比。對于CM去分化和增殖分析，使用ZEN Blue軟件計算去分化/增殖CM的百分比，以傷害邊界區(qū)100μm內(nèi)CM總數(shù)的比率計算。對于冠狀動脈覆蓋分析，使用ImageJ軟件在至少4個生物重復(fù)的全量圖像中計算熒光強(qiáng)度百分比與受傷組織背景熒光的比值。Qdots整體成像采用蔡司Lightsheet Z.1顯微鏡，圖像處理采用ZEN Blue軟件。使用AFOG(酸性品紅橙G)染色試劑盒(Biognost (Cat#: AFOG100T))按照制造商的方案進(jìn)行AFOG染色，不進(jìn)行H&E染色。使用尼康SMZ25立體顯微鏡拍攝圖像。對于疤痕面積分析，使用ImageJ軟件在至少4個生物重復(fù)的每個腦室的3個非連續(xù)切片中計算疤痕面積與總腦室面積的比值。對于原位雜交，將解剖的心臟在無菌的4%多聚甲醛中固定在4?C過夜。心臟在PBS中洗滌兩次，持續(xù)5分鐘，然后通過depc水中的乙醇梯度孵育15-30分鐘:50%、70%、80%、95%和100%，室溫下。心臟在50%二甲苯乙醇和100%二甲苯中洗滌30分鐘，室溫下，在50?C的100%石蠟中洗滌3次，持續(xù)1小時。將心臟包埋在石蠟中，在4?C保存，切片成8μm的切片，并在室溫下保存。切片在二甲苯中洗滌兩次，持續(xù)10分鐘，然后在depc水中的乙醇梯度中再水化2分鐘:100%、95%、80%、70%和50%。然后用TBST (Tris 50mM pH 7.4, NaCl 150mM, 0.05% Tween-20)洗滌2次，共5分鐘。然后載玻片在無菌的4% PFA中孵育20分鐘，然后在TBST中洗滌2次。將載玻片用TBS (Tris 50mM pH7.4, NaCl 150mM) + CaCl2 2mm)稀釋的0.5μg/mL蛋白酶K在37℃下孵育15分鐘，然后用冷Tris/Glycine (Tris 50mM pH7.4, 50mM Glycine)洗滌5分鐘以停止反應(yīng)。載玻片在TBST中洗滌兩次，然后在無菌的4% PFA中重新固定5分鐘，并用TBST洗滌。載玻片浸泡在三乙醇胺(0.1 M, pH 8.0)中，加入乙酸酐至0.25%，攪拌12分鐘。該步驟之后，在60?C - 65?C條件下，使用雜交緩沖液(50%甲酰胺，5X SSC, 0.1% Tween-20, 50μg/ml肝素，500μg/ml酵母t-RNA, 460μl 1M檸檬酸)進(jìn)行兩次TBST洗滌和切片預(yù)雜交至少1小時。探針(雜交緩沖液中1μg/ml)在60?C - 65?C下變性15分鐘，并在60?C - 65?C下過夜。在60?C - 65?C條件下，用50%甲酰胺在2X SSC中洗滌30分鐘?；脽羝幌丛?0?C - 65 C?15分鐘一次2 x SSC和兩次0.1 x SSC,其次是TBST洗在RT,幻燈片在37?C 15分鐘洗一次2 x SSC和兩次在1 x SSC,其次是TBST洗在RT,幻燈片孵化在屏蔽解決方案(TBST + 0.5% BSA)至少1小時沿Antidigoxigenin(羅氏(貓# 11093274910),1:1000阻礙解決方案)應(yīng)用于幻燈片在RT至少2個小時。然后用TBST沖洗5次。將預(yù)過濾的BM Purple (Roche (Cat#: 11442074001))添加到載玻片中，在黑暗潮濕的室中孵育最多2小時。信號出現(xiàn)后，用TBST洗滌載玻片，在4% PFA中固定5分鐘，然后裱片。使用尼康SMZ25立體顯微鏡拍攝圖像。表S2列出了用于生成反義探針的引物。
vegfc mRNA注射
從24 hpf胚胎cDNA中擴(kuò)增出全長的vegfc cDNA，克隆到PCS2+中。用Not1酶(NEB (Cat# R3189S))線性化后，使用mMessage mMachine SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen (Cat# AM1340))體外轉(zhuǎn)錄vegfc mRNA。在單細(xì)胞期向WT胚胎注射100 pg vegfc mRNA。然后從48個注射和未注射vegf的hpf胚胎中提取RNA進(jìn)行RT-qPCR。
細(xì)胞分類
使用Pierce初級心肌細(xì)胞分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific (Cat# 88281))，按照制造商的說明進(jìn)行以下修改，解剖和消化成年斑馬魚心室:在30?C下進(jìn)行孵育，輕輕搖晃(300 rpm) 45分鐘，然后在含有0.25% BSA的1X HBSS中重懸浮細(xì)胞。細(xì)胞懸液通過40uM尼龍網(wǎng)過濾，并使用BD FACSAria?III (BD Biosciences)儀器進(jìn)行分類。采用30mW 405nm激勵，配以450/50 nm帶通濾光片，剔除DAPI (Sigma (Cat#D954))陽性細(xì)胞，選擇活細(xì)胞。分類心外膜細(xì)胞(Tg(tcf21:mCherry)+)時，采用50mW 561nm激發(fā)，配以610/20nm帶通濾光片檢測mCherry熒光;冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Tg(-0.8flt1:RFP)+)、心肌細(xì)胞(Tg(myl7:DsRed)+)和非心肌細(xì)胞(Tg(myl7:DsRed)-)的RFP和DsRed熒光在50mW 561 nm的激勵下與586/15帶通濾光片配合測量。分類后的細(xì)胞用500μl Trizol重懸，提取RNA。
RT-qPCR
對于定量RT-PCR (RT-qPCR)，從手術(shù)或冷凍損傷的心臟的整個心室中提取RNA，每個生物重復(fù)使用一個心室，或從損傷的組織中提取RNA，每個生物重復(fù)使用4個心室。使用RNA清潔濃縮器提取試劑盒(Zymo (Cat# R1013))按照制造商的方案進(jìn)行RNA提取。250ng RNA使用Maxima第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific (Cat# K1641))按照制造商的協(xié)議進(jìn)行cDNA合成。對于分類的細(xì)胞，使用RNeasy Mini kit (Qiagen)提取RNA, 100 ng RNA用于cDNA合成。使用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR主混合試劑(Thermo Fisher Scientific (Cat# F415S))和CFX Connect Real-Time BioRad機(jī)器進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，程序如下:在95°C下預(yù)擴(kuò)增7分鐘，然后在95°C下擴(kuò)增5秒，在60°C下擴(kuò)增20秒，使用熔化曲線從60°C到92°C，每5秒增加1.0°C。引物序列列于表S2。將rpl13a作為管家基因的mRNA水平歸一化，并使用log 2ΔΔCt方法計算折疊變化84。rpl13a在腦室的RT-qPCR表達(dá)的平均Ct值為18.5-20。所有RT-qPCR在分類細(xì)胞上rpl13a表達(dá)的平均Ct值為23-25。對于HUVECs實驗，mRNA水平針對GAPDH作為管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有RT-qPCR數(shù)據(jù)的平均Ct值列于表S3。
RNA序列
在24hpci時解剖WT和Tg(hsp701:sflt4)心臟。去除心房和動脈球，僅用心室進(jìn)行RNA測序。每個生物重復(fù)使用3個心室池。使用miRNeasy micro kit (QIAGEN)結(jié)合柱上dna酶切(dase - free DNase Set, QIAGEN)分離總RNA。用LabChip Gx Touch 24 (Perkin Elmer)檢測總RNA和文庫完整性。使用500 ng總RNA作為輸入，按照制造商的方案(Vazyme)制備VAHTS鏈RNA-seq文庫。測序在NextSeq500儀器(Illumina)上使用v2化學(xué)進(jìn)行，每個文庫平均有43M個reads，單端設(shè)置為1x75bp。使用FastQC(可在http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/ projects/ FastQC上在線獲得)評估生成的原始讀取的質(zhì)量、適配器內(nèi)容和重復(fù)率。Trimmomatic版本0.38用于在10個核苷酸的窗口中修剪質(zhì)量下降到Q20平均值以下的讀數(shù)。在隨后的分析中，只使用了30到150個核苷酸之間的讀數(shù)。使用STAR 2.6.1d，參數(shù)為“outFilterMismatchNoverLmax 0.1”，將修剪和過濾后的reads與Ensembl斑馬魚基因組版本DanRer11 (GRCz11.92)進(jìn)行比對，將不匹配與映射長度的最大比例增加到10%。使用Subread包中的featurets 1.6.3工具統(tǒng)計與基因匹配的reads數(shù)。只有至少部分位于外顯子內(nèi)的reads被接受并聚集在每個基因上，而重疊多個基因或?qū)R多個區(qū)域的reads被排除在進(jìn)一步的分析之外。使用DESeq2 version 1.18.1對差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定。共檢測了17221個基因。只有倍數(shù)變化最小值為±0.585,benjamin - hochberg校正p值≤0.05，且5個reads的最小組合平均值為顯著差異表達(dá)的基因才被認(rèn)為是顯著差異表達(dá)。Log2倍變化0.585反映了1.5倍的上下調(diào)節(jié)，并構(gòu)成了消除微小變化的穩(wěn)健截斷?；贓nsembl基因標(biāo)識符(Activities at The Universal Protein Resource (UniProt))，使用UniProt數(shù)據(jù)(發(fā)布日期:06.06.2014)豐富了Ensembl注釋。構(gòu)建了熱圖，顯示了兩種情況下表達(dá)差異最大的前50個基因。這些基因的DESeq2(1.18.1)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)計數(shù)在每個條件下平均，并在R studio(1.4.1717)中使用ComplexHeatmap包繪制，使用堪拉距離和分層聚類的z分?jǐn)?shù)。Z-score，一個值高于或低于所有值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)，是通過將規(guī)范化讀數(shù)插入R studio生成的，R studio使用scale()函數(shù)計算Z-score。
細(xì)胞培養(yǎng)
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)從Lonza或Life technologies購買，使用到第六代。HUVECs在內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2, Lonza)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加胎牛血清、氫化可的松、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、r3 -胰島素樣生長因子、抗壞血酸、人表皮生長因子、GA-1000和肝素(EGM-2 BulletKit, Lonza)，以及100單位/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。劃痕實驗是通過在24孔板上每孔播種30,000個細(xì)胞，并在播種后24小時使用移液管尖端進(jìn)行劃痕實驗。刮傷后6小時收集細(xì)胞進(jìn)行RNA分離。
RNA干擾
在HUVECs中，VEGFC被siRNA雙鏈靶向(Mission esiRNA, Sigma (Cat# EHU013781))。使用Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen (Cat# 13778030))按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染(最終siRNA濃度:10 pmol/well)。在所有RNAi實驗中，細(xì)胞接種于24孔板中，并在達(dá)到80%匯合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用10%巰基乙醇(Gibco)裂解細(xì)胞，在裂解緩沖液(Invitrogen)中裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后分離RNA進(jìn)行RT-qPCR。
統(tǒng)計分析
cEC增殖、熒光強(qiáng)度百分比、CM去分化和增殖以及疤痕面積相對于心室面積百分比的數(shù)據(jù)分布采用Shapiro-Wilks正態(tài)檢驗(閾值:alpha值= 0.05)進(jìn)行評估，數(shù)據(jù)采用Student 's t檢驗或Mann - Whitney非參數(shù)檢驗進(jìn)行比較統(tǒng)計，見圖圖。RT-qPCR分析至少使用了4個生物重復(fù)。對于細(xì)胞分類，每個樣本至少匯集了15個心室。所有RT-qPCR表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)Mann-Whitney非參數(shù)檢驗分析，P<0.05為顯著性。未采用實驗范圍內(nèi)的多重檢驗校正。誤差柱表示平均值±SD，柱表示中位數(shù)。所有統(tǒng)計分析均在GraphPad Prism 8中進(jìn)行。
隨機(jī)化和盲法程序
涉及突變型和WT斑馬魚的實驗隨機(jī)化如下:突變型和WT斑馬魚被安置在同一個水箱中，用于實驗，成像，分析，然后進(jìn)行基因分型。然而，在涉及藥物治療的實驗中(即4-OHT vs. EtOH，或DMSO vs. SB25002)，由于無法區(qū)分對照組和實驗組，或者攜帶熱休克驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的斑馬魚在幼魚階段(即早在實驗之前)進(jìn)行熒光分類，因此沒有進(jìn)行盲法。腦室損傷小于20%的斑馬魚被排除在實驗和分析之外。沒有使用功率計算來確定樣本量，樣本量是基于該領(lǐng)域以前的出版物。
結(jié)果
在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中，vegfc在背主動脈中表達(dá)，并調(diào)節(jié)發(fā)育性血管生成。在成年斑馬魚中，心臟損傷后可誘導(dǎo)vegfc表達(dá)。為了深入了解心臟再生過程中vegfc表達(dá)的時間模式，我們對冷凍損傷后48小時和96小時(hpci)以及冷凍損傷后7天(dpci)的斑馬魚心室進(jìn)行了實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析。我們觀察到，與假手術(shù)組心室相比，vegfc在這些時間點(diǎn)上調(diào)，在96 hpci時表達(dá)水平最高(圖1A)，這與cEC增殖的峰值相吻合。為了確定哪些細(xì)胞類型在心臟再生過程中表達(dá)vegfc，我們對野生型(WT)心室進(jìn)行了原位雜交，并在損傷組織周圍(再生冠狀動脈和EPDCs所在的位置)96 hpci處觀察vegfc表達(dá)(圖1B)。為了更好地確定心臟再生過程中vegfc表達(dá)的來源，我們分別使用Tg(-0.8flt1:RFP)和TgBAC(tcf21:mCherry)系對分類的cECs和EPDCs進(jìn)行了RT-qPCR分析。這些分析顯示，與假手術(shù)組(96 hps)心臟相比，96 hpci時分類cECs中vegfc表達(dá)上調(diào)(圖1C)，但在分類EPDCs(圖S1A和S1B)中沒有。我們還使用Tg(my17:DsRed)系分析了vegfc在分類的成人心肌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)心臟損傷前后vegfc的表達(dá)非常低(圖S1C)。這些結(jié)果表明，在斑馬魚心臟再生過程中，cECs上調(diào)了vegfc的表達(dá)。
圖1 vegfc信號通路促進(jìn)斑馬魚心臟損傷后冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(cEC)增殖。A, RT-qPCR分析冷凍損傷后48小時和96小時(hpci)和冷凍損傷后7天(dpci)與假手術(shù)組心臟組織中vegfc mRNA的水平(n=4)。B，未損傷(B')和96 hpci (B'')心臟切片上vegfc的原位雜交表達(dá)。箭頭指向vegfc的表達(dá)。C,RT-qPCR分析96 hpci時，在分類的?0.8flt1:RFP+細(xì)胞(cECs；n=4)中和假手術(shù)組心臟（96 hps）的vegfc mRNA水平。D，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。96 hpci時Tg(- 0.8flt1:RFP) (Ctrl；D')和Tg(- 0.8flt1:RFP)；Tg(hsp701:sflt4) (D'')冷凍損傷的斑馬魚心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)染色切片。箭頭指向PCNA+ cECs。E,96 hpci時Tg(-0.8flt1:RFP) (n=3)和Tg(-0.8flt1:RFP)；Tg(hsp701:sflt4) (n=3)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs的百分比。F，熱休克治療(箭頭)和心臟冷凍損傷示意圖。Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP) (Ctrl；F')和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP);Tg(hsp701:sflt4) (F'')在7 dpci時冷凍損傷心臟的整體圖像。G, 7 dpci時Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP) (Ctrl；n=4)和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)；Tg(hsp701:sflt4) (n=6)心室損傷組織中GFP熒光強(qiáng)度的百分比。黑色(B)、白色(D)和橙色(F)虛線描繪了受損組織。統(tǒng)計檢驗:非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(A、C)， Student’s t檢驗(E、G)。比例尺:100μm (B、D、F)。RT-qPCR數(shù)據(jù)的Ct值列于表S3。D表示dpci;h, hpci。
Vegfc信號通路促進(jìn)斑馬魚心臟冷凍損傷后cEC增殖
心肌損傷后cECs中vegfc的上調(diào)表明在再生過程中起作用。為了驗證這一假設(shè)，我們使用了Tg(hsp701:sflt4)系。熱休克后，可溶性受體sFlt4(可溶性Fms相關(guān)受體酪氨酸激酶4)的表達(dá)被誘導(dǎo)，它作為一個誘餌來阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)。與Tg(hsp701:sflt4)系一起，我們使用Tg(- 0.8flt1:RFP)和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)系來觀察冠狀動脈，它們專門標(biāo)記斑馬魚心室中的cECs(圖S1D)。熱休克方案優(yōu)化后(圖S1E)，我們對Tg(hsp70:sflt4)、Tg(- 0.8flt1:RFP)和Tg(- 0.8flt1:RFP)(對照組)進(jìn)行每日熱休克，并分析它們的心室(圖1D)。我們量化了96 hpci時cEC的增殖，發(fā)現(xiàn)阻斷Vegfc信號導(dǎo)致cEC增殖顯著減少(圖1D和1E)，這也導(dǎo)致7 dpci時受損組織的冠狀血管覆蓋率降低(圖1F和1G)，在對照組斑馬魚中，損傷組織通過再生冠狀動脈廣泛再生。此外，我們觀察到cxcr4a和apln的表達(dá)水平下降(圖S1F)，這兩個基因已被證明可以調(diào)節(jié)斑馬魚的冠狀動脈再生。
在心臟再生過程中，心肌細(xì)胞去分化和增殖以補(bǔ)充受損組織，這一過程部分受到cECs的調(diào)控。因此，我們推斷通過阻斷Vegfc信號通路改變血運(yùn)重建可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞再生缺陷。為了驗證這種可能性，我們對冷凍損傷的Tg(hsp701:sflt4)和非轉(zhuǎn)基因的斑馬魚進(jìn)行了熱休克治療，直到96 hpci，此時血管重建非?；钴S，并分析了7 dpci時心肌細(xì)胞的去分化和增殖。我們發(fā)現(xiàn)，阻斷Vegfc信號可導(dǎo)致心肌細(xì)胞去分化和損傷邊界區(qū)增殖的減少(圖2A至2D和圖S1G)。為了更深入地了解這些心肌細(xì)胞表型，我們分析了vegfr1、vegfr2和vegfr3在分類的心肌細(xì)胞中的表達(dá)，并觀察到損傷前后的mRNA水平非常低或沒有檢測到(圖S1H和S1I)，這表明由于心肌細(xì)胞中Vegfc信號的減少，它們不太可能發(fā)生。接下來，為了測試通過阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)減少冠狀動脈血供重建是否會影響疤痕的消退，我們誘導(dǎo)sflt4的表達(dá)直到96 hpci，即cEC增殖的高峰期12，并分析30和90 dpci時的疤痕面積。我們發(fā)現(xiàn)，在30(圖S1J和S1K)和90(圖2E和2F) dpci時，與接受相同處理的非轉(zhuǎn)基因斑馬魚相比，Vegfc信號被阻斷的心室顯示出明顯更大的疤痕面積，這與最近使用Vegfc+/um18斑馬魚以及Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚的研究結(jié)果一致。
圖2 阻斷Vegfc信號導(dǎo)致斑馬魚心臟損傷后心肌細(xì)胞(CM)去分化和增殖減少。A，熱休克治療(箭頭)和心臟冷凍損傷示意圖。非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；A')和Tg(hsp701:sflt4) (A'')斑馬魚冷凍損傷后7天(dpci)心臟切片的免疫染色;MEF2 (CMs和品紅色)、PCNA(增殖標(biāo)記物，綠色)和DNA (DAPI藍(lán)色)染色切片。箭頭指向PCNA+ CMs。B，7 dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；n=6)和Tg(hsp701:sflt4)(n=6)心室邊界區(qū)PCNA+ CMs的百分比。C，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。7 dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；C')和Tg(hsp701:sflt4) (C'')冷凍損傷斑馬魚心臟切片的免疫染色;MEF2 (cm，洋紅色)、N2.261(胚胎肌球蛋白重鏈，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)染色。箭頭指向N2.261+ CMs。D, 非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；n=7)和Tg(hsp701:sflt4) (n=7)心室邊界區(qū)N2.261+ CMs的百分比。E，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。AFOG染色非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；E')和Tg(hsp701:sflt4) (E'')心室在90 dpci時的切片。橙色、肌肉;紅、纖維蛋白;藍(lán)色是膠原蛋白。F，非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；n=4)和Tg(hsp701:sflt4) (n=5)在90 dpci時心室的疤痕面積相對于心室面積的百分比。白色(A和C)和黑色(E)虛線描繪了受損組織。統(tǒng)計檢驗:Student’s t檢驗(B、D、F)。比例尺:100μm (A、C、E)。
Vegfc調(diào)節(jié)斑馬魚發(fā)育和心臟再生過程中的淋巴管生成。為了排除在全局Vegfc信號干擾下觀察到的再生表型是由于淋巴缺陷引起的，我們對3個月大(≈27-28mm長)的斑馬魚進(jìn)行了損傷，根據(jù)報告基因表達(dá)，在斑馬魚中，淋巴僅在動脈球中觀察到，而在腦室中尚未出現(xiàn)。為了進(jìn)一步測試在這些階段和再生過程中淋巴管的存在，我們在心肌內(nèi)注射了Qdots，這些Qdots被淋巴管吸收和清除，使其可見。這些實驗是在攜帶標(biāo)記淋巴管的Tg(lyve1b:DsRed)轉(zhuǎn)基因的動物身上進(jìn)行的。通過這種方法，我們證實了3個月大的斑馬魚腦室、WT動物的再生實驗以及Vegfc信號阻斷后淋巴的缺失(圖S2A和S2B)。與我們之前對年齡較大(即8個月大)的動物進(jìn)行的實驗類似(圖1D和1E)，我們觀察到與對照組相比，3個月大的Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚在96 hpci下cEC增殖顯著降低(圖S2C和S2D)。這些數(shù)據(jù)表明，阻斷Vegfc信號后血運(yùn)重建的減少與心室淋巴的存在與否無關(guān)。然而，為了研究沒有腦室淋巴管的斑馬魚，我們在接下來的研究中使用了長度為27-28 mm的動物。
由于Flt4 (Vegfr3)是Vegfc和Vegfd的主要受體，因此Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚的心臟再生缺陷可能至少部分是由于Vegfd信號的改變。為了驗證這一可能性，我們對WT、發(fā)育不全的vegfc-/-和vegfd-/-斑馬魚進(jìn)行了冷凍損傷，并分析了96個hpci損傷心室中的cEC增殖情況。值得注意的是，vegfc-/-腦室中cEC增殖減少，但vegfd-/-腦室中沒有cEC增殖減少(圖S2E和S2F)，這與先前的研究結(jié)果一致，vegfd-/-斑馬魚不表現(xiàn)出心臟再生缺陷。這些數(shù)據(jù)表明，sflt4過表達(dá)后cEC再生中觀察到的缺陷是由于阻斷了Vegf信號通路，盡管不能完全排除對其他Vegf信號通路的影響。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，在斑馬魚心臟再生過程中，阻斷Vegfc信號通路會損害冠狀動脈血管重建以及心肌細(xì)胞去分化和增殖。
Vegfc信號誘導(dǎo)ECM基因emilin2a表達(dá)促進(jìn)冠狀動脈血運(yùn)重建
為了深入了解Vegfc信號如何調(diào)控冠狀動脈再生的機(jī)制，我們使用Tg(hsp701:sflt4)系和非轉(zhuǎn)基因斑馬魚系作為對照，阻斷Vegfc信號后，對冷凍損傷的心室進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。我們在24hpci時提取了受傷的心室，并比較了它們的轉(zhuǎn)錄組(圖3A)，將斑馬魚WT心臟再生過程中顯著下調(diào)的基因與上調(diào)的基因進(jìn)行了交叉比對，這些數(shù)據(jù)來自已發(fā)表的數(shù)據(jù)集15(圖S3A)。我們確定了10個候選基因(圖S3A)。接下來，我們進(jìn)行RT-qPCR分析，以評估它們在24 hpci(進(jìn)行RNAseq的時間點(diǎn))和96 hpci(觀察到cEC表型減少的時間點(diǎn))時WT和Tg(hsp701:sflt4)心室中的表達(dá)水平;圖S3B和S3C)。在這些候選基因中，emilin2a是唯一一個在阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)時表現(xiàn)出一致且顯著下調(diào)的基因(圖3B和圖S3B和S3C)。為了驗證emilin2a是否是Vegfc信號的靶點(diǎn)，我們將Vegfc mRNA注射到單細(xì)胞期WT胚胎中，發(fā)現(xiàn)在48 hpf時emilin2a的表達(dá)顯著增加(圖S3D)。由于Vegfc信號調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)芽，我們推斷emilin2a表達(dá)的變化可能是血運(yùn)重建減少的結(jié)果。為了驗證這種可能性，我們分析了Tg(hsp701: nd-Vegfaa)斑馬魚腦室中emilin2a的表達(dá)，Tg(hsp701: nd-Vegfaa)是一種熱休克誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因系，表達(dá)一種主要的陰性形式的Vegfaa，可以阻斷血管再生。我們對WT、Tg(hsp701:sflt4)和Tg(hsp701:dn-vegfaa)斑馬魚每天進(jìn)行1小時熱休克，連續(xù)3天，并通過RT-qPCR分析未損傷腦室上emilin2a的表達(dá)。雖然emilin2a在Tg(hsp701:sflt4)心室中的表達(dá)顯著下調(diào)，但在Tg(hsp701:dn-vegfaa)心室中的表達(dá)保持不變(圖S3E)，進(jìn)一步表明emilin2a是Vegfc信號的靶標(biāo)，而不僅僅是內(nèi)皮標(biāo)志物。為了探索VEGFC-EMILIN2軸在人內(nèi)皮細(xì)胞中也起作用的可能性，我們在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中敲除VEGFC，觀察到EMILIN2表達(dá)顯著降低(圖3C)?？傊?，這些結(jié)果表明EMILIN2是斑馬魚和人類內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFC信號的效應(yīng)者。
圖3 Vegfc信號刺激emilin2a表達(dá)，促進(jìn)斑馬魚心臟再生中的冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(cEC)增殖。A，熱圖顯示非轉(zhuǎn)基因野生型(WT)與Tg(hsp701:sflt4)心臟在冷凍損傷(hpci)后24小時的差異表達(dá)基因?；虼笾路譃閮深?一類包含Tg(hsp70l:sflt4)心室中上調(diào)的基因，另一類包含Tg(hsp70l:sflt4)心室中下調(diào)的基因。B,RT-qPCR分析Tg(hsp70l:sflt4)心室在24和96 hpci的emilin2a mRNA水平與非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl)心臟的對比(n=4)。C, RT-qPCR分析siVEGFC處理(n=4)后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中VEGFC和EMILIN2 mRNA水平與對照組(n=4)的比較。D, RT-qPCR分析48和96 hpci以及冷凍損傷后7天(dpci)損傷組織中emilin2a mRNA水平(n=4)。E, emilin2a在未損傷(E')和96 hpci (E'')心臟切片上的原位雜交表達(dá)。箭頭指向emilin2a表達(dá)。F, RT-qPCR分析分類tcf21:mCherry+細(xì)胞(外膜來源細(xì)胞[EPDCs]；n=4)和分類?0.8flt1:RFP+細(xì)胞(cECs；n=4)在96 hpci和96 hps時的emilin2a mRNA水平。G、RT-qPCR分析分類-0.8flt1:RFP+細(xì)胞(cECs；n=5)和分類tcf21:mCherry+細(xì)胞(EPDCs,n=5)在96 hpci和96 hps時的emilin2a mRNA水平。H, 96 hpci條件下Tg(-0.8flt1:RFP)；emilin2a+/+(H')和Tg(- 0.8flt1:RFP)；emilin2a-/-(H'')斑馬魚冷凍損傷心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)染色切片。箭頭指向PCNA+ cECs。I、96 hpci時，Tg(-0.8flt1:RFP);emilin2a+/+(n=5)和Tg(-0.8flt1:RFP);emilin2a-/-(n=5)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs的百分比。J, 7 dpci時emilin2a+/+ (J')和emilin2a-/-(J'')斑馬魚冷凍損傷心臟切片的免疫染色;MEF2(心肌細(xì)胞[CMs]，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)染色切片。箭頭指向PCNA+ CMs。K, 7 dpci時emilin2a+/+(n=4)和emilin2a-/-(n=4)心室邊界區(qū)PCNA+ CMs的百分比。L, 90 dpci時emilin2a+/+ (L')和emilin2a-/-(L'')心室切片的AFOG染色。橙色、肌肉;紅、纖維蛋白;藍(lán)色是膠原蛋白。M, 90 dpci時emilin2a+/+(n=4)和emilin2a-/-(n=4)心室疤痕面積相對于心室面積的百分比。黑色(E和L)和白色(H和J)虛線描繪了受損組織。統(tǒng)計檢驗:非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(B、C、D、F、G)， Student’s t檢驗(I、K、M)。比例尺:100μM (E、H、J、L)。RT-qPCR數(shù)據(jù)的Ct值列于表S3。D表示dpci;h, hpci。
EMILIN2(彈性蛋白微纖維界面2)是一種糖蛋白，屬于EMI結(jié)構(gòu)域賦予的蛋白質(zhì)超家族，由EMILIN1、EMILIN2、MMRN1和MMRN2組成。先前的研究表明，emilin2a在24 hpf時斑馬魚胚胎的背主動脈中表達(dá)。然而，它在心臟再生中的作用尚不清楚。
接下來，我們分析了冷凍損傷后不同時間點(diǎn)emilin2a的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在96 hpci時，emilin2a在損傷組織中表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)(圖3D)，這與vegfc表達(dá)(圖1A)和cEC增殖的峰值相吻合。通過對心室切片的原位雜交，我們在96 hpci時觀察到emilin2a在損傷組織周圍的表達(dá)，與vegfc表達(dá)相似，而在未損傷的心室中未檢測到表達(dá)(圖3E)。我們進(jìn)一步通過RT-qPCR分析了emilin2a在分類cECs(?0.8flt1:RFP+)和分類EPDCs (tcf21:mCherry+)上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)emilin2a在損傷后兩種細(xì)胞類型中均有表達(dá)(圖3F)，而在心臟損傷前后心肌細(xì)胞中表達(dá)極低(圖S3F)。我們還比較了兩種細(xì)胞類型(EPDCs和cECs)之間emilin2a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EPDCs在96 hpci時的表達(dá)水平高于cECs(圖3G)。
先前的研究表明，在劃痕實驗中，用重組EMILIN2刺激HUVECs可增強(qiáng)其遷移。我們還觀察到，在劃傷后6小時，當(dāng)細(xì)胞積極遷移時，EMILIN2顯著上調(diào)(圖S3G)。此外，EMILIN2的缺失顯著減少了培養(yǎng)小鼠主動脈環(huán)的微血管發(fā)芽，表明其具有血管生成作用。這些數(shù)據(jù)使我們假設(shè)Emilin2a調(diào)節(jié)斑馬魚心臟再生過程中血運(yùn)重建的不同方面。為了驗證這一假設(shè)，我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了一個emilin2a突變等位基因。斑馬魚的基因組包含兩個emilin2基因，emilin2a和emilin2b。由于在斑馬魚基因組中存在emilin2b，我們生成了一個完整的基因座缺失等位基因，以避免可能的轉(zhuǎn)錄適應(yīng)(圖S4A至S4E)。Emilin2a全位點(diǎn)缺失突變體缺乏Emilin2a表達(dá)(圖S4F)，幼魚期無明顯缺陷(圖S4G)。此外，emilin2a-/-心室的大體形態(tài)和冠狀動脈覆蓋范圍與未損傷時emilin2a+/+心室的大體形態(tài)和冠狀動脈覆蓋范圍相當(dāng)(圖S4H)。冷凍損傷后，emilin2a-/-腦室在96 hpci時cEC增殖明顯減少(圖3H和3I)，在7 dpci時冠狀動脈覆蓋受損(圖S5A和S5B)，同時缺乏淋巴管(圖S5C)。此外，emilin2a-/-心室在7 dpci時心肌細(xì)胞增殖明顯減少(圖3J和3K)，在30(圖S5D和S5E)和90(圖3L和3M) dpci時顯示更大的疤痕?？傊@些結(jié)果表明，emilin2a是斑馬魚心臟再生過程中cEC增殖和疤痕消退所必需的。
先前發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，與斑馬魚不同，medaka (Oryzias latipes)是一種不能再生心臟且缺乏冠狀動脈網(wǎng)絡(luò)的硬骨魚，在低溫?fù)p傷后emilin2a沒有上調(diào)(圖S5F)。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示emilin2a突變心室在90 dpci時保留了更大的纖維化疤痕，以及之前提到的HUVEC數(shù)據(jù)46(圖S3G)，這使我們假設(shè)emilin2a可以增強(qiáng)心臟再生。為了驗證這一假設(shè)，我們在熱休克啟動子下產(chǎn)生了表達(dá)emilin2a的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。我們在Tg(hsp701:emilin2a)中量化了96 hpci時cEC的增殖，Tg(- 0.8flt1:RFP)心室與對照組(即Tg(- 0.8flt1:RFP)進(jìn)行相同處理的斑馬魚，圖4)。我們發(fā)現(xiàn)，盡管沒有心室淋巴管(圖S6C)，但過表達(dá)emilin2a顯著增加了96 hpci時cEC的增殖(圖4A和4B)，并在7 dpci時略微增加了冠狀血管覆蓋(圖S6A和S6B)。此外，與非轉(zhuǎn)基因的斑馬魚相比，過表達(dá)emilin2a導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖在7 dpci時增加(圖4C和4D)，在30 dpci時疤痕面積減少(圖4E和4F)。
圖4 emilin2a過表達(dá)可增加斑馬魚心臟再生過程中冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(cEC)的增殖，并可挽救Vegfc信號阻滯。A，熱休克治療(箭頭)和心臟冷凍損傷示意圖。冷凍損傷后96小時斑馬魚(hpci) Tg(-0.8flt1:RFP) (Ctrl；A')和Tg(hsp701:emilin2a)；Tg(-0.8flt1:RFP) (A'')心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)染色切片。箭頭指向PCNA+ cECs。B,96 hpci時Tg(- 0.8flt1RFP) (Ctrl；n=4)和Tg(hsp701:emilin2a)；Tg(- 0.8flt1:RFP)(n=4)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs的百分比。C，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl,C')和Tg(hsp701:emilin2a) (C'')斑馬魚冷凍損傷后7天(dpci)心臟切片的免疫染色;MEF2(心肌細(xì)胞[CMs]，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)染色切片。箭頭指向PCNA+ CMs。D，7 dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；n=6)和Tg(hsp701:emilin2a) (n=6)心室邊界區(qū)的PCNA+ CMs百分比。E，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。AFOG染色非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；E')和Tg(hsp701:emilin2a) (E'')心室在30 dpci時的切片。橙色、肌肉;紅、纖維蛋白;藍(lán)色是膠原蛋白。F，30dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；n=5)和Tg(hsp701:emilin2a) (n=6)心室疤痕面積相對于心室面積的百分比。G，注射乙醇(EtOH)或4-羥基他莫昔芬(4-OHT)后進(jìn)行心臟冷凍損傷和熱休克治療的示意圖(箭頭)。用EtOH (G')或4-OHT (G'')在96 hpci注射Tg(hsp701:sflt4)；TgBAC(tcf21:CreERT2)；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-p2A-mCherry)冷凍損傷的斑馬魚心臟切片的免疫染色;Fli1a(內(nèi)皮細(xì)胞，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)記物，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)切片染色。箭頭指向PCNA+ cECs。H,96 hpci注射EtOH (n=6)或4-OHT (n=4)時Tg(hsp701:sflt4)；TgBAC(tcf21:CreERT2)；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-mCherry)交界區(qū)PCNA+ cECs的百分率。I, EtOH或4-OHT注射后心臟冷凍損傷和熱休克治療示意圖(箭頭)。用EtOH (I')或4-OHT (I'')在30 dpci注射Tg(hsp701:sflt4)；TgBAC(tcf21:CreERT2)；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-p2A-mCherry)冷凍損傷的斑馬魚心臟切片進(jìn)行AFOG染色。J，注射EtOH (n=4)或4- oht(n=4)， 30dpci時Tg(hsp701:sflt4)；TgBAC(tcf21:CreERT2)；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-mCherry)的疤痕面積相對于心室面積的百分比。白色(A、C、G)和黑色(E、I)虛線表示損傷組織。統(tǒng)計檢驗:Student’s t檢驗(B、D、F、H、J)。比例尺:100μm (A、C、G)， 200μm (E、I)。
鑒于這些結(jié)果，我們推斷Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚心臟的冠狀動脈血運(yùn)重建表型可能是通過過表達(dá)emilin2a來拯救的。我們使用HOT-CRE系統(tǒng)，生成了Tg(hsp701:LCL-emilin2a-p2A-mCherry)斑馬魚系，該系與TgBAC(tcf21:CreERT2)系結(jié)合，可以在空間和時間上控制EPDCs中emilin2a的表達(dá)(圖S6D through S6G)。接下來，我們在EPDCs中過表達(dá)emilin2a，同時阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)，并觀察到與未誘導(dǎo)emilin2a表達(dá)的心臟相比，cEC增殖顯著增加(圖4G和4H)。值得注意的是，我們還觀察到心肌細(xì)胞增殖增加(圖S6H和S6I)， 30 dpci時疤痕面積顯著減少(圖4I和4J)?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明emilin2a在EPDCs和cECs中的表達(dá)被Vegfc信號所刺激，它在心臟再生中是必需的，并且可以促進(jìn)心臟再生。
emilin2a誘導(dǎo)EPDCs中cxcl8a的表達(dá)
先前的研究表明，在HUVECs和人胃腫瘤中，EMILIN2通過CXCL8(趨化因子(C-X-C)基序配體8)發(fā)揮其血管生成作用，CXCL8是一種趨化因子，通過G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1(趨化因子(C-X-C)基序受體1)和CXCR2(趨化因子(C-X-C)基序受體2)發(fā)出信號，調(diào)節(jié)傷口愈合的各個方面。值得注意的是，其他研究強(qiáng)調(diào)了CXCL8在體外環(huán)境中作為促血管生成因子的能力。因此，Emilin2a可能在斑馬魚心臟再生過程中誘導(dǎo)cxcl8a的表達(dá)。為了驗證這種可能性，我們首先分析了96 hpci時emilin2a-/-心室中cxcl8a的表達(dá)水平，并觀察到與emilin2a+/+心室相比，cxcl8a的表達(dá)水平顯著降低(圖5A)。此外，與非轉(zhuǎn)基因的斑馬魚相比，我們觀察到96 hpci時Tg(hsp701:emilin2a)心室中的cxcl8a上調(diào)(圖S7A)。為了進(jìn)一步驗證cxcl8a是否在Vegfc信號的下游，我們在阻斷Vegfc信號后分析了cxcl8a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在96 hpci時Tg(hsp701:sflt4)心室中顯著下調(diào)(圖S7B)。相反，將vegfc mRNA注射到單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中導(dǎo)致cxcl8a表達(dá)增加(圖S7C)。在再生心臟中，我們在覆蓋損傷組織的細(xì)胞中觀察到cxcl8a的表達(dá)(圖5B)。為了確定這種表達(dá)的來源，我們對分類EPDCs和分類cECs進(jìn)行了RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)對照組相比，96 hpci時再生EPDCs中cxcl8a表達(dá)增加(圖5C)，但cECs中沒有(圖S7D和S7E)。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明Vegfc信號的下游，ECM蛋白Emilin2a誘導(dǎo)cxcl8a表達(dá)，并且在斑馬魚心臟再生過程中，EPDCs是cxcl8a的來源。
圖5 Emilin2a誘導(dǎo)心外膜衍生細(xì)胞(EPDCs)表達(dá)cxcl8a，促進(jìn)斑馬魚心臟損傷后冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(cEC)增殖。A，冷凍損傷后96小時，emilin2a-/-腦室中emilin2a和cxcl8a mRNA水平的RT-qPCR分析(hpci;n = 4-5)。B，原位雜交法檢測未損傷(B')和96 hpci(B'')心臟切片上cxcl8a的表達(dá)。箭頭指向cxcl8a表達(dá)式。C、RT-qPCR分析96 hpci和96 hps時，分類tcf21:mCherry+ (EPDCs；n=5)中cxcl8a mRNA水平。D, 96 hpci時Tg(- 0.8flt1:RFP)；cxcl8a+/+(D')和Tg(- 0.8flt1:RFP)；cxcl8a-/-(D'')斑馬魚冷凍損傷心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物，綠色)和DNA (DAPI，藍(lán)色)染色切片。箭頭指向PCNA+ cECs。E, 96 hpci時cxcl8a+/+(n=7)和cxcl8a-/-(n=6)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs百分比。F,冷凍損傷后7天(dpci)Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)；cxcl8a+/+(F')和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)；cxcl8a-/-(F'')斑馬魚的心室整體圖像。G,GFP熒光強(qiáng)度在7 dpci時Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)，cxcl8a+/+(n=5)和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)，cxcl8a-/-(n=6)心室損傷組織中的百分比。H, 90 dpci時cxcl8a+/+ (H')和cxcl8a-/-(H'')心室切片的AFOG染色。橙色、肌肉;紅、纖維蛋白;藍(lán)色是膠原蛋白。I, 90 dpci時cxcl8a+/+ (n=4)和cxcl8a-/-(n=4)心室疤痕面積相對于心室面積的百分比。黑色(B和H)、白色(D)和橙色(F)虛線描繪了受損組織。統(tǒng)計檢驗:非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(A、C、G)， Student’s t檢驗(E、I)。比例尺:200μm (B、F、H)， 100μm (D)。RT-qPCR數(shù)據(jù)的Ct值列于表S3。
Cxcl8a-Cxcr1信號通路促進(jìn)冠狀動脈血運(yùn)重建
鑒于損傷誘導(dǎo)的cxcl8a表達(dá)上調(diào)，我們想測試cxcl8a是否在心臟再生過程中發(fā)揮重要作用，因此使用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了cxcl8a突變體(圖S8A和S8B)。計算機(jī)分析預(yù)測，由突變體轉(zhuǎn)錄物編碼的蛋白質(zhì)缺乏C-末端31個氨基酸，這是Cxcl8a二聚化和受體結(jié)合所必需的。我們分析了96 hpci時Tg(- 0.8flt1:RFP)；cxcl8a+/+和Tg(- 0.8flt1:RFP)；cxcl8a-/-斑馬魚的cEC增殖，發(fā)現(xiàn)突變體顯著減少(圖5D和5E)。此外，在7 dpci時，cxcl8a-/-心室顯示冠狀動脈覆蓋范圍明顯減少(圖5F和5G)，同時缺乏淋巴管(圖S8C)。此外，在dpci 30(圖S8D和S8E)和90(圖5H和5I)時，cxcl8a-/-心室顯示稍大的疤痕。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在斑馬魚心臟再生過程中，Cxcl8a在冠狀動脈血管重建中起著重要作用。
鑒于cxcl8a突變體cEC增殖表型降低，我們推斷其受體可能在心臟再生過程中在cECs中表達(dá)。事實上，我們通過原位雜交檢測了96 hpci時損傷組織周圍的cxcr1表達(dá)(圖6A)。我們還觀察到96 hpci時，cxcr1在分類cECs中的表達(dá)顯著上調(diào)，而未檢測到cxcr2的表達(dá)(圖6B)。重要的是，Cxcr1的藥理學(xué)抑制(SB225002)降低了7 dpci時冠狀血管的覆蓋率(圖S8F和S8G)。此外，為了研究cxcr1在心臟再生中的作用，我們對cxcr1-/-心室進(jìn)行了冷凍損傷，觀察到96 hpci時cEC增殖顯著減少(圖6C和6D)，以及7 dpci時冠狀動脈覆蓋缺陷(圖6E和6F)。接下來，我們檢查cxcr1-/-心室是否能夠再生。盡管它們在30 dpci時顯示出與cxcr1+/+對照組相似的疤痕大小(圖S8H和S8I)，但cxcr1-/-心室在90 dpci時顯示出明顯更大的疤痕(圖6G和6H)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，Cxcl8a通過Cxcr1信號在斑馬魚再生的cECs中促進(jìn)血管重建并支持心臟再生。
討論
心臟損傷后，斑馬魚的心臟會產(chǎn)生快速的血管生成反應(yīng)，這對再生過程至關(guān)重要。在這里，我們發(fā)現(xiàn)再生的冠狀動脈內(nèi)皮上調(diào)了心臟損傷后冠狀動脈血運(yùn)重建所需的vegfc，而與心室淋巴的存在與否無關(guān)。我們進(jìn)一步表明，通過阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)減少冠狀動脈血運(yùn)重建會損害心臟再生的關(guān)鍵方面，包括心肌細(xì)胞去分化和增殖，以及疤痕消退。從機(jī)制上看，在斑馬魚的心臟再生過程中，血管內(nèi)皮生長因子(Vegfc)信號通路誘導(dǎo)emilin2a和cxcl8a的表達(dá)，主要在EPDCs中，從而促進(jìn)冠狀動脈血運(yùn)重建。
導(dǎo)致成年哺乳動物心臟不能再生的因素之一是心臟再血管重建能力差。相比之下，具有心臟再生能力的模型，如斑馬魚，對心臟損傷表現(xiàn)出強(qiáng)大而快速的血管生成反應(yīng)，支持心臟再生。支持這一觀點(diǎn)的是，在斑馬魚心臟再生過程中擾亂冠脈血運(yùn)重建會損害心肌細(xì)胞增殖并阻止疤痕的消除。且在成年小鼠心肌梗死后誘導(dǎo)側(cè)支動脈形成可顯著改善心功能。同樣，在心臟損傷后穩(wěn)定非再生medaka心臟的血管樣結(jié)構(gòu)可以減少疤痕。因此，改善非再生心臟的血運(yùn)重建應(yīng)刺激其再生反應(yīng)，并且更好地了解再生斑馬魚心臟血運(yùn)重建的機(jī)制可能有助于確定新的治療途徑。
我們的數(shù)據(jù)顯示，阻斷Vegfc信號導(dǎo)致冠狀動脈血運(yùn)重建減少，心肌細(xì)胞增殖減少，并保留更大的疤痕。在心臟再生和發(fā)育過程中，冠狀動脈為心肌細(xì)胞提供支架。因此，我們假設(shè)在阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)時觀察到的心肌細(xì)胞去分化和增殖表型的減少是血運(yùn)重建減少的結(jié)果，然而，需要組織特異性功能喪失和功能獲得的方法來驗證這一假設(shè)。我們的數(shù)據(jù)表明，Vegfc是cECs分泌的促進(jìn)心臟再生的重要血管分泌因子。近年來的研究強(qiáng)調(diào)不同器官的內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌血管分泌因子在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。例如，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分別通過CXCR7和CXCR4受體的優(yōu)先激活來調(diào)節(jié)肝臟再生和纖維化之間的平衡。同樣，肺切除術(shù)后，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管分泌因子，如MMP14(基質(zhì)金屬蛋白酶14)，促進(jìn)肺泡上皮再生。重要的是，研究表明，EC衍生的VEGFC刺激神經(jīng)干細(xì)胞在發(fā)育和再生過程中的增殖。同樣，我們的研究說明了Vegfc在斑馬魚心臟再生中的血管分泌作用，以促進(jìn)cECs和隨后的心肌細(xì)胞的增殖。我們進(jìn)一步通過刺激ECM基因emilin2a的表達(dá)來描述血管內(nèi)皮生長因子信號通路在心臟再生中所必需的機(jī)制。在斑馬魚發(fā)育過程中，Vegfc通過自分泌和旁分泌兩種方式，通過Vegfr3誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)靜脈和淋巴萌發(fā)。同樣，我們的數(shù)據(jù)顯示，在心臟再生過程中，cECs和epdc表達(dá)emilin2a，表明Vegfc以自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)emilin2a表達(dá)。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，整體過表達(dá)emilin2a刺激冠狀動脈血運(yùn)重建并減少心臟損傷后的瘢痕。先前的研究表明，在非再生生物(如medaka15和成年小鼠)的心臟損傷后，emilin2a的表達(dá)不會被誘導(dǎo)。這些觀察結(jié)果，以及我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了emilin2a在促進(jìn)斑馬魚心臟再生中的重要性，表明emilin2a增強(qiáng)了再生過程。此外，我們發(fā)現(xiàn)Vegfc信號對emilin2a表達(dá)的調(diào)節(jié)也存在于人類內(nèi)皮細(xì)胞中，這鼓勵了未來對Vegfc和EMILIN2在促進(jìn)心肌梗死患者側(cè)支形成中的作用的研究。
我們的數(shù)據(jù)揭示了ECM分子Emilin2a的改變?nèi)绾斡绊懓唏R魚冠狀動脈血運(yùn)重建和心臟再生。事實上，最近的研究強(qiáng)調(diào)了ECM在調(diào)節(jié)包括血管生成在內(nèi)的心臟再生所需的不同過程中的作用。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)幾個ECM基因在阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)時下調(diào)(表S4)，包括纖維連接蛋白1b (fn1b)，該基因先前與血管生成和斑馬魚心臟再生有關(guān)。我們推測Vegfc信號改變了幾個ECM基因的表達(dá)，從而創(chuàng)造了一個促進(jìn)心臟損傷后冠狀動脈血運(yùn)重建的微環(huán)境。需要進(jìn)一步的研究來探索各種ECM蛋白促進(jìn)心臟再生的潛力。
為了更好地了解Emilin2a如何發(fā)揮其作為促再生因子的作用，我們確定了促炎趨化因子Cxcl8a作為潛在靶點(diǎn)。這些結(jié)果與EMILIN2誘導(dǎo)CXCL8表達(dá)促進(jìn)HUVECs遷移的數(shù)據(jù)一致。我們的數(shù)據(jù)顯示，cxcl8a在受損組織的EPDCs中表達(dá)，而cxcr1在再生的cECs中表達(dá)，這表明這兩種細(xì)胞類型之間存在相互作用，以調(diào)節(jié)冠狀動脈血供重建。最近的研究表明，EPDCs是調(diào)節(jié)斑馬魚和小鼠冠狀動脈再生的重要信號來源。CXCL8已被證明在不同情況下通過激活G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1/2作為促血管生成因子。我們的數(shù)據(jù)顯示cxcl8a和cxcr1突變體的cEC增殖減少，這表明在心臟再生的背景下，cxcl8a通過激活cEC表達(dá)的cxcr1介導(dǎo)其血管生成作用。因此，先前的報道暗示CXCR1通過不同的信號通路，包括Rho、Rac和MAPK激活，促進(jìn)了培養(yǎng)中的HUVECs和雞胚胎中的ECs的增殖。最近的研究表明，EPDCs是調(diào)節(jié)斑馬魚和小鼠冠狀動脈再生的重要信號來源。
總之，我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了Vegfc信號在促進(jìn)斑馬魚心臟再生中的重要性。我們認(rèn)為Vegfc信號可以誘導(dǎo)ECM成分Emilin2a和趨化因子Cxcl8a以及其他因子的表達(dá)，從而提供促進(jìn)心臟再生的環(huán)境。我們的研究結(jié)果，以及顯示VEGFC信號在促進(jìn)哺乳動物冠狀動脈發(fā)育中的重要性的數(shù)據(jù)，為研究VEGFC-emilin2-cxcl8信號軸在哺乳動物心肌梗死后促進(jìn)側(cè)支形成，從而改善心功能的潛力奠定了堅實的基礎(chǔ)。
原文：El-Sammak H, Yang B, Guenther S, Chen W, Marín-Juez R, Stainier DYR. A Vegfc-Emilin2a-Cxcl8a Signaling Axis Required for Zebrafish Cardiac Regeneration. Circ Res. 2022 Apr;130(7):1014-1029. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.319929. Epub 2022 Mar 10. PMID: 35264012; PMCID: PMC8976759.
原文地址：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.121.319929
注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。
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