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0512-8957 3668 / 18013764755

文獻(xiàn)解析 | 噻氯匹定通過上調(diào)氧化應(yīng)激信號(hào)通路誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性和肝毒性

來源:https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.115283 | 作者:木芮生物 | 發(fā)布時(shí)間: 2023-09-09 | 883 次瀏覽 | 分享到:

噻氯匹定主要通過拮抗血小板p2y12受體發(fā)揮抗血小板作用。既往有研究表明噻氯匹定可引起肝損傷，但其肝毒性的確切機(jī)制尚不清楚。氧化應(yīng)激、代謝紊亂、肝細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)等均可導(dǎo)致肝臟損傷，從而引起肝毒性。

雜志：Ecotoxicology and Environmental Safety

影響因子：6.8（2022-2023）

年份：2023

通訊作者：Huiqiang Lu1，Yijian Chen2

通訊作者單位：1Ganzhou Key Laboratory for Drug Screening and Discovery, School of Geography and Environmental Engineering, Gannan Normal University, Ganzhou 341000 Jiangxi, PR China

2Department of Osteology and Biomechanics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Lottestr. 55A, 22529 Hamburg, Germany.The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China; The Endemic Disease (Thalassemia) Clinical Research Center of Jiangxi Province, Ganzhou 341000, China

摘要

為了深入探討噻氯匹定肝毒性的潛在分子機(jī)制，本研究以斑馬魚為模式生物，綜合評(píng)價(jià)噻氯匹定的肝毒性及其相關(guān)機(jī)制。受精后3天，斑馬魚幼體暴露于不同濃度(1.5、1.75和2 μg/mL)的噻氯匹定72小時(shí)，而成年斑馬魚暴露于4 μg/mL的噻氯匹定28天。噻氯匹定暴露后，斑馬魚幼魚肝臟形態(tài)發(fā)生改變，體長(zhǎng)縮短，魚鰾發(fā)育延遲。噻氯匹定暴露的斑馬魚幼魚和成魚的肝組織經(jīng)蘇木精-伊紅染色顯示肝組織內(nèi)空泡化和細(xì)胞間間隙增加。此外，通過油紅O和過碘酸-希夫染色法以及噻氯匹定染毒斑馬魚幼魚和成魚的不同代謝酶檢測(cè)，提示噻氯匹定染毒斑馬魚幼魚和成魚均存在肝臟代謝異常和肝損傷。噻氯匹定還顯著升高炎癥和氧化應(yīng)激，并降低肝細(xì)胞增殖。在使用n -乙酰半胱氨酸進(jìn)行搶救干預(yù)時(shí)，我們觀察到噻氯匹定引起的肝臟形態(tài)學(xué)改變明顯改善，體長(zhǎng)縮短，魚鰾發(fā)育延遲，肝組織增殖明顯改善。

綜上所述，噻氯匹定可能通過上調(diào)氧化應(yīng)激水平抑制斑馬魚的正常發(fā)育和肝臟增殖，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育毒性和肝臟毒性。本研究以斑馬魚為模式生物，闡明噻氯匹定上調(diào)氧化應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)斑馬魚的發(fā)育毒性和肝毒性，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:肝毒性，噻氯匹定，氧化應(yīng)激，斑馬魚，N-乙酰半胱氨酸。

介紹

糖尿病是一種以血糖升高為特征的慢性代謝性疾病，是全球范圍內(nèi)快速增長(zhǎng)的疾病，預(yù)計(jì)到2045年糖尿病患者數(shù)量將達(dá)到6.93億。與糖尿病相關(guān)的大血管(如心、腦血管和下肢血管疾病)和微血管并發(fā)癥(如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變和神經(jīng)病變)并發(fā)癥可導(dǎo)致嚴(yán)重后果，如截肢、半癱、失明和尿毒癥，給醫(yī)療機(jī)構(gòu)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。研究表明，高血糖可導(dǎo)致血小板活化和聚集，誘導(dǎo)炎癥和活性氧(ROS)產(chǎn)生，導(dǎo)致血栓性疾病的發(fā)生。因此，控制血糖等相關(guān)指標(biāo)以早期預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)癥非常重要。

噻氯匹定是一種在臨床上用于預(yù)防血栓性疾病的酸性噻吩吡啶衍生物,有效抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，并作為P2Y12受體拮抗劑發(fā)揮作用。在糖尿病患者中，使用噻氯匹定可有效預(yù)防血栓性并發(fā)癥，但已發(fā)現(xiàn)噻氯匹定在預(yù)防血栓性疾病時(shí)具有許多并發(fā)癥副作用，例如噻氯匹定對(duì)人骨髓祖細(xì)胞的毒性作用呈劑量依賴性。它對(duì)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞也有毒性，對(duì)粒細(xì)胞的毒性更嚴(yán)重，其易感性是由于形成髓過氧化物酶的代謝物。此外，已知噻氯匹定會(huì)引起隱桿菌的形態(tài)變化，急性暴露可能導(dǎo)致藥物積累和致死。最近的研究發(fā)現(xiàn)，噻氯匹定對(duì)非洲爪蟾胚胎和人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有致畸作用。重要的是，噻氯匹定也顯示出明顯的肝毒性，并且有臨床報(bào)告稱使用噻氯匹定后患者出現(xiàn)肝損傷。然而，肝毒性的具體分子機(jī)制尚不清楚。

氧化應(yīng)激通常被描述為生物體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的破壞，通常由ROS積累引起。ROS是由分子氧衍生而來的活性分子，主要包括超氧陰離子和過氧化氫。作為抗氧化系統(tǒng)的一部分，ROS在基礎(chǔ)水平上直接參與細(xì)胞增殖和分化，對(duì)人體的正常發(fā)育至關(guān)重要，不僅參與人體細(xì)胞的正常增殖，還在多種人類疾病的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，如腫瘤和炎癥。然而，ROS的過度積累會(huì)通過影響生物大分子(如蛋白質(zhì)、RNA和DNA)和相應(yīng)組織器官的功能，對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷。肝臟是人體物質(zhì)和能量代謝的主要器官。它加工、分配和代謝脂類、蛋白質(zhì)、葡萄糖和其他重要營(yíng)養(yǎng)素。此外，肝臟在維持機(jī)體免疫和內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著巨大的作用。近年來的研究表明，許多肝臟疾病(如脂肪肝、肝炎和肝硬化)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，促進(jìn)疾病的發(fā)展。藥物或酒精可導(dǎo)致ROS在肝內(nèi)持續(xù)累積，從而引起氧化應(yīng)激。ROS的積累會(huì)嚴(yán)重影響肝臟的脂質(zhì)代謝，引發(fā)肝臟脂毒性。ROS蓄積還可激活肝臟核因子-κB (NF-κB)信號(hào)通路。這種激活反過來會(huì)促進(jìn)肝臟炎癥。由于ROS主要在線粒體中產(chǎn)生，ROS的積累會(huì)影響線粒體，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷?？傊?氧化應(yīng)激在肝損傷過程中起著重要的作用。

近年來，斑馬魚被廣泛用作模式生物。出生5天的斑馬魚幼魚發(fā)育了包括肝臟在內(nèi)的所有消化器官。因此，斑馬魚已成為研究肝臟疾病的一種有影響力的動(dòng)物模型。斑馬魚的其他重要特征有助于研究，包括與人類有87%的遺傳同源性，高生育率和易于獲得，以及透明的胚胎和幼蟲，可以通過實(shí)時(shí)成像實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察肝臟。斑馬魚的肝臟在細(xì)胞組成、轉(zhuǎn)錄譜和功能方面與哺乳動(dòng)物的肝臟非常相似。

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)噻氯匹定顯著上調(diào)斑馬魚的氧化應(yīng)激水平。因此，我們提出噻氯匹定可能通過上調(diào)氧化應(yīng)激信號(hào)通路誘導(dǎo)斑馬魚的發(fā)育毒性和肝毒性的假說。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將受精后72小時(shí)(hpf)的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度(0、1.5、1.75和2μg/mL)的噻氯匹定。我們?cè)u(píng)估了以下幾個(gè)因素:(1)發(fā)展和死亡率；(2)肝臟形態(tài)；(3)肝組織形態(tài)學(xué)改變及相關(guān)代謝指標(biāo)；(4)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)；(5)肝毒性和發(fā)育遲緩。本研究旨在闡明噻氯匹定肝毒性及發(fā)育遲緩的分子機(jī)制，為其今后的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

藥物和試劑

噻氯匹定購(gòu)自中國(guó)上海先鼎生物技術(shù)有限公司(分析標(biāo)準(zhǔn)品，CAS號(hào);53885-35-1) 。用二甲亞砜(DMSO)配制0.8 mg/mL的原液，?20℃保存。過碘酸希夫(PAS)染色、胞質(zhì)異檸檬酸脫氫酶(ICDHC)、葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、糖原分析試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司。分析工具對(duì)谷胱甘肽轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)氨酶(得到),過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和活性氧測(cè)定包被購(gòu)自南京建成生物工程研究所(中國(guó)南京)。RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和SYBR green購(gòu)自北京全風(fēng)格黃金有限公司(北京)。蘇木精-伊紅(HE)試劑、油紅O檢測(cè)試劑盒等均購(gòu)自上海三根生物技術(shù)有限公司。

斑馬魚品系和培養(yǎng)

斑馬魚成年野生型(AB)、轉(zhuǎn)基因Tg (mfap4: GFP)(標(biāo)記巨噬細(xì)胞)和轉(zhuǎn)基因Tg (fabp10a: DsRed)(標(biāo)記肝細(xì)胞)由國(guó)家斑馬魚資源中心(CZRC)提供，并根據(jù)CZRC方案在特定的pH和電導(dǎo)率下維持。

藥物暴露

為了驗(yàn)證噻氯匹定對(duì)發(fā)育中的斑馬魚幼魚和成年魚是否具有肝毒性，我們將斑馬魚幼魚和成年魚分別暴露于噻氯匹定。使用DMSO稀釋原液。將發(fā)育良好的72 hpf斑馬魚胚胎(每孔20只)置于6孔板中，暴露于濃度為0 ~ 8 μ g/mL的噻氯匹定，測(cè)定24、48、72 h斑馬魚胚胎死亡率。從初始實(shí)驗(yàn)開始，觀察斑馬魚的死亡率和肝臟表型。根據(jù)結(jié)果,我們決定暴露濃度的ticlopidine幼魚是0,1.5,1.75和2μg / mL, ticlopidine成年魚4μg / mL。隨后，72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于噻氯匹定溶液(0、1.5、1.75和2 μg/mL) 72 h(每24h更換1次)。成年魚暴露于4 μg/mL的噻氯匹定溶液1個(gè)月，每24h更換1次。

熒光顯微鏡

將Tg (fabp10a: DsRed)斑馬魚幼魚暴露于氯匹定溶液(0、1.5、1.75和2 μg/mL)中，72 h后用三卡因麻醉。將幼魚用1%低熔點(diǎn)瓊脂糖固定在培養(yǎng)皿中，使用熒光體視顯微鏡(Leica M205FA體視顯微鏡，德國(guó))獲取斑馬魚全身和肝臟的熒光圖像以及局部白光圖像。通過Image j計(jì)算斑馬魚胚胎的肝面積和體長(zhǎng)來評(píng)估噻氯匹定對(duì)斑馬魚肝臟的影響。此外，將Tg (fabp10a: DsRed)和Tg (mfap4: GFP)雜交斑馬魚胚胎分別用噻氯匹定溶液(0、1.5、1.75、2 μg/mL)處理3 d，通過TCS SP8共聚焦顯微鏡(Leica，德國(guó))獲取圖像，檢測(cè)肝臟區(qū)域的巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)。

HE和PAS染色

將72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度的噻氯匹定(0、1.5、1.75和2 μg/mL) 72 h后，分別收集在分離的離心管中，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次(每次洗滌5 min)，在室溫和黑暗中固定在布因固定液中過夜。使用Leica石蠟切片機(jī)對(duì)包埋的蠟塊進(jìn)行切片，并對(duì)切片進(jìn)行染色(HE和PAS染色)和密封(使用中性樹脂和蓋玻片)。這些切片最終使用徠卡DM2500顯微鏡成像。

油紅O染色

將72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度(0、1.5、1.75和2 μg/mL)的噻氯匹定72 h后，收集到不同的離心管中。然后使用4%多聚甲醛(4% PFA)在4℃固定過夜，隨后進(jìn)行三次洗滌，每次使用PBS持續(xù)5分鐘。然后用60%異丙醇孵育30 min，用60%異丙醇配制的3 mg/mL油紅O溶液染色2.5 h，用60%異丙醇洗滌去除多余的染色液，用PBS沖洗。最后使用徠卡熒光體視顯微鏡進(jìn)行圖像采集。成年斑馬魚暴露于不同濃度的噻氯匹定30天，隨后用4% PFA固定過夜。去除4% PFA后，將肝組織包埋于OCT包埋劑中，并切成10 mm厚切片(德國(guó)徠卡CM3050S)。切片用60%異丙醇孵育10 s，油紅O染色15 min，洗去多余染色液后，蘇木精染色細(xì)胞核，甘油明膠和蓋玻片封片。使用徠卡DM2500顯微鏡采集圖像。

氧化應(yīng)激與酶活性

為了觀察氧化應(yīng)激，在不同條件下處理后，收集斑馬魚樣本，用PBS洗滌3次5 min，在28.5℃(斑馬魚的最適生存溫度)與2 '，7 ' -二氯二氫熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA;5μM),洗了三次PBS和使用激光共焦顯微鏡成像。不同的酶(GPT、GOT、ICDHC、G6PDH、CAT和SOD)以及TG和TC水平根據(jù)各自試劑盒中列出的制造商說明進(jìn)行測(cè)定。

抗體染色試驗(yàn)

將72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度的噻氯匹定(0、1.5、1.75和2 μg/mL) 72 h后，收集在分離的離心管中，使用4% PFA在黑暗中固定過夜。剝?nèi)グ唏R魚幼魚肝部位表面皮膚，用抗pcna抗體(1:500;生命技術(shù)，Abcam，英國(guó))。最后,圖像獲得使用TCS SP8共焦顯微鏡(德國(guó)徠卡)。

基因表達(dá)分析

使用TransZol Up (TransGen)從不同濃度(0、1.5、1.75和2 μg/mL)的噻氯匹定孵育72 h后的斑馬魚幼魚(72 hpf)中提取總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。采用SYBR Green試劑盒(Takara，中國(guó)大連)進(jìn)行qPCR，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。采用QTOWER3G系統(tǒng)(Analytik Jena，德國(guó))評(píng)估炎癥和細(xì)胞增殖相關(guān)基因水平。補(bǔ)充表1顯示了本研究中使用的引物序列。

救援實(shí)驗(yàn)

將72 hpf的斑馬魚幼魚分別置于6孔板(每孔20條)中，分別設(shè)置3組條件:(1)0.003% 1-苯基2-硫脲(對(duì)照組)、(2)1.75 μg/mL噻氯匹定(實(shí)驗(yàn)組)和(3)1.75 μg/mL噻氯匹定+ 1.5 mM n -乙酰半胱氨酸(NAC)(挽救組)。所有三組接受治療72 h緊隨其后的是微觀分析如上所述。

統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比較了使用學(xué)生的學(xué)習(xí)任務(wù)或單向方差分析。不同實(shí)驗(yàn)(包括治療組和對(duì)照組的比較)的實(shí)驗(yàn)值和相關(guān)誤差以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p值≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果

噻氯匹定可引起肝毒性并阻礙斑馬魚幼魚的發(fā)育

將斑馬魚幼魚暴露于噻氯匹定后，我們觀察到較高水平的胚胎死亡率，這種死亡率以劑量依賴性方式發(fā)生(圖1A)。此外，隨著噻氯匹定濃度的增加，斑馬魚幼魚的體長(zhǎng)逐漸縮短(圖1C)。雖然肝臟面積沒有變化(圖1D)，但隨著噻氯匹定濃度的增加，肝臟的形態(tài)學(xué)變化更加明顯。在濃度為2 μg/mL時(shí)，魚鰾逐漸變小甚至消失(圖1B)。

圖1 暴露于噻氯匹定的斑馬魚的胚胎和肝臟表型。(A)在指定時(shí)間點(diǎn)暴露于指定濃度噻氯匹定的胚胎死亡率統(tǒng)計(jì)。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的白光和熒光圖像。黃色箭頭表示魚鰾，紅色箭頭表示卵黃囊。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后，在白光下的體長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)。(D)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后，肝臟的熒光面積統(tǒng)計(jì)(值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)***P < 0.05,P < 0.01,***P < 0.001,ns,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

噻氯匹定對(duì)斑馬魚幼魚肝臟病理變化及代謝的影響

對(duì)照幼蟲肝組織切片染色可見正常肝組織形態(tài)，細(xì)胞完整、飽滿，細(xì)胞核呈球形，細(xì)胞間接觸緊密。相比之下，暴露于噻氯匹定的幼蟲表現(xiàn)出肝細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為變形、細(xì)胞間接觸疏松和實(shí)質(zhì)性空泡形成(圖2A)。用PAS和油紅O染色法檢測(cè)對(duì)照組和染毒組斑馬魚幼魚的糖原和脂質(zhì)含量時(shí)，對(duì)照組肝臟PAS染色較深，表明糖原含量較高且分布較均勻。相比之下，噻氯匹定暴露組的肝臟PAS染色較淺，表明糖原含量顯著減少(圖2B)。此外，與對(duì)照組相比，噻氯匹定暴露組的肝臟油紅O染色顏色顯著增加，顯示出噻氯匹定劑量依賴性的肝臟脂質(zhì)含量增加(圖2C)。

圖2 噻氯匹定誘導(dǎo)斑馬魚幼魚肝臟組織學(xué)改變及代謝異常。(A)暴露于指定濃度噻氯匹定72h后肝臟he染色圖像:黃色矩形框表示放大區(qū)域，紅色和黃色箭頭分別表示細(xì)胞間隙和異常細(xì)胞腔。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的肝臟PAS染色:黃色矩形框表示放大區(qū)域。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的肝臟油紅O染色圖像:黃色虛線框代表斑馬魚幼魚的肝臟。

噻氯匹定對(duì)成年斑馬魚肝臟病理變化及代謝的影響

對(duì)照組成年斑馬魚HE染色顯示肝組織形態(tài)正常，細(xì)胞間接觸緊密，細(xì)胞完整飽滿。相比之下，噻氯匹定(4 μg/mL)暴露的成年斑馬魚肝組織形態(tài)受損，肝細(xì)胞不規(guī)則變形，有大量無(wú)核細(xì)胞，細(xì)胞間接觸疏松，大量空泡形成(圖3A)。與斑馬魚幼魚的結(jié)果相似，對(duì)暴露于4 μg/mL噻氯匹定的成年斑馬魚肝臟進(jìn)行PAS染色，與對(duì)照組相比，觀察到明顯較輕的染色，提示糖原含量顯著降低(圖3B)。此外，與對(duì)照組相比，噻氯匹定暴露的成年斑馬魚肝臟的油紅O染色明顯較深，表明噻氯匹定組肝臟的脂質(zhì)含量較對(duì)照組顯著增加(圖3C)。噻氯匹定染毒組GPT、GOT、G6PDH、ICDHC活性及TG、TC含量均顯著高于對(duì)照組(圖3D-F)。結(jié)果表明，噻氯匹定暴露對(duì)成年斑馬魚有肝毒性，嚴(yán)重影響其肝臟代謝。

圖3 噻氯匹定致成年斑馬魚肝臟組織學(xué)改變及代謝異常。(A)暴露于指定濃度噻氯匹定30天后的肝臟HE染色圖像:黃色矩形框表示放大區(qū)域，紅色箭頭表示有核細(xì)胞。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后的肝臟PAS染色圖像:黃色矩形框表示放大區(qū)域，藍(lán)色箭頭表示糖原蓄積的位置。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后的肝臟油紅O染色圖像:黃色虛線框表示放大區(qū)域。(D)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后，肝臟GPT和GOT的活性。(E)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后的肝臟G6PDH和ICDHC。(F)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后，肝臟中的TC和TG水平(值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)* p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)。

噻氯匹定誘導(dǎo)斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激上調(diào)

為了研究噻氯匹定對(duì)斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激和炎癥的影響，我們進(jìn)行了ROS染色和巨噬細(xì)胞熒光拍攝，測(cè)定了CAT和SOD活性，并定量了TNF-α和TGF-β基因表達(dá)。與對(duì)照組相比，在噻氯匹定暴露組的肝臟部位觀察到顯著較高的綠色熒光強(qiáng)度(代表ROS積累)(圖4A)。噻氯匹定暴露還降低了CAT和SOD的活性(圖4B-C)，表明暴露于噻氯匹定的幼蟲的抗氧化能力顯著降低。為了觀察噻氯匹定對(duì)巨噬細(xì)胞分布的影響，我們使用Tg (fabp10a: DsRed)和Tg (mfap4: GFP)雜交產(chǎn)生的斑馬魚幼魚，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(圖 1a)相比，噻氯匹定暴露的斑馬魚幼魚的巨噬細(xì)胞分布顯著增加，且呈劑量依賴性。我們還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，噻氯匹定暴露組的炎癥基因(TNF-α)和抗炎基因(TGF-β)的表達(dá)顯著上調(diào)(圖 1b)和下調(diào)(圖 1C)。因此，噻氯匹定引起的肝毒性可能與氧化應(yīng)激上調(diào)和炎癥水平升高有關(guān)。

圖4 噻氯匹定誘導(dǎo)斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激上調(diào)。(A)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后，獲得ROS染色激光共聚焦圖像。紅色和綠色熒光分別代表斑馬魚幼魚的肝臟和ROS的積累。黃色虛線框表示局部擴(kuò)大區(qū)域。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的CAT活性。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的SOD活性(值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)。

噻氯匹定抑制斑馬魚增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞增殖

為探討噻氯匹定對(duì)斑馬魚幼魚肝臟增殖的影響，我們進(jìn)行了PCNA抗體染色。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，噻氯匹定暴露組的肝細(xì)胞增殖顯著降低(圖5A)。我們還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，噻氯匹定暴露組中增殖相關(guān)基因(ccne1, ccdn1, cdk2和cdk6)的表達(dá)下調(diào)(圖5B-E)。結(jié)果表明，噻氯匹定可能通過抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)而抑制肝細(xì)胞增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)肝毒性。

圖5 噻氯匹定抑制斑馬魚幼魚肝細(xì)胞增殖。(A)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的PCNA染色圖像。紅色、綠色和藍(lán)色熒光分別表示肝臟、增殖細(xì)胞和細(xì)胞核。黃色虛線圈代表肝臟。(B-E)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的增殖相關(guān)基因表達(dá)水平(值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001,ns，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

NAC顯著改善噻氯匹定對(duì)斑馬魚幼魚肝細(xì)胞增殖的抑制和肝毒性

同時(shí)用噻氯匹定和NAC孵育斑馬魚幼魚后，我們觀察到幾個(gè)顯著的變化:(1)與噻氯匹定暴露組相比，綠色熒光強(qiáng)度顯著降低，表明ROS在肝臟中積累(圖6A);(2)肝臟形態(tài)學(xué)和魚鰾大小明顯恢復(fù)(圖6b);(3)體長(zhǎng)恢復(fù)正常(圖6C);(4) CAT和SOD活性顯著回升(圖6D-E)。此外，與單用噻氯匹定組相比，NAC挽救組肝細(xì)胞增殖顯著增加，增殖相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)(圖7A-C)。這些結(jié)果表明，NAC可顯著改善噻氯匹定誘導(dǎo)的肝毒性，其機(jī)制可能與上調(diào)氧化應(yīng)激有關(guān)。

圖6 NAC挽救噻氯匹定誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚肝毒性。(A)對(duì)照組、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚的ROS染色圖像。黃色虛線框表示放大區(qū)域。綠色熒光代表ROS的積累。(B)對(duì)照組、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚肝臟的白光和代表性熒光圖像。紅色虛線框表示放大區(qū)域，黃色箭頭表示魚鰾，紅色箭頭表示卵黃囊。(C)對(duì)照組、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚體長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)。(D-E)對(duì)照組、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚CAT和SOD酶活性。NAC、n -乙酰半胱氨酸、TIC、噻氯匹定(值代表均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)。

圖7 NAC挽救噻氯匹定誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚肝臟增殖的減少。(A)對(duì)照組、噻氯匹定組和挽救組的PCNA抗體染色圖像，紅色熒光代表肝臟，顆粒綠色熒光代表增殖細(xì)胞。(B-C)對(duì)照組、噻氯匹定組和挽救組中增殖相關(guān)基因(ccne1和cdk2)的表達(dá)水平。NAC、n -乙酰半胱氨酸、TIC、噻氯匹定(值代表均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)。

討論

糖尿病是一種以高血糖為常見特征的慢性代謝性疾病。高血糖常常與許多其他并發(fā)癥同時(shí)發(fā)生，導(dǎo)致重大的醫(yī)療挑戰(zhàn)。高血糖可通過上調(diào)氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、炎癥和血小板活化引起高凝狀態(tài)。因此，抗血小板聚集是預(yù)防缺血事件發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要工具。噻氯匹定通過抑制血小板p2y12受體抑制血小板聚集。臨床上常用于預(yù)防和治療糖尿病血管并發(fā)癥，如腦梗死和冠狀動(dòng)脈疾病，還可降低血液黏度。雖然噻氯匹定與肝毒性之間的相關(guān)性已被明確，但確切的分子機(jī)制仍不清楚。在本研究中，我們以斑馬魚為模式生物，證明噻氯匹定暴露以劑量依賴的方式引起斑馬魚的發(fā)育遲緩和肝毒性。體長(zhǎng)變短、卵黃囊攝取減慢、魚鰾變小甚至沒有魚鰾、肝臟形態(tài)發(fā)生顯著變化以及死亡率增加等證據(jù)支持這一觀察結(jié)果。

近年來，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是一種廣泛存在的細(xì)胞過程，與許多疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。氧化應(yīng)激的典型特征是源自各種內(nèi)部和外部損傷源的ROS和活性氮物種(RNS)的積累。我們的研究發(fā)現(xiàn)，噻氯匹定藥物暴露組斑馬魚肝臟部位ROS水平呈濃度依賴性顯著上調(diào)，結(jié)果表明噻氯匹定可以上調(diào)斑馬魚肝臟部位氧化應(yīng)激水平，而氧化應(yīng)激水平是人體衰老和疾病的重要調(diào)節(jié)劑，通過多種生化過程損害脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)。氧化應(yīng)激可破壞肝細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GPT和GOT的釋放，導(dǎo)致GPT和GOT水平升高。因此，GPT和GOT的升高反映了肝臟結(jié)構(gòu)完整性受損的程度。酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)噻氯匹定染毒后斑馬魚GOT和GPT顯著升高，HE染色結(jié)果提示噻氯匹定染毒后斑馬魚肝組織出現(xiàn)細(xì)胞間隙增寬和空泡化，熒光顯微鏡也顯示斑馬魚肝組織形態(tài)發(fā)生改變。結(jié)果表明，噻氯匹定可以誘導(dǎo)肝損傷，并且由于肝臟部位表現(xiàn)出顯著升高的氧化應(yīng)激水平，我們推測(cè)噻氯匹定通過上調(diào)氧化應(yīng)激通路誘導(dǎo)肝損傷。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)維持氧化還原平衡，在缺乏抗氧化能力的情況下，氧化還原平衡被擾亂，引起氧化應(yīng)激，并產(chǎn)生高水平的氧、羥基自由基和其他活性物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，ROS具有“雙側(cè)”作用;它在細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中充當(dāng)?shù)诙攀共⒕S持細(xì)胞表型，同時(shí)它也可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡。低水平的ROS促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，但氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡。此外,據(jù)報(bào)道,氧化應(yīng)激可以影響正常細(xì)胞增殖行為。

SOD和CAT作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，在清除肝臟代謝物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的大量ROS方面發(fā)揮著重要作用。我們還發(fā)現(xiàn)噻氯匹定暴露后SOD和CAT水平降低。噻氯匹定暴露還導(dǎo)致氧化失衡，抗氧化防御系統(tǒng)受損，大量ROS積累，炎癥水平上調(diào)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，減弱細(xì)胞的抗氧化能力，破壞肝細(xì)胞膜的完整性。ROS的過度積累會(huì)導(dǎo)致肝功能障礙和肝細(xì)胞凋亡。

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)噻氯匹定對(duì)斑馬魚肝功能的影響，我們檢測(cè)了TG和TC水平以及G6PDH和ICDHC酶的活性，結(jié)果表明噻氯匹定暴露后，斑馬魚的TC、TG以及G6PDH和ICDHC酶的活性顯著升高。G6PDH具有高度特異性，在磷酸戊糖途徑中NADPH的生成中發(fā)揮著非常重要的作用。ICDHC在肝臟中分布豐富，主要由肝臟釋放，可以反映肝壞死的程度。G6PDH和ICDHC是肝臟糖代謝的關(guān)鍵酶，油紅O染色和糖原染色也顯示噻氯匹定染毒后肝臟脂質(zhì)和糖原含量顯著異常。這些結(jié)果表明，噻氯匹定暴露后斑馬魚肝臟受到損傷，脂質(zhì)和糖代謝紊亂。此外，我們還觀察到噻氯匹定暴露后，斑馬魚幼魚的卵黃囊吸收顯著延遲，魚鰾發(fā)育延遲和體長(zhǎng)減少，表明噻氯匹定也會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚的發(fā)育毒性。

細(xì)胞周期是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)控的過程，具有顯著的復(fù)雜性。細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂是由細(xì)胞周期蛋白(CCN)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復(fù)合物確定的精確序列調(diào)控的；其中，ccne1、ccnd1、cdk2和cdk6參與細(xì)胞周期和復(fù)制。在本研究的qPCR分析中，ccne1, ccnd1, cdk2和cdk6在噻氯匹定暴露組中顯著下調(diào)，表明噻氯匹定可以影響斑馬魚幼魚的細(xì)胞增殖。我們還通過PCNA染色證明了這一點(diǎn)，在噻氯匹定暴露后，斑馬魚幼魚的肝細(xì)胞增殖顯著降低。

NAC是一種抗氧化劑，為體內(nèi)合成谷胱甘肽(GSH)提供必要的原料，GSH是體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，在正常的細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。許多研究表明，抗氧化應(yīng)激對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。眾所周知，谷胱甘肽是一種直接抗氧化劑和許多抗氧化酶的底物，當(dāng)對(duì)乙酰氨基酚毒性導(dǎo)致藥物解毒過程耗盡肝臟谷胱甘肽池時(shí)，NAC可以恢復(fù)谷胱甘肽池。NAC作為谷胱甘肽前體，對(duì)超氧化物和過氧化物的清除作用較小，只是一種間接抗氧化劑。然而，NAC含有親核游離巰基，可以對(duì)抗氧化自由基的許多親電子基團(tuán)，發(fā)揮直接抗氧化作用。此外，NAC還具有一定的抗炎特性，可以破壞呼吸道病原體形成的生物膜。在本研究中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證斑馬魚胚胎的肝毒性和發(fā)育毒性與氧化應(yīng)激的上調(diào)有關(guān)，我們用NAC處理斑馬魚幼魚，發(fā)現(xiàn)NAC降低了噻氯匹定誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平，表明NAC具有顯著的抗氧化作用，后來我們發(fā)現(xiàn)，NAC在一定程度上挽救了噻氯匹定暴露導(dǎo)致的發(fā)育延遲和肝毒性。它通過下調(diào)噻氯匹定誘導(dǎo)的CAT和SOD活性上調(diào)，上調(diào)cne1和cdk2的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。然后我們進(jìn)行了PCNA染色，發(fā)現(xiàn)NAC顯著恢復(fù)了噻氯匹定誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚肝細(xì)胞增殖的減少。因此，噻氯匹定誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩和肝毒性與氧化應(yīng)激的上調(diào)密切相關(guān)。

結(jié)論

噻氯匹定可誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育延遲和肝毒性，其機(jī)制可能與上調(diào)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致ROS蓄積，抑制肝細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究鼓勵(lì)進(jìn)一步了解噻氯匹定對(duì)人體的潛在危害，為其臨床安全使用提供充分的理論依據(jù)。

基金：這項(xiàng)研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金(81160073),江西省衛(wèi)生部門基金(202210870),教育部的科學(xué)和技術(shù)基礎(chǔ)的江西,中國(guó)(GJJ2201434),流行疾病的臨床醫(yī)學(xué)研究中心(地中海貧血)江西省(20223 bcg74003),國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFA0801000)，國(guó)家自然科學(xué)基金(32170853)，江西省自然科學(xué)基金(20212ACB205007)，江西省教育廳科技基金(GJJ201002)的支持。

原文：Xu R, Xu P, Wei H, et al. Ticlopidine induces embryonic development toxicity and hepatotoxicity in zebrafish by upregulating the oxidative stress signaling pathway[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2023, 262: 115283.

原文地址：https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.115283

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