雜志：Molecular pharmaceutics
影響因子：4.9（2022-2023）
年份：2022
通訊作者：Carol S. Lim, and Kimberley J. Evason
通訊作者單位：Kimberley J. Evason-Department of Pathology and Huntsman Cancer Institute, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112, United States;
Carol S. Lim-Department of Molecular Pharmaceutics, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112, United States.
摘要
肝細胞癌（hepatellular carcinoma，HCC）的治療方法很少，全球年死亡率超過80萬，迫切需要新的治療方法。盡管野生型p53基因療法已被證明在HCC患者中是安全的，但尚未顯示出足夠的療效。該研究旨在展示p53如何通過融合促凋亡BH3蛋白Bcl-2細胞死亡拮抗劑（Bad）來重新設(shè)計，以提高抗HCC活性，并可能產(chǎn)生一種新的HCC治療藥物p53-Bad*。p53-Bad*是p53和Bad的融合產(chǎn)物，有兩個突變，S112A和S136A。我們通過熒光顯微鏡檢測了不同p53突變狀態(tài)的肝癌細胞系中p53- bad*的線粒體定位。我們用流式細胞術(shù)測定了p53-Bad*在4種肝癌細胞系中的凋亡活性。為了確定p53-Bad*在體內(nèi)的作用，我們生成并分析了表達肝細胞特異性p53-Bad*的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。無論p53突變狀態(tài)如何，p53-bad*都定位于線粒體，并且在早期、中期和晚期的凋亡實驗中表現(xiàn)出優(yōu)于WT p53的凋亡活性。通過肝體質(zhì)量比和組織病理學(xué)檢測，p53-Bad*可減輕斑馬魚HCC的腫瘤負荷。通過TUNEL染色檢測，p53-Bad*在斑馬魚HCC中誘導(dǎo)了顯著的細胞凋亡，而在非HCC魚類中未誘導(dǎo)細胞凋亡。p53-bad*在斑馬魚體內(nèi)可誘導(dǎo)不同p53突變狀態(tài)的肝癌細胞系凋亡，誘導(dǎo)細胞凋亡/減輕HCC腫瘤負荷。p53-Bad*作為一種潛在的新型HCC治療藥物值得進一步研究。
關(guān)鍵詞：肝癌，腫瘤抑制因子p53, Bcl-2細胞死亡拮抗劑，線粒體凋亡，p53-bad*融合
前言
據(jù)估計，全球每年有80萬人死于肝癌，不斷上升的發(fā)病率（從1990年到2015年增加了75%）和高死亡率使肝細胞癌（HCC）成為最常見的肝癌類型，對全球健康構(gòu)成巨大威脅。多年來，唯一被批準(zhǔn)用于晚期HCC的系統(tǒng)性治療是索拉非尼（sorafenib），這是一種酪氨酸激酶抑制劑，可將患者的總生存期提高2.8個月，但會引起明顯的不良反應(yīng)。治療HCC迫切需要副作用更少的改進療法，特別是對于疾病晚期和/或肝功能低下的患者。
HCC腫瘤具有獨特的血管系統(tǒng)，75-80%的血液供應(yīng)來自肝動脈。正常肝組織只有25%的血供來自肝動脈，大部分來自門靜脈。這種二分法導(dǎo)致HCC特異性的自然機制，通常用于HCC治療，如經(jīng)動脈化療栓塞或Y90放射栓塞，可緩解癥狀，延長無進展生存期，并使患者在更長的時間內(nèi)保持移植資格。這種獨特的HCC動脈內(nèi)輸送的特異性對基因治療特別有利，因為基因治療需要靶向給藥才能成功。動脈內(nèi)注射和瘤內(nèi)注射均能有效地對肝癌進行基因治療，雖然Gendicine顯示出輕微毒性，并且成功地給藥至HCC，但野生型（WT）p53基因療法治療HCC的療效存在爭議，而且尚未開展進一步試驗，盡管幾種p53再激活劑（APR-246和COTI-2）目前正在多種癌癥類型中進行臨床試驗。
Gendicine p53基因療法已在中國對許多癌癥進行了試驗雖然在某些癌癥（如頭頸部）比其他癌癥（如卵巢癌）更成功，但WT p53基因治療尚未被確定為成功的抗癌基因治療方法。這種失敗通常歸因于癌細胞能夠通過p53通路的替代突變、核p53效應(yīng)的顯性負抑制以及過去幾代腺病毒載體的問題來克服WT p53的影響。
重新設(shè)計的p53融合結(jié)構(gòu)顯示出前景，將p53重定向到線粒體以增加凋亡潛能。WT p53主要定位于細胞核，在細胞核內(nèi)四聚結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)細胞代謝，控制糖酵解，誘導(dǎo)細胞周期阻滯、DNA修復(fù)、衰老、外源性凋亡和氧化磷酸化。WT p53也能定位線粒體——通常是微量的，凋亡細胞除外，在凋亡細胞中，單體p53刺激快速的內(nèi)在凋亡。線粒體p53失活抗凋亡因子，激活促凋亡因子Bak和Bax，導(dǎo)致細胞色素C釋放、凋亡體組裝、caspase級聯(lián)和細胞凋亡（圖1）。線粒體p53誘導(dǎo)細胞凋亡的優(yōu)點包括繞過核p53途徑，增加凋亡誘導(dǎo)速度，減少癌細胞克服p53作用的可能突變池，并避免顯性負作用。理論上允許強大的p53凋亡活性，無論腫瘤p53狀態(tài)。這些作用可以通過p53與線粒體靶向信號（MTS）融合來實現(xiàn)，以增加線粒體定位，我們已經(jīng)證明這可以誘導(dǎo)卵巢癌和乳腺癌的細胞凋亡。
圖1 p53-Bad*與線粒體凋亡
(A)激活時，促凋亡蛋白Bak和Bax同質(zhì)寡聚并誘導(dǎo)線粒體孔的形成，釋放細胞色素c。這導(dǎo)致caspase級聯(lián)激活，凋亡體的形成，并誘導(dǎo)凋亡。(B)抗凋亡因子如Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1與Bak和/或Bax結(jié)合，阻止同質(zhì)寡聚。在線粒體，p53 (C)滅活抗凋亡因子，(D)激活Bak和Bax。(E)促凋亡的BH3-only蛋白如Bad與抗凋亡因子結(jié)合，釋放Bak和Bax。(F) p53-Bad*定位于線粒體，使p53和Bad具有雙重活性。
為了進一步增加凋亡活性，我們將p53融合到促凋亡的線粒體蛋白而不是mts中。細胞在抗凋亡因子和促凋亡因子的平衡下會導(dǎo)致線粒體凋亡。抗凋亡因子(如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和Bcl-W)可以隔離凋亡誘導(dǎo)劑Bak和Bax，而促凋亡的BH3蛋白(如Bad、Bid和Bim)具有BH3結(jié)構(gòu)域，可以阻斷抗凋亡因子上的Bak/Bax結(jié)合位點，阻止它們抑制細胞凋亡。癌細胞經(jīng)常上調(diào)抗凋亡因子的水平，使這種平衡遠離凋亡活性，在HCC中，Bcl-xL在三分之二的患者樣本中高度上調(diào)。高Bcl-xL水平與患者中位生存時間減少31.4個月相關(guān)，并與Mcl-1水平升高相關(guān)(在51%的HCC患者樣本中上調(diào))。
由于p53同時抑制Mcl-1和Bcl-xL，預(yù)計通過與BH3蛋白融合，直接靶向這些抗凋亡因子中的任何一個，可以增加線粒體凋亡(除了p53線粒體定位的影響外)。我們選擇Bad (Bcl-2細胞死亡拮抗劑)作為p53融合(p53-Bad)的理想候選者，因為它能強烈結(jié)合Bcl-xL, HCC中最高度上調(diào)的抗凋亡因子。Bad還能結(jié)合Bcl-W和Bcl-2。由于Bad與線粒體外膜結(jié)合而不是插入跨膜結(jié)構(gòu)域，Bad也可能比其他BH3蛋白更有利，因為p53和Bad都需要結(jié)合不同的靶標(biāo)來誘導(dǎo)細胞凋亡。
Bad在112和136位點含有兩條絲氨酸，它們可以被磷酸化，導(dǎo)致支架蛋白14-3-3與Bad結(jié)合并隨后被細胞質(zhì)隔離將這些絲氨酸突變?yōu)楸彼嵯诉@些磷酸化位點，并產(chǎn)生了一種在文本中稱為Bad*的蛋白質(zhì)。我們之前的研究表明，p53-Bad*融合增加了線粒體在p53-Bad上的定位，并誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡。本文詳細介紹了線粒體定位、體外凋亡活性和p53-Bad*在斑馬魚體內(nèi)抗肝癌的功效。
材料和方法
克?。?/p>
構(gòu)建體pCMV-EGFP、pCMV-EGFP-p53、pCMV-EGFP-bad、pCMV-EGFP-bad*、pCMV-EGFP-p53-bad、pCMV-EGFP-p53-bad*的克隆和突變與前作相同。
細胞系，維持和轉(zhuǎn)染：
細胞系購自ATCC，在37℃和5% CO2條件下單層培養(yǎng)于燒瓶中。肝癌細胞系包括HepG2/C3A（C3A, HepG2衍生物，WT p53）、Hep3B2.1-7 （Hep3B, p53無效）、PLC/PRF/5（PP5，顯性陰性p53）和Snu398（p53無效）。細胞保存在DMEM（C3A、Hep3B和PLC/PRF/5）或RPMI 1640（Snu398）中。培養(yǎng)基中添加1% L-谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素和10% FBS（Atlanta Biologicals）。細胞以40萬/孔的速度接種于六孔板（Sigma Aldrich）進行檢測或兩孔觀察室（Thermo Fisher）進行顯微鏡觀察。24小時后，按照制造商的說明，使用JetPrime試劑（PolyPlus Transfection）轉(zhuǎn)染每孔1pmol DNA。所有實驗均在細胞傳代5至20代之間進行。
線粒體染色、顯微鏡和圖像分析：
轉(zhuǎn)染24小時后，細胞與之前一樣染色，然后使用熒光尼康A(chǔ)1R共聚焦顯微鏡（Cell Imaging Core Facility，University of Utah）的60X Plan Apo油浸物鏡成像。與之前一樣，使用NIS軟件進行圖像可視化，并使用ImageJ中的JACoP插件進行Pearson’s correlation coefficient (PCC)共定位分析和post-Costes’自動閾值算法重復(fù)實驗，每個構(gòu)建物/細胞系≥30個細胞。
TMRE化驗：
四甲基羅丹明乙酯(TMRE)測定方法如前所述。簡單地說，細胞在轉(zhuǎn)染24 h后成球，在100nM的TMRE（Invitrogen）中重懸，在37°C下孵育20-40m。孵育后，流式細胞儀分析細胞（FACS-canto-ii，使用FACS Diva軟件，流式細胞儀核心設(shè)施，猶他大學(xué)）。實驗重復(fù)3次，每3次獨立轉(zhuǎn)染，然后將最低的線粒體試驗外膜通透性（MOMP）值設(shè)為0%，最高的MOMP值設(shè)為100%歸一化，以結(jié)合實驗。
Annexin V檢測：
轉(zhuǎn)染24 h后，收集培養(yǎng)基和細胞，制粒，在冷PBS中洗滌2次，然后懸浮在100 μL冷膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液（Biolegend）中。每個樣品加入5μL apc偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白V（Biolegend），然后加入5μL 7-AAD（Biolegend），每次加入后，樣品在室溫下渦流孵育5 min。每個樣品加入300 μL膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液，旋流保存，在LSRFortessa（BD-BioSciences, Flow Cytometry Core Facility）上進行分析。檢測細胞形態(tài)和EGFP（綠色熒光蛋白）表達（激發(fā)488 nm/檢測507 nm），然后檢測annexin V（激發(fā)640 nm/檢測660 nm）和7-AAD（激發(fā)496 nm/檢測785 nm）。每個結(jié)構(gòu)在三個單獨的實驗中進行三次分析，并將膜聯(lián)蛋白V數(shù)據(jù)歸一化，最低（GFP）結(jié)構(gòu)為0%，最高為100%。
7-AAD化驗：
7-氨基放線菌素D測定方法同前。簡單地說，轉(zhuǎn)染后將細胞制成顆粒24h（PLC/PRF/5和Snu398）或48h（C3A和Hep3B2.1-7），然后在1.25μg/mL 7-AAD（Invitrogen）中重懸。細胞冰凍后，流式細胞術(shù)（FACS-Canto-II）對細胞進行分析每個實驗重復(fù)3次，每3次獨立轉(zhuǎn)染，將7-AAD最低值設(shè)為0%，最高值設(shè)為100%歸一化，將3次實驗合并。
斑馬魚品系和Tg(fabp10a：p53-Bad*)斑馬魚的生成：
斑馬魚的所有護理和安樂死均按照猶他大學(xué)IACUC指南（21-09009）進行。雌性和雄性Tg（fabp10a：pt-β-cat）和野生型AB和TL保持不變。對于Tg（fabp10a：p53-Bad*），用引物5 ' -CTAGTTAGATCTATGGAGGAGCCGCAGTCAG-3'和5' -TAAATTGCGGCCGCTCACTGGGAGGGGGCGGAG-3 '從pcpv-egfp-p53-Bad*中擴增出p53-Bad*，含有BglII和NotI位點。在fabp10a啟動子之后，將p53-Bad*插入到含有晶狀體特異性啟動子晶體蛋白αa (cryaa)的質(zhì)粒中，隨后是mCherry熒光蛋白編碼序列。該質(zhì)粒還具有I-SceI限制性內(nèi)切酶位點，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因斑馬魚，簡而言之，在奧林巴斯SZ51顯微鏡下，將單細胞期的胚胎同時微注射fabp10a：p53-Bad*質(zhì)粒和I-SceI酶（New England Biolabs）。將受精后3~4天紅眼睛的胚胎飼養(yǎng)至成年，并與野生型斑馬魚進行異交。將紅眼睛的后代指定為F0個建立者，培養(yǎng)F0個在3?4 dpf表達cryaamCherry的后代，以維持p53-Bad*F1B系。
qRT-PCR：
使用Direct-zol RNA迷你試劑盒（zimo Research）對每個細胞系、轉(zhuǎn)染細胞系和斑馬魚肝臟樣本進行RNA提取。對于斑馬魚肝臟，切片在解剖后立即在- 80°C冷凍，研磨，然后在TriReagent（zimo Research）中渦流，然后提取RNA。提取RNA前，在TriReagent中渦流1x106個細胞/樣品。在使用Superscript III第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒（ThermoFisher）制備cDNA之前，將樣品稀釋至相同的RNA濃度。預(yù)先設(shè)計的Taqman探針（ThermoFisher）靶向人18S（Hs99999901_s1）、人Bad（Hs00997773_m1）、人p53（Hs01034254_g1 TP53）、人Mcl-1（Hs01050896_m1 MCL1）、人Bcl-2 （Hs01048932_g1 BCL2）、人Bcl-xL（Hs00236329_m1 BCL2L1）和斑馬魚β-actin （Dr03432610_m1 actb1）。使用Taqman Universal PCR Master Mix（ThermoFisher）在StepOnePlus實時熒光定量PCR機（Applied Biosystems）上在96孔板（Genesee Scientific）上運行qRT-PCR。每個樣本的數(shù)據(jù)一式兩份，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和18S（人細胞系樣本）或β actin（斑馬魚樣本）在Microsoft Excel中的表達進行歸一化。
肝臟解剖與組織學(xué)：
將Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚（綠色眼睛）與Tg（fabp10a：p53-Bad*）基因F1B（紅色眼睛）雜交，分析幼魚和成年斑馬魚的組織學(xué)和肉眼變化。用熒光解剖顯微鏡觀察受精后3天（dpf）或之后的眼睛顏色，將卵分為四組：(?)pt-β-cat/(?)p53-Bad*，(?)pt-β-cat/(+)p53-Bad*，（+）pt-β-cat/(?)p53-Bad*和(+)pt-β-cat(+)p53-Bad*。對于幼蟲實驗，斑馬魚被安樂死、解剖，和以前一樣分析。成蟲實驗中，飼養(yǎng)3只p53-Bad* f1bxβ-cat，并將其飼養(yǎng)在平行箱中（每箱4只）。受精后6個月（mpf），斑馬魚被快速冷卻安樂死。通過檢查眼睛顏色來確定基因型。稱重斑馬魚，用奧林巴斯SZ51顯微鏡解剖肝臟，PBS沖洗，稱重。計算肝臟與身體的質(zhì)量比。肝臟樣品在4%多聚甲醛中固定24-48 h，然后在70%乙醇中保存。樣品涂上藍色或黑色組織標(biāo)記染料（StatLab醫(yī)療產(chǎn)品），噴灑3%醋酸，干燥5-10 s，用70%乙醇沖洗，包裝在盒中，然后提交給ARUP實驗室進行石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅（H&E）染色。完成的載玻片經(jīng)盲法處理，由專業(yè)病理學(xué)家K.J.E.和以前一樣分析組織學(xué)變化標(biāo)本被劃分為(1)HCC，(2)輕度改變，或(3)正常/輕微改變。在GraphPad Prism 9.2.0中對(+)pt-β-cat/(?)p53-Bad*組和(+)pt-β-cat/(+)p53-Bad*組進行Fischer精確檢驗。實驗進行了三次（三個獨立的離合器），每次都看到類似的趨勢。圖4是這些實驗的匯總結(jié)果。
TUNEL檢測：
未染色的石蠟包埋肝切片切片重新水化。對于TUNEL實驗，載玻片用ApopTag過氧化物酶原位凋亡檢測試劑盒（Millipore）處理，片段DNA DAB染色和甲基綠反染。使用尼康Eclipse TE2000-U顯微鏡捕獲每個肝臟橫切面的10個代表性框架（遠離組織邊緣和其他潛在的偽影）。對圖片進行盲法處理，計數(shù)陽性染色（凋亡）細胞。陽性對照，在非轉(zhuǎn)基因載玻片上進行DNaseI處理，顯示肝細胞核彌漫性染色。采用Olympus BX53顯微鏡、DP73相機和cellSens Entry 1.16軟件拍攝具有代表性的H&E和tunel染色切片。
統(tǒng)計數(shù)據(jù)：
除特別說明外，所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 6.01或9.2.0的Tukey事后檢驗進行單因素方差分析，其中ns=不顯著，*p< 0.05， **p<0.01， ***p< 0.001， ****p< 0.0001。
結(jié)果
熒光顯微鏡檢測不同p53突變狀態(tài)的肝癌細胞系中p53-bad*的線粒體定位
為了確定p53-bad和/或p53-bad*是否能夠成功地使p53定位到線粒體，我們用三種不同p53狀態(tài)的肝癌細胞系——c3a（p53 WT）、Hep3B（p53 null）和PLC/PRF/5（p53 R249S）進行了實驗。p53的細胞狀態(tài)有兩個問題：首先，我們的p53-bad結(jié)構(gòu)體被假設(shè)會誘導(dǎo)細胞凋亡，而不管p53的狀態(tài)如何；其次，細胞中的p53可能與p53-bad結(jié)構(gòu)體四聚，導(dǎo)致p53-bad定位的改變和失活。r249s顯性負p53突變是特別有趣的，因為在過去，WT p53基因治療的顯性負抑制一直是成功治療癌癥的障礙。
在顯微鏡研究中，Hoechst和MitoTracker染料分別表明細胞核和線粒體位置，并且通過GFP融合熒光定位構(gòu)建體（圖2A）。正如預(yù)期的那樣，所有細胞系均未顯示GFP對照的特異性定位模式，也未顯示W(wǎng)T p53構(gòu)建體的核定位模式13所有細胞系也顯示了p53-Bad的細胞核和線粒體定位，這很可能是由于p53的細胞核定位信號和Bad的MTS之間的相互作用。S112A和S136A突變使Bad MTS能夠如預(yù)期那樣壓倒p53的核定位信號。這種效應(yīng)在不同細胞系中強度不同，這可能是由于p53狀態(tài)不同。PLC/PRF/5 (R249S p53突變)似乎具有最強的p53-bad核內(nèi)定位，低于0.6閾值的線粒體共定位PCC被認為是線粒體共定位(圖2B)。這可能是由于p53-bad與突變的細胞p53結(jié)合，從而增加細胞核定位。Hep3B2.1-7是p53缺失的細胞，沒有p53與p53 bad結(jié)合的能力。Hep3B2.1-7細胞核定位最少，被認為是線粒體共定位(PCC>0.6)。野生型p53細胞系C3A為中間核定位。所有三個細胞系的p53-Bad*均顯示PCC>0.6，表明定量線粒體共定位，并且與p53-Bad相比線粒體定位更多(圖2B)。
圖2 HCC細胞系顯微鏡下測定線粒體定位抗
(A)轉(zhuǎn)染CMV-GFP、CMV-GFP- bad、CMV-GFP- bad、CMV-GFP-p53- bad、CMV-GFP-p53- bad、CMV-GFP-p53- bad *的C3A (WT p53)、Hep3B2.1-7 (p53 null)和PLC/PRF/5 (p53 R249S)的代表性細胞。細胞核顯示為藍色(Hoechst)，線粒體顯示為紅色(MitoTracker)，每個結(jié)構(gòu)體顯示為綠色(GFP)。(B)紅色(線粒體)和綠色(結(jié)構(gòu)體)的PCC共定位分析。
細胞系凋亡檢測p53-Bad*在4種肝癌細胞系中的凋亡活性
為了評估p53-Bad和p53-Bad*構(gòu)建體是否誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，我們對C3A、PLC/PRF/5、Hep3B和Snu398細胞系進行了三種不同的凋亡檢測。TMRE評估早期凋亡的MOMP變化，膜聯(lián)蛋白V探索中期凋亡膜的變化，7-AAD監(jiān)測細胞膜通透性的晚期凋亡轉(zhuǎn)移。為了確保凋亡的差異不是由構(gòu)建體的表達水平引起的，我們評估了每個細胞系，發(fā)現(xiàn)p53-bad *的表達與WT p53相比一致（圖S2）。因此，與WT p53相比，p53-Bad*的凋亡作用可能被低估了，在表達水平相同的情況下，p53-Bad*的凋亡作用可能會進一步增強。
圖S2 肝癌細胞系中p53 WT和p53-bad*蛋白表達水平直方圖
與WT p53相比，p53-bad/p53-bad*在所有四種細胞系中都增加了MOMP活性（TMRE測定）（圖3A）。這種效應(yīng)在Hep3B細胞中最為顯著，從WT p53到p53-bad和p53-bad*，MOMP增加了4倍以上。PLC/PRF/5和C3A細胞系顯示從WT p53到p53- bad/p53-bad*的MOMP增加2-3倍。Snu398細胞顯示，從WT p53到p53-bad，MOMP僅輕微增加，但從WT p53到p53-bad*，MOMP增加了約兩倍（圖S1）。p53-Bad*在PLC/PRF/5和Snu398細胞中引起的MOMP明顯高于p53-Bad（圖3A和S1）。在任何細胞系中，Bad和Bad*單獨治療的療效都不如p53-Bad*強（p<0.0001）。
圖S1 Snu398細胞的早、中、晚期凋亡測定
圖3肝癌細胞系C3A、Hep3B和PLC/PRF/5的早、中、晚期凋亡測定對于早期凋亡的TMRE檢測(左)，描述了MOMP陽性細胞的相對百分比。對于中期凋亡膜聯(lián)蛋白V檢測(中)，描繪了膜聯(lián)蛋白V陽性細胞的相對百分比。對于晚期7-AAD檢測(右)，描述了7-AAD陽性細胞的相對百分比。
annexin V測定的凋亡在所有四種細胞系中p53-Bad*結(jié)構(gòu)中最為普遍（圖3B）。與WT p53相比，C3A和Hep3B細胞中p53-bad*的膜聯(lián)蛋白V凋亡均增加了約4倍，而PLC/PRF/5細胞也增加了約1.5倍。對于Snu398細胞，p53-bad*與WT p53相比，凋亡增加了約1.5倍，但通過膜聯(lián)蛋白V測量，WT p53比p53-bad更有效地誘導(dǎo)凋亡（圖S1）。Hep3B、PLC/PRF/5和Snu398細胞顯示p53-Bad*誘導(dǎo)的凋亡量高于Bad和Bad* （p<0.0001）。
7-AAD，一種晚期凋亡的測量方法，也顯示p53-Bad*是所有四種細胞系中最有效的凋亡誘導(dǎo)劑（圖3C）。在C3A、PLC/PRF/5和Hep3B2.1?7細胞中，p53-bad*顯示7-aad凋亡比WT p53增加2-3倍。在Snu398細胞中，p53-bad再次不如WT p53有效，但p53-bad*顯示7-AAD凋亡活性比WT p53增加了1.5倍（圖S1）。p53-Bad*在誘導(dǎo)凋亡方面均優(yōu)于Bad和Bad*（p<0.0001）。
細胞系中mRNA基因表達的qRT-PCR分析顯示，與其他三種細胞系相比，Snu398細胞中Bcl-xL的表達明顯減少（圖S3）。Hep3B細胞比其他細胞系表達更多的Mcl-1, PLC/PRF/5細胞比C3A或Snu398細胞表達更多的Mcl-1（圖S3）。C3A細胞表達的Bcl-2明顯高于Hep3B和PLC/PRF/5細胞，而Snu398細胞表達的Bcl-2明顯高于PLC/PRF/5細胞。經(jīng)WT p53、p53-bad或p53-bad*處理后，C3A細胞Bcl-xL mRNA水平升高（圖S4）。與WT p53相比，Hep3B2.1-7在p53-bad或p53-bad*處理后顯示出這種增加，PLC/PRF/5和Snu398細胞在p53-bad處理后顯示出與WT p53相比Bcl-xL mRNA水平的增加（圖S4）。
圖S3 Bcl-xL、Mcl-1和Bcl-2在肝癌細胞系中的表達
圖S4 WT p53、p53-bad、p53-bad*治療后Bcl-xL mRNA表達水平
斑馬魚的體內(nèi)研究
作為確定p53-Bad*在活體脊椎動物中的作用的第一步，我們在肝細胞特異性fabp10a啟動子的控制下產(chǎn)生了表達p53-Bad*的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。通過qRT-PCR，在Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚的代表性隊列中證實了p53-Bad*的表達，同時使用靶向人類Bad和人類p53的探針（圖S5）。Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚可育，無明顯表型。在6 dpf時，Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚和對照兄弟姐妹之間的肝臟大小沒有顯著差異（圖S6）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明p53-Bad*不會破壞非癌性肝組織，至少不會超出斑馬魚肝臟的再生能力。
圖S5 p53-Bad*在斑馬魚中的表達
圖S6 斑馬魚受精后6天的幼蟲肝臟大小
為了確定p53-Bad*對斑馬魚肝癌發(fā)生的影響，我們將Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚與Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚雜交，它們表達肝細胞特異性活化的β-catenin，并在6個月大時以約80%的外顯率發(fā)展為HCC。我們分析了四個實驗組：(1)非轉(zhuǎn)基因(NT)；(2) Tg（fabp10a：p53-Bad*）；(3) Tg（fabp10a：pt-β-cat）；(4)Tg（fabp10a：p53-Bad*）；Tg（fabp10a：pt-β-cat）。所有四組均增加至6 mpf，稱重，然后解剖計算肝臟與身體的質(zhì)量比，這是肝臟腫瘤負荷的指標(biāo)（圖4A）。Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚的肝臟與身體質(zhì)量比與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招值荇~相比無顯著差異（平均0.025 vs 0.034，p= ns）。與之前一樣，Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚的肝臟與身體質(zhì)量比顯著高于非轉(zhuǎn)基因斑馬魚（平均值0.085 vs 0.034，p < 0.0001）。Tg（fabp10a：p53Bad*）、Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚表達肝細胞特異性p53-Bad*和pt-β-catenin的肝體質(zhì)量比顯著低于單獨表達pt-β-catenin的Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚（平均0.044 vs 0.085， p < 0.0001）。
每個肝臟由委員會認證的病理學(xué)家K.J.E.進行組織學(xué)分析，并將其分為正常/輕微變化，輕度變化或HCC27（圖4B，C）。與之前一樣，27條表達肝細胞特異性激活β-catenin的斑馬魚比非轉(zhuǎn)基因的對照兄弟魚明顯顯示更多的HCC（圖4B, 87.5% vs 0%;Fisher精確檢驗，p < 0.0001）。肝細胞特異性p53-Bad*的共表達導(dǎo)致表達肝細胞特異性活化β-catenin的斑馬魚的HCC水平顯著降低（圖4B，67.4 vs 87.5%；Fischer精確檢驗，p = 0.04）。
圖4 p53-Bad*對F1B p53-Bad*斑馬魚HCC腫瘤影響的表征
(A) p53-Bad*對肝-體質(zhì)量比測定的肝癌腫瘤負荷的影響。(B) p53-Bad*對p53-Bad*的肝臟組織學(xué)影響。(C)未見明顯病理異常的雄性斑馬魚(上圖)-細胞核均勻、圓形、間隔規(guī)律，結(jié)構(gòu)正常，包括分散的膽管(插圖)；輕度改變(中圖)-結(jié)構(gòu)正常，包括膽管分散(箭頭)，但偶見核增大(插圖)；HCC(下圖)-結(jié)構(gòu)紊亂，核增大，多形性，不規(guī)則(插圖)。
為了確定p53-Bad*在體內(nèi)誘導(dǎo)的細胞凋亡活性，我們對斑馬魚肝臟切片進行TUNEL染色。非轉(zhuǎn)基因、僅p53-Bad*和僅pt-β-cat斑馬魚每10個高倍場（HPF）分別顯示0.83、1.33和1.60個凋亡小體（圖5，p = ns，三種比較）。經(jīng)p53-Bad*處理的pt-β-cat魚平均每10 HPF有14個凋亡小體（圖5，P < 0.01）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持p53-Bad*誘導(dǎo)細胞凋亡，導(dǎo)致β-catenin驅(qū)動的肝癌斑馬魚肝臟腫瘤負荷降低的假設(shè)。
圖5 p53-Bad*/pt-β-cat斑馬魚的細胞凋亡
(A)斑馬魚肝臟橫斷面TUNEL法檢測凋亡小體。(B) TUNEL染色代表性圖像;箭頭指向凋亡小體。
討論
在這里，我們證明在p53狀態(tài)可變的肝癌細胞系中，與p53-bad和WT p53相比，p53-bad*的線粒體定位和凋亡誘導(dǎo)增加。將這些結(jié)果擴展到斑馬魚體內(nèi)肝癌模型，我們發(fā)現(xiàn)肝細胞特異性p53-Bad*減少了肝臟腫瘤負荷并促進了細胞凋亡。
無論p53狀態(tài)或其他突變?nèi)绾危覀兊膒53-bad*融合構(gòu)建在所有肝癌細胞系和凋亡檢測評估中均能顯著誘導(dǎo)更多的細胞凋亡，最高可達WT p53的4.5倍。這一發(fā)現(xiàn)不是由于蛋白表達增加，因為在所有細胞系中，WT p53的表達水平始終高于p53-bad*（圖S2）。盡管p53-Bad在大多數(shù)情況下被證明是一種強大的凋亡誘導(dǎo)劑，但對Snu398細胞的凋亡實驗（圖S1）表明，至少一些細胞系對p53-Bad*的反應(yīng)明顯高于p53-Bad。
盡管p53-bad*在四種細胞系中均能有效誘導(dǎo)凋亡，但不同細胞系中p53-bad*、p53-bad和WT p53的凋亡活性差異令人感興趣，例如不同細胞系對WT p53的反應(yīng)性存在差異，這可能與p53的突變狀態(tài)有關(guān)。在C3A中，WT p53的存在需要癌細胞進化才能破壞p53的促凋亡作用。增加WT p53的表達可能不足以克服這些顛覆性機制。完全缺乏p53的Snu398細胞更容易受到WT p53過表達的影響（圖S1）。單獨使用Bad和Bad*的反應(yīng)也存在差異，在C3A中，Bad和Bad*誘導(dǎo)細胞凋亡的效果始終高于WT p53（WT p53），在Snu398中，Bad和Bad*誘導(dǎo)細胞凋亡的效果低于WT p53（p53 null），在Hep3B2.1-7（p53 null）和PLC/PRF/5（p53 R249S）中，不同檢測方法之間存在差異。Bcl-xL和Bcl-2水平在細胞系之間的差異至少可以部分解釋這一現(xiàn)象；C3A對Bad和Bad*最敏感，與其他細胞系相比，Bcl-xL和Bcl-2 （Bad的主要和次要結(jié)合伴侶）的表達水平也較高（圖S3）。Hep3B2.1-7和PLC/PRF/5細胞在Bad和Bad*的作用下表現(xiàn)出中等水平的凋亡活性（圖3），與其他細胞系相比，它們的Bcl-xL水平相對較高，但Bcl-2水平非常低（圖S3）。對Bad/Bad*最不敏感的Snu398細胞Bcl-2水平有所升高，但Bcl-xL水平相對較低（圖S3）。就與p53-Bad*的相互作用而言，Bcl-xL可能是這些因子中最關(guān)鍵的，因為Bcl-xL是Bad的主要結(jié)合伙伴；Bcl-xL水平似乎比Bcl-2對Bad/Bad*療效的影響更大，而Snu398細胞是唯一Bcl-xL水平顯著降低的細胞系，在WT p53和p53-Bad*之間，其凋亡活性的改善最小（圖S1）。
基于這一想法，我們簡要探討了我們的構(gòu)建物對細胞中Bcl-xL表達水平的影響（圖S4）。Hep3B2.1-7細胞經(jīng)p53-Bad或p53-Bad*處理后，與未處理和WT p53處理的細胞相比，Bcl-xL mRNA增加（圖S4）。一種可能的解釋是，癌細胞對治療的反應(yīng)是增加Bcl-xL水平，試圖從凋亡中恢復(fù)過來。這種效應(yīng)可能被略微高估了，因為在這個時間點仍然存活的細胞自然會比已經(jīng)發(fā)生凋亡的細胞平均表達更多的Bcl-xL。有趣的是在PLC/PRF/5細胞中，轉(zhuǎn)染p53-Bad后Bcl-xL水平升高，而轉(zhuǎn)染p53-Bad*后Bcl-xL水平升高（圖S4）。這可能是由于p53-Bad*殺死癌細胞的速度更快，使癌細胞對這種結(jié)構(gòu)做出反應(yīng)的時間更少。正如在所有細胞系中看到的p53-Bad*的強凋亡作用所證明的那樣（圖3），這些反應(yīng)似乎不足以通過p53-Bad*阻止細胞凋亡，這可能是由于p53-Bad*融合與線粒體凋亡相關(guān)因子的相互作用比單獨的Bad更多（圖1）。
在Hep3B2.1-7中，WT p53誘導(dǎo)的凋亡比在Snu398中少，盡管這兩種細胞系都是p53均為零。這種差異的一個可能解釋是這些細胞系之間關(guān)鍵基因如Bcl-xL、Mcl-1和/或β-catenin的不同表達。我們發(fā)現(xiàn)，與Hep3B相比，Snu398中Bcl-xL和Mcl-1的表達較低（圖S3）。由于單獨表達p53不足以誘導(dǎo)Hep3B細胞凋亡，必須通過抑制Bcl-xL來補充，因此Bcl-xL在Snu398細胞中的低表達可能使其比Hep3B更容易被p53誘導(dǎo)凋亡。同樣，Hep3B細胞比Snu398細胞具有更高水平的活性β-連環(huán)蛋白。p53已被證明可促進β-catenin的降解，因此，β-catenin含量高的細胞（如Hep3B）可能比β-catenin含量低的細胞（如Snu398）需要更多的p53才能成功中和額外的β-catenin。
接下來，我們探討了p53-Bad*在脊椎動物HCC模型中的療效。我們產(chǎn)生了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg（fabp10a：p53-Bad*），在肝臟細胞中表達p53-Bad*，并將其與Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚雜交，其中活化的β-catenin的肝細胞特異性表達導(dǎo)致約80%的斑馬魚發(fā)生6 mpf的HCC。我們發(fā)現(xiàn)p53-Bad*基因在β-catenin驅(qū)動的HCC模型中顯著降低了肝臟腫瘤負荷，增加了細胞凋亡。這一令人信服的發(fā)現(xiàn)表明，p53-Bad*在脊椎動物模型中抑制肝癌的發(fā)生，而不會引起實質(zhì)性的毒性。
我們觀察到p53-Bad*沒有顯著增加非癌性斑馬魚肝臟的細胞凋亡，至少有三種可能的解釋。首先，p53-Bad*在斑馬魚肝細胞中的表達水平可能不足以導(dǎo)致細胞死亡。這種解釋不太可能，因為(a) p53-Bad*是由一種強的肝細胞特異性啟動子fabp10a驅(qū)動的；(b)通過qPCR檢測斑馬魚肝臟中p53-Bad*的顯著表達；(c)在p53-Bad*轉(zhuǎn)基因存在的情況下，斑馬魚HCC的肝臟更小，細胞凋亡更多，支持p53-Bad*凋亡活性。其次，p53-Bad*可能在大多數(shù)斑馬魚肝細胞中誘導(dǎo)細胞死亡，但p53-Bad*轉(zhuǎn)基因沉默發(fā)生在一小部分肝細胞中，這些細胞能夠重新填充肝臟。完全轉(zhuǎn)基因沉默似乎不能解釋p53-Bad*在非hcc斑馬魚中的低毒性，因為我們在Tg（fabp10a：p53-Bad*）和Tg（fabp10a：p53-Bad*）；Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚中檢測到類似的p53-Bad*表達。盡管如此，轉(zhuǎn)基因沉默和隨后的再生可能至少是低毒性的部分原因，特別是如果至少一些斑馬魚肝細胞中的p53-Bad*水平低到足以使細胞逐漸凋亡。第三，p53-bad*可以保留部分WT p53的癌特異性。這種可能性是出乎意料的，因為大多數(shù)p53的癌癥特異性是通過其作為核轉(zhuǎn)錄因子的作用發(fā)生的，因此p53-bad*應(yīng)該在線粒體中丟失?？偟膩碚f，我們假設(shè)在表達p53-bad*的非hcc斑馬魚中觀察到的低毒性涉及部分轉(zhuǎn)基因沉默、肝細胞再生和可能保留的一些p53癌癥特異性的組合。
斑馬魚HCC模型的兩個局限性是其體積小，這阻礙了局部遞送方法，以及缺乏建立的斑馬魚HCC特異性啟動子，如甲胎蛋白，甘聚糖-3和白蛋白。我們實驗室未來的研究旨在探索基于甲胎蛋白的啟動子在HCC小鼠模型中的癌癥特異性遞送。在更大的動物模型和人類患者中，在p53-Bad*構(gòu)建體中加入動脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)遞送和/或hcc特異性啟動子可以進一步增強p53-Bad*的有效性，同時限制毒性。
結(jié)語
綜上所述，p53-bad*在所有測試的肝癌細胞系中都能持續(xù)誘導(dǎo)有效的細胞凋亡，并且無論p53的突變狀態(tài)如何，它都能大大提了WT p53的凋亡活性，這表明它有望成為未來癌癥基因治療的一種方法，可以克服WT p53的許多缺點。在脊椎動物肝癌模型中，p53-Bad*有效地降低了腫瘤負荷和HCC發(fā)病率，并誘導(dǎo)了細胞凋亡，且毒性很小。這項研究是首個針對肝癌的同類研究，也是首個在體內(nèi)證明p53-Bad*對任何癌癥有效的研究。特別有趣的是，與我們的預(yù)期相反，p53-Bad*在斑馬魚中表現(xiàn)出最小的體內(nèi)毒性，盡管在該模型中缺乏癌癥特異性。這是令人鼓舞的證據(jù)，表明該基因結(jié)構(gòu)可能保留了WT p53的一些癌癥特異性，同時獲得了增加的細胞凋亡功效，表明p53-bad*具有進一步開發(fā)用于各種HCC患者治療的潛力。
基金：本項目由5R21CA241015-02基金會、ALSAM基金會、R01CA222570基金會等資助。
原文：Bowman K E R, Ahne L, O’Brien L, et al. p53-Bad* Fusion Gene Therapy Induces Apoptosis In Vitro and Reduces Zebrafish Tumor Burden in Hepatocellular Carcinoma[J]. Molecular Pharmaceutics, 2022, 20(1): 331-340.
原文地址：https://pubs.acs.org/10.1021/acs.molpharmaceut.2c00665
蘇州木芮生物科技有限公司
Suzhou Murui Biotech Co.，Ltd.
服務(wù)熱線：0512-8957 3668
地址：江蘇省蘇州市工業(yè)園區(qū)東富路45號聯(lián)創(chuàng)產(chǎn)業(yè)園7幢
手機：18013764755（微信同號）
郵箱：muruibio@sina.com
