雜志：Cell Death and Disease
影響因子：9.685（2022）
年份：2022
通訊作者：Francesca Maradonna, Camilla M. Fontana.
通訊作者單位：Department of Fisheries,Faculty of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.
摘要
背景：結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一。近年來，大麻素因其潛在的抗癌作用和癥狀管理而被廣泛研究。一些體外研究報道了anandamide(AEA)阻斷癌細(xì)胞增殖和遷移的能力，但體內(nèi)研究的證據(jù)仍然缺乏。
方法：本研究評估了AEA暴露對移植HCT116細(xì)胞的斑馬魚胚胎的影響。將48hpf異種移植物分別暴露于10nMAEA、10nM大麻素1受體(CB1)拮抗劑/逆激動劑之一AM251和AEA+AM251，以驗證AEA治療的特異性效果。
結(jié)果：通過共聚焦顯微鏡評估AEA的有效性，結(jié)果表明這些異種移植物的腫瘤大小較小，腫瘤血管生成減少，并且沒有微轉(zhuǎn)移形成。為了獲得AEA作用的更深入證據(jù)，通過分子分析完成了顯微鏡觀察。對斑馬魚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行的RNA測序報告了與細(xì)胞增殖、血管生成和免疫系統(tǒng)有關(guān)的基因的下調(diào)。相反，HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)錄不受AEA處理的影響。事實上，體外HCT116培養(yǎng)證實了AEA暴露不影響細(xì)胞增殖和活力，這表明腫瘤大小的減小主要取決于對魚的直接影響，而不是對移植癌細(xì)胞的影響。AEA可通過socs3和pcnpmRNA及Vegfc蛋白水平降低細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成，并可通過il-11a、mhc1uba和csf3bmRNA的降低發(fā)揮抗炎作用。值得注意的是，在暴露于AM251的群體中獲得的結(jié)果，其存在抵消了AEA的有益作用。
結(jié)論：本研究通過促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的能力，促進(jìn)了AEA在個性化癌癥治療中的功效，并強(qiáng)烈支持將斑馬魚異種移植作為癌癥研究的新興模型平臺。
關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌，斑馬魚，大腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞，顯微注射，轉(zhuǎn)化研究
前言
在過去的幾十年里，大麻素被廣泛用于姑息治療，以緩解癌癥患者的疼痛、緩解惡心和刺激食欲。然而，迄今為止的幾項研究強(qiáng)調(diào)了使用大麻素時安全措施的重要性，以避免認(rèn)知功能損害。另一方面，以大麻素為基礎(chǔ)的藥物在氧化應(yīng)激過程的調(diào)節(jié)中的作用是認(rèn)知障礙的基礎(chǔ)，并認(rèn)識到內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(ECS)是這種神經(jīng)保護(hù)活性的主要參與者。然而，在過去的幾年里，大部分的興趣指向增加大麻素抗腫瘤活性的知識，這取決于它們與ECS網(wǎng)絡(luò)或其他細(xì)胞途徑相互作用的能力，影響疾病的發(fā)生/進(jìn)展。具體來說，越來越多的報道強(qiáng)調(diào)了大麻素在癌癥擴(kuò)散、侵襲、血管生成、遷移和轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用。ECS激動劑通過與大麻素受體結(jié)合，激活Gi/o蛋白偶聯(lián)受體，觸發(fā)信號級聯(lián)，下調(diào)促血管生成因子，包括血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和血管生成素-2(ang2)。此外，大麻素類化合物抑制血管生成和侵襲，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(TIMP-1)的組織抑制劑的釋放，而TIMP-1反過來又作為內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)抑制劑。此外，大麻素能夠影響Wnt通路，從而改變上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和化療耐藥的證據(jù)已經(jīng)在不同的腫瘤類型中得到證實，并與β-catenin靶基因和間質(zhì)標(biāo)記物的減少有關(guān)[9]。以n-花生四烯酰基乙醇胺，anandamide(AEA)為研究對象，先前的體外實驗結(jié)果證明了其在抑制乳腺腫瘤誘導(dǎo)的血管生成以及改變轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的代謝、糖基化特征和遷移方面的作用。
以此為出發(fā)點(diǎn)，本研究旨在探討AEA對人大腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞的抗腫瘤作用，了解其作用機(jī)制斑馬魚異種移植模型的體內(nèi)作用。與患者來源的異種移植物(PDX)和類器官不同，它們具有顯著的缺點(diǎn)，包括長時間的生長會給腫瘤帶來遺傳和表觀遺傳變化，而斑馬魚異種移植物試驗具有幾個優(yōu)點(diǎn)。年輕的胚胎缺乏有效的免疫系統(tǒng)，因此，注射的癌細(xì)胞不會被排斥，原發(fā)腫瘤和微轉(zhuǎn)移的形成很快。此外，對小而透明的異種移植物的成像可以捕捉到AEA對HCT116移植細(xì)胞或魚本身的宏觀變化。所有這些宏觀證據(jù)都將與更深入的分子工具研究相結(jié)合，例如RNA測序和Westernblot，這將為理解AEA對腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)，并有望成為未來研究的起點(diǎn)，將考慮使用這種大麻素進(jìn)行體內(nèi)癌癥治療。
方法
實驗?zāi)Ｐ?/p>
使用野生型Tuebingen (WT)、Tg(fiT:EGFP[70]和Tg(mpeg1:EGFP)22[71]轉(zhuǎn)基因斑馬魚系進(jìn)行不同的分析。Tg(fli1:EGFP) y[70]在內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物fli1基因啟動子的控制下表達(dá)EGFP[72]，而Tg(mpeg1:EGFP)922系呈現(xiàn)綠色熒光巨噬細(xì)胞群體。按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)︳~進(jìn)行養(yǎng)護(hù)。0.17 mM KCl;0.33 CaCl;0.3 mM MgSO pH=7)。所有飼養(yǎng)和實驗程序均符合意大利和歐洲保護(hù)科學(xué)用動物立法(指令2010/63/EU)。所有實驗數(shù)據(jù)均以受精后小時數(shù)(hpf)、注射后小時數(shù)(hpi)和受精后天數(shù)(dpf)表示胚胎年齡。
細(xì)胞培養(yǎng)和標(biāo)記
HCT116細(xì)胞的選擇考慮了其去分化表型、侵襲和轉(zhuǎn)移潛力以及臨床意義。對細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(VenorGeM Classic,MinervaBiolabs GmbH，#11-1025)，并在含有g(shù)lutamax-1的RPMI培養(yǎng)基1640中培養(yǎng)(賽默飛世爾科學(xué)公司，威瑟姆，USA，#61870036)，補(bǔ)充10%胎牛血清(賽默飛世爾科學(xué)公司，威瑟姆，USA，#10270106)，在37°C含5%CO2的濕化氣氛中培養(yǎng)。對于異種移植，將細(xì)胞洗滌、trypsinized，并在含有Dil Vybrant紅色熒光染料(賽默飛世爾科學(xué),威瑟姆，USA，#V22885)的RPMI培養(yǎng)基中重新懸浮20分鐘，溫度37°C。然后將細(xì)胞以1200 rpm離心5 min，丟棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次。最后，將細(xì)胞重新懸浮在PBS中注射到斑馬魚蛋黃中。
異種器官移植
將野生型(WT)、Tg(fi1:EGFP)和Tg(mpeg1:EGFP) 922斑馬魚胚胎在48 hpf時用0.04%的三卡因(Merck KGaA, Darmstad, Germany， #E10521)固定，并將其放置在含有2%瓊脂糖的魚水厚膜上。為了研究腫瘤體積以及與宿主和治療分子的相互作用，將大約200-400個Dil標(biāo)記(VybrantTM Dil)的HCT116細(xì)胞注射到卵黃囊的下段(補(bǔ)充圖1)。為了研究腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力，將相同數(shù)量的細(xì)胞直接注射到居維葉靜脈中。注射后，將異種移植物保持在35℃，直到實驗結(jié)束。在3 hpi時，注射失敗的異種移植物被丟棄。
體內(nèi)和體外給藥
花生四烯基乙醇酰胺（Anandamide-AEA）（Merck KGaA，達(dá)姆斯塔德，德國，#94421-68-8）和 1-(2,4-二氯苯基)-5(4-碘苯基)-4-甲基-N-1-哌啶基-1H -吡唑-3-甲酰胺 (AM251)（Merck KGaA，達(dá)姆斯塔德，德國，#183232-66-8），在100%乙醇中溶解，在魚水中進(jìn)一步稀釋，并在10 nM下使用。
體內(nèi)暴露
6 hpi時，將斑馬魚異種移植物隨機(jī)分為4個實驗組:
●對照(Ctrl):暴露于乙醇(乙醚)AEA:暴露于10nM AEA
●AM251:暴露于10nM AM251
●AEA+AM251:暴露10 nM AEA+10 nM AM251
每日更換化學(xué)藥品，直至4 dpf。對照組接受了等量的用于溶解化學(xué)物質(zhì)的乙醚。
體內(nèi)實驗的樣本量在整個手稿的圖例中顯示。斑馬魚實驗中使用的樣本大小由alpha誤差為0.05，統(tǒng)計力為95%確定。6個對照和6個突變/處理樣本的最小數(shù)量由樣本總體所需的大小暗示(sample size Calculator,ClinCalc.com)。熒光篩選后每個實驗可獲得的個體胚胎數(shù)量也對樣本量有影響。
通常會影響卵窩5-10%的嚴(yán)重先天性異常被排除在分析之外。數(shù)據(jù)排除的目的僅是收集由特定治療引起的具有生物學(xué)意義的表型，而不是來自野生動物中常見的零星變化。
體外暴露
采用細(xì)胞計數(shù)Kit-8比色法(CCK-8,Bimake，USA，#B34304)測定細(xì)胞活力。將HCT 116細(xì)胞用RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific，沃爾瑟姆，USA，#61870010)和10%胎牛血清(FBS)以5個×10-3細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中。37℃孵育24 h后，取出培養(yǎng)基，加入含有0.5%FBS和AEA的新培養(yǎng)基。將AEA在EtOH中直接溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基中至50μM溶液，然后依次稀釋至最終測試濃度為5、10、100 nM和1、5μM。濃度的選擇是基于先前在不同細(xì)胞系中評估AEA抗癌特性的體外研究。細(xì)胞在37°C下處理72小時，每天更換培養(yǎng)基，之后測量細(xì)胞活力。簡單地說，在每孔中加入10μl CCK-8試劑，在37°C下孵育30 min，然后使用酶標(biāo)儀(Infinite F200 PRO,Tecan,M?nnedorf，瑞士)測量450 nm處的吸光度。以對照組吸光度為100%細(xì)胞活力。存活率的計算公式為:“[處理細(xì)胞的OD(光密度)背景吸光度/未處理細(xì)胞的OD(對照)-背景吸光度]×100”。所有對照和樣品均通過4個獨(dú)立實驗進(jìn)行測量，每個濃度重復(fù)5次。數(shù)值以平均值±SD表示。
實時成像
用0.04%的三卡因麻醉3 dpi WT、Tg(fli1:EGFP)y1和Tg(mpeg1:EGFP)gl22異種移植物，包埋在1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖中，置于壓片上，用共聚焦顯微鏡分析。尼康C2共聚焦系統(tǒng)(尼康，Minato，日本)，連同軟件NIS ELEMENTS，被用來記錄圖像。在3 dpi時，注射于居維葉靜脈的WT異種移植物用0.04%三卡因麻醉，包埋于1%低熔點(diǎn)瓊脂糖中，置于凹載玻片上，使用徠卡DMR熒光顯微鏡(徠卡，Wetzlar，德國)和尼康DS-Fi2數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行分析。
腫瘤體積、血管生成、轉(zhuǎn)移勢量化
使用尼康C2共聚焦系統(tǒng)獲得的WT、Tg(fli1:EGFP)y1和Tg(mpeg1:EGFP)gl22異種移植物的所有圖像使用Fiji成像軟件(https://imagej.net/software/fiji/)進(jìn)行分析。通過計算每個Z堆疊的腫瘤面積(紅色熒光結(jié)構(gòu))獲得腫瘤大小，同時使用圖像計算器過程進(jìn)行血管生成量化。為了僅識別內(nèi)皮細(xì)胞，從fli1-eGFP信號中減去HCT116熒光信號。根據(jù)前人的工作計算總信號強(qiáng)度。使用Tg(mpeg1:EGFP)gl22異種移植物進(jìn)行巨噬細(xì)胞分析，通過計算腫瘤周圍區(qū)域存在的巨噬細(xì)胞數(shù)量。為所有樣本選擇一個相等的區(qū)域。
通過計算在所有不同處理條件下發(fā)生微轉(zhuǎn)移的3-dpi幼蟲的數(shù)量來計算微轉(zhuǎn)移動物的百分比，盡管只在蛋黃中注射。用Fiji成像軟件分析動物居維葉靜脈直接注射轉(zhuǎn)移瘤的總熒光，觀察治療分子對轉(zhuǎn)移瘤增殖的影響。
RNA提取，cDNA合成，實時熒光定量PCR
采用RNAzol RT(Merck KGaA，達(dá)姆斯塔，德國，#R4533)，從每組5池±20只幼蟲中提取總RNA?；蚪MDNA通過DNase I酶切去除(Merck KGaA，達(dá)姆斯塔德，德國，#AMPD1)。RNA濃度測定采用P330納米光度計(Implen,mnchen，德國)，完整性測定采用生物分析儀(Agilent,CA，USA)?？俁NA的一部分用于cDNA合成，一部分用于建立RNA-seq文庫。用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosys-tems，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，USA)從1μg總RNA中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。如前所述，qrt-pcr在CFX熱循環(huán)器(Bio-rad，米蘭，意大利)中用SYBR綠色法進(jìn)行。對于每個實驗組，重復(fù)(N=5)重復(fù)運(yùn)行。最終引物濃度為10 pmol/μL。同時使用核糖體蛋白13(rpl13)和核糖體蛋白0(rplp0)mrna對CFX Manager軟件3.1版(Bio-Rad)分析的靶基因表達(dá)水平進(jìn)行歸一化，包括GeneEx Macro Conversion和GenEx Macro文件，結(jié)果用條形圖表示，并給出標(biāo)準(zhǔn)差。使用primer-blast設(shè)計靶基因的特異性引物對(Supplementary Table 1)。
智人/D RNA-seq分析及差異表達(dá)分析-魚類異種移植
起始數(shù)據(jù)集包括來自四個實驗組(Ctrl、AEA、AM251和AEA+AM251)的12個樣本的RNA-seq reads。使用FASTQC軟件(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)評估讀取的質(zhì)量，然后進(jìn)行修剪步驟，以從讀取中去除適配器和低質(zhì)量堿基。使用以下參數(shù):最小長度設(shè)置為35 bp，質(zhì)量評分為25。TRIMMOMATIC軟件[81]用于該范圍。平均而言，每個樣本獲得了1.4億個過濾讀數(shù)。使用STAR aligner(version 2.7.9a)將高質(zhì)量的reads與智人基因組(GRCh38-104)和D.rerio基因組(GRCz11-105)進(jìn)行比對[82]。平均而言，0.74%的總reads可以在人類基因組上唯一定位，81.76%的reads可以在斑馬魚基因組上唯一定位。為了在這兩個物種之間進(jìn)行消歧，使用了disambigate軟件。Feature-Counts(version 2.0.0)[83]用于計算作為原始片段計數(shù)的基因表達(dá)值。此外，通過使用m值的修剪平均值和每千基百萬次歸一化的片段，對原始片段計數(shù)進(jìn)行歸一化。
Western blot分析
從3個不同的池中取出全幼蟲勻漿，每組15-20只幼蟲，電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF上，如前所述。簡單地說，每種蛋白質(zhì)樣品采用4%堆疊和10%分離的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離7 mg，并使用微型反式印跡電泳轉(zhuǎn)移細(xì)胞(Bio-Rad，米蘭，意大利)將其電印跡到過濾器上。使用Trans-Blot TurboTM transfer System進(jìn)行30分鐘的轉(zhuǎn)移。阻斷2%牛血清白蛋白(BSA;Merck KGaA,Darmstad,Germany，#A2153)在PBS中。以下初選抗體使用:LC3A/B(細(xì)胞信號，Beverly,MA，USA，#BK4108S)，Caspase 3(細(xì)胞信號，Beverly,MA，USA，#BK9661S)，IL6(Abcam，劍橋，英國，#ab208113，)和VEGFC(細(xì)胞信號，Beverly,MA，USA，#BK2445S，)抗體在含有2%BSA和0.1%TWEEN 20的PBS溶液中稀釋1:1000，在4°C下孵育過夜。β-肌動蛋白抗體(細(xì)胞信號傳導(dǎo)，Beverly,MA，USA，#BK4967S)作為內(nèi)標(biāo)。用ECL-PLUS(GE Healthcare,Milano,Italy)化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行Western blotting觀察反應(yīng)。使用Fiji Windows軟件進(jìn)行密度分析。
統(tǒng)計分析
RNA-seq統(tǒng)計分析用R和edgeR包進(jìn)行。edgeR包確定差分表達(dá)式使用經(jīng)驗貝葉斯估計和基于負(fù)二項模型的精確測試。所有樣本中沒有表達(dá)的基因，即零計數(shù)被丟棄。顯示FDR低于或等于0.05的基因被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用graphpad Prism V9.0.1進(jìn)行qPCR、Western blot和成像統(tǒng)計分析。(GraphPad Software,Inc.，San Diego,CA，USA)采用Shapiro-Wilk檢驗評估各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布(p>0.05)，采用Levene方差相等檢驗評估各組數(shù)據(jù)均為方差齊性(p>0.05)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM或±SD表示，并采用單向ANOVA和Dunnett多重比較檢驗進(jìn)行分析。當(dāng)收集到的數(shù)據(jù)以百分比表示時，在ANOVA之前進(jìn)行arcsin變換。直方圖柱上的星號(*)或不同字母表示組間變化具有統(tǒng)計學(xué)意義。p值設(shè)為p<0.05。使用Metaboanalyst 5.0在線平臺(University of Aberta,Edmonton,AB,Canada)對數(shù)據(jù)集進(jìn)行中位數(shù)、對數(shù)變換和Pareto標(biāo)度歸一化后，對p值<0.05的一組基因執(zhí)行無監(jiān)督PCA。為了可視化各組之間的分離，生成了一個2D評分圖，繪制了前兩個主成分，并計算了一個雙標(biāo)圖，以獲得有關(guān)投影中變量重要性的信息。
結(jié)果
移植最佳細(xì)胞數(shù)的優(yōu)化
初步實驗確定用于移植實驗的HCT116細(xì)胞的最佳數(shù)量。根據(jù)先前的研究，胚胎注射200-400或500-1000個細(xì)胞(1-3)。結(jié)果表明，只有在移植200-400個細(xì)胞的魚中，AEA濃度才能顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖，因此以該細(xì)胞數(shù)為實驗對象。
補(bǔ)充圖1 注射200-400個細(xì)胞和500-1000個細(xì)胞的WT異種移植物的HCT116腫瘤大小(3 dpi)以總Dil亮紅色熒光測量
每個試驗包括一個Ctrl組和一個AEA暴露組。取Ctrl中腫瘤大小的平均值為100%。誤差條表示SEM (200-400 cells, Ctrl N = 17 AEA N = 12;500-1000個細(xì)胞，按Ctrl N= 11 AEA N=15)。統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗分析。*， p < 0.05。
實驗性治療對HCT116斑馬魚異種移植腫瘤生長的影響
用共聚焦顯微鏡觀察HCT116細(xì)胞熒光，測定腫瘤體積。有趣的是，在暴露于AEA的異種移植物中，腫瘤大小明顯小于Ctrl(圖1A,B)。這一結(jié)果表明，AEA可以通過影響正常細(xì)胞增殖來影響腫瘤生長。這一假設(shè)進(jìn)一步得到了暴露于1-(2,4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-n-1-哌啶基-1h-吡唑-3-羧酰胺(AM251)，大麻素1(CB1)受體1逆激動劑/拮抗劑[16]/或AEA+AM251的異種移植物的證據(jù)的支持，其中腫瘤大小與Ctrl幼蟲相似(圖1B)。轉(zhuǎn)移性沉積是癌癥治療的主要問題之一，在異種移植物中得到了進(jìn)一步的研究。在所有實驗組中都觀察到HCT116細(xì)胞微轉(zhuǎn)移，但在暴露于AEA的魚中，與Ctrl魚(28%)相比，顯著減少(4%)，表明AEA對這一病理過程有積極作用。在Ctrl(28%)、AM251(28%)和AEA+AM251(24%)實驗組中，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的魚的比例相似(圖1C)。
圖1AEA暴露控制異種移植物的腫瘤大小和轉(zhuǎn)移發(fā)生
5dpf(3dpi)幼蟲的代表性共聚焦z疊圖像，腫瘤細(xì)胞被紅色熒光標(biāo)記(Dilvivid紅色染色)。比例尺100μm。B定量總Dilvivid紅色熒光。取Ctrl鍵下腫瘤大小的平均值為100%。誤差條表示SEM。C四種實驗條件下出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的幼蟲百分比。(按Ctrln=66;AEAn=73;AM251n=63;AEA+AM251n=69(5個獨(dú)立實驗)。采用單因素ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析。*p<0.01。用Biorender.com創(chuàng)建的圖像。
實驗處理對腫瘤血管生成的影響
使用Tg(fli1:EGFP)y1轉(zhuǎn)基因異種移植物可以可視化魚的血管形成(圖2A)。特別是，在這些異種移植物中，重點(diǎn)關(guān)注靠近腫瘤區(qū)域的血管，直接參與其支持和生長。在暴露于AEA的魚中，腫瘤周圍的血管生成(圖2B)比其他實驗組更不發(fā)達(dá)。特別是，與腸下區(qū)域產(chǎn)生的血管相關(guān)的信號強(qiáng)度低于Ctrl組。同時，Ctrl組與單獨(dú)使用AM251組或與AEA聯(lián)合使用組之間無差異。此外，使用Tg(mpeg1:EGFP)gl22轉(zhuǎn)基因異種移植物獲得的更深入的研究提供了證據(jù)，證明血管化的減少不是由腫瘤區(qū)域周圍巨噬細(xì)胞募集的不同引起的，因為在所有實驗組中都發(fā)現(xiàn)了相似的數(shù)量(補(bǔ)充圖2)。
圖2 AEA減少了fl1-gfp陽性異種移植物的血管化
5dpf(3dpi)幼蟲的代表性共聚焦z疊圖像，腫瘤用紅色熒光(Dilvivid染色)突出，血管用綠色熒光(Tg(fli1:EGFP)y1線)標(biāo)記。比例尺100μm。白框表示選擇用于量化血管化的感興趣區(qū)域(ROI)。B定量ROI的總綠色熒光與斐濟(jì)分析。Ctrl鍵中的平均值設(shè)為100%。誤差條表示SEM。采用單因素ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析*p<0.05;(Ctrln=18;AEAn=18;AM251n=19;AEA+AM251n=16(三個獨(dú)立實驗)。用Biorender.com創(chuàng)建的圖像。
巨噬細(xì)胞量化
補(bǔ)充圖2 HCT116細(xì)胞注射后mpeg1:EGFP幼蟲(3 dpi)的巨噬細(xì)胞分析
定量巨噬細(xì)胞(gfp陽性細(xì)胞)在相似感興趣區(qū)域(ROI)大小的數(shù)量。每個個體的熒光被歸一化以表示其腫瘤體積。對照組中巨噬細(xì)胞的平均數(shù)量設(shè)為100%。誤差條表示SEM (Ctrl N = 10;AEA N = 9;AM251 N = 8;Aea + am251 n =11)。樣本量來源于三個獨(dú)立的實驗。
異種移植物中HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的評估
這些結(jié)果為更詳細(xì)地分析AEA對轉(zhuǎn)移發(fā)生的影響奠定了基礎(chǔ)。因此，HCT116腫瘤細(xì)胞被直接注射到居維葉靜脈，從而迫使轉(zhuǎn)移出現(xiàn)。由于AEA作用特異性的證據(jù)是通過其抑制劑AM251進(jìn)行實驗獲得的，因此本實驗只考慮兩個實驗組:Ctrl和AEA。此外，由于精確控制居維葉靜脈注射的HCT116細(xì)胞數(shù)量有時非常具有挑戰(zhàn)性，因此在注射后3小時(3hpi)，根據(jù)注射的循環(huán)細(xì)胞數(shù)量將動物分為兩個亞組:小組和大組(圖3A)。各組異種移植物隨機(jī)分為按Ctrl處理和AEA處理兩種實驗條件。在3dpi時，動物體內(nèi)存在的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量(以可檢測到的紅色熒光數(shù)量為單位)。如圖3C和D所示，當(dāng)腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)入血液循環(huán)時，AEA治療可以減少轉(zhuǎn)移的生長。
圖3 AEA暴露降低HCT116轉(zhuǎn)移能力
將HCT116細(xì)胞直接注射到48hpfWT幼蟲的居維葉靜脈中。圖中顯示了考慮到HCT116循環(huán)細(xì)胞數(shù)為3hpi的實驗過程和異種移植物的分裂。圖片由Biorender.com制作。B立體顯微鏡3dpiCtrl-(左)和AEA暴露的異種移植物(右)的代表性圖像。白色箭頭指向轉(zhuǎn)移中的HCT116細(xì)胞。C,D注射少量(C)和大量(D)細(xì)胞的3dpi斑馬魚幼魚HCT116轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的綜合密度。Ctrl鍵下的綜合密度均值設(shè)為100%。誤差條表示SEM。
斑馬魚和HCT116RNA-seq和RT-PCR驗證
從上述共聚焦顯微鏡研究獲得的結(jié)果開始，進(jìn)行RNA測序分析，揭示參與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和免疫反應(yīng)的分子標(biāo)記。由于觀察到重復(fù)之間存在很強(qiáng)的可變性，因此每個實驗組一個重復(fù)被丟棄。丟棄樣本的選擇是基于主成分分析后所有樣本的總體聚類，而不僅僅是特定比較中的聚類。在Ctrl組中，AEA組中有38個差異表達(dá)基因(DEGs)，8個上調(diào)，30個下調(diào);AEA+AM251組中有6個DEGs,2個上調(diào)，4個下調(diào)。AM251與Ctrl幼蟲之間未發(fā)現(xiàn)DEGs(見熱圖，圖4)。對于智人基因組，不同實驗組之間沒有發(fā)現(xiàn)DEGs。RNAseq數(shù)據(jù)可通過NCBIBioproject-IDPRJNA911178獲取。然而，RNA測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性得到了一系列Real-Timepcr的支持，無論是DEGs，假發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，還是考慮到它們在細(xì)胞增殖，血管生成和免疫系統(tǒng)中的作用(vegfaa,vegfab,vegfd,mep1b,socs3,csf3b,il11a,mhcIuba,pcnp,casp3)選擇不具有統(tǒng)計學(xué)意義的基因(FDR≥0.05)。有關(guān)所選基因描述的詳細(xì)信息見補(bǔ)充表1。不同實驗組間的PCR結(jié)果見補(bǔ)充資料。如補(bǔ)充圖3和4所示，逆轉(zhuǎn)錄定量的相對豐度聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致，表明兩種技術(shù)的轉(zhuǎn)錄物鑒定和定量高度一致。從RNASeq分析中選擇的基因與RT-qPCR的表達(dá)強(qiáng)度一致。
圖4 熱圖顯示了暴露于AEA和AEA+AM251的斑馬魚異種移植物中DEG的列表
AEAvsCtrl。BAEA+AM251vsCtrl。顏色刻度表示兩組之間的折疊變化，如所述(綠色=下調(diào)，紅色=上調(diào))。僅納入顯著DEGs(FDR<=0.05)。箭頭表示本研究中分析的DEGs。
補(bǔ)充表2 引物列表
補(bǔ)充表1基因鑒定、描述及相關(guān)Kegg通路
RT-PCR驗證rna序列通過Real Time PCR對感興趣的基因進(jìn)行定量，以驗證RNA測序結(jié)果。在AEA處理的異種移植物中，csf3b、il11、socs3、mhcluba和pcnp mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。AM251組和AEA+AM251組的mRNA水平與對照組相似。在所選擇的基因中，只有meplb的表達(dá)在AEA暴露的魚中顯著上調(diào)(補(bǔ)充圖3 a-f)。根據(jù)RNA序列分析，casp3 (Supplementary Figure 4a)、vegfaa、vegfab和vegfc mRNA水平?jīng)]有明顯變化。然而，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義，AEA處理導(dǎo)致vegfs mRNA下調(diào)(補(bǔ)充圖4 b-d)。
補(bǔ)充圖3所選基因的實時PCR分析
Soc3 (a)， csf3b (b)， mhcluba (c)， meplb (d)， pcnp (e)， illa (f)mRNA水平異種移植物，對rplp0和rpll3a歸一化。數(shù)據(jù)以平均SD (N-5)表示。各列上方星號*表示實驗組間差異顯著(P<0.05)，采用單因素方差分析，并進(jìn)行Tukley多重比較檢驗。
補(bǔ)充圖4異種移植物中casp3 (a)， vegfaa (b)， vegfab (c)， vegfd(d) mRNA水平，與rplp0和rpll3a歸一化
數(shù)據(jù)以平均SD (N-5)表示。各列上方星號表示各實驗組間差異顯著(P<0.05)，采用單因素方差分析后再進(jìn)行Tukey多重比較檢驗。
參與腫瘤細(xì)胞存活/生長的生物標(biāo)志物分子分析
Westernblot分析Lc3A/B和Casp3WT異種移植物在實驗組間無明顯變化。相反，Vegf-C和Il6蛋白分析顯示，暴露于AEA的異種移植物顯著減少。單獨(dú)暴露于AM251或與AEA聯(lián)合暴露的異種移植物沒有引起明顯的變化(圖5)。
圖5AEA對血管生成和炎癥相關(guān)分子靶點(diǎn)的影響
插圖顯示了不同實驗組中具有代表性的Il6、Vegf-C、Casp3、Lc3A/B和β-ActWesternBlot。三個獨(dú)立實驗的密度分析，a.u(任意單位)aIl6,bVegf-C,cLc3A/b,dCasp3。每列上方不同字母表示組間統(tǒng)計差異(單因素方差分析，P<0.05)。
體外AEA對HCT116細(xì)胞增殖的影響
為了研究AEA暴露對細(xì)胞活力和增殖的影響，將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)在0.005~5μM范圍內(nèi)的5種不同濃度的AEA中。體外試驗在低血清濃度(即0.5%血清)下進(jìn)行，以限制細(xì)胞生長并增加細(xì)胞對該化合物的反應(yīng)性。事實上，大麻素的作用是細(xì)胞環(huán)境依賴的，受生長因子的存在調(diào)節(jié)。72h后使用CCK-8測定法評估細(xì)胞活力，但與之前在動物模型中觀察到的結(jié)果相反，所有AEA濃度都沒有抗增殖活性。下圖為不同濃度AEA對細(xì)胞體外活力的影響(補(bǔ)充圖5)
補(bǔ)充圖5 AEA不影響HTC116細(xì)胞的體外活力
條形圖顯示不同AEA濃度下HCT116細(xì)胞的增殖情況。各列上方同字母(a)表示實驗組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
多變量統(tǒng)計分析
計算PCA以可視化整個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。該技術(shù)允許將組內(nèi)樣本可視化為單個點(diǎn)，繪制在用計算的PC1構(gòu)建的二維空間中。PC分?jǐn)?shù)用于確定樣本在二維空間中的位置。PC的順序表明它們在數(shù)據(jù)集中的重要性，PC1占最大的變化量。從PCA中發(fā)現(xiàn)Ctrl與AM251和AEA+AM251基團(tuán)重疊，而AEA基團(tuán)單獨(dú)聚集(圖6A)，總的累積解釋方差(68.8%)令人滿意，表明AM251在與AEA聯(lián)合給藥時能夠恢復(fù)Ctrl狀態(tài)。生成雙標(biāo)圖，顯示加載分析和PCA(圖6B)。該分析允許理解變量在構(gòu)建模型中的貢獻(xiàn)。每個變量的加載顯示為紅色箭頭，并顯示每個變量的名稱(圖6C)。箭頭的長度與模型中的貢獻(xiàn)成正比，箭頭點(diǎn)與中軸線的距離反映了它們對PC1或PC2的貢獻(xiàn)。為該模型提供最大變異的兩個基因是soc3和mhcluba，前者對兩種PC1的貢獻(xiàn)幾乎相同，而后者對PC1的貢獻(xiàn)大于PC2。csf3b和il11a對PC1的貢獻(xiàn)幾乎相同，對PC2的貢獻(xiàn)很小，而pcnp對PC1的貢獻(xiàn)從圖中可以看出，對PC2的貢獻(xiàn)很小。此外，vegfc和mep1b僅顯示出對PC1的輕微影響，同時IL-6對PC1內(nèi)部構(gòu)建的模型的貢獻(xiàn)很小。
圖6PCA顯示AEA異種移植物明顯分離，Ctrl、AM251和AEA+AM251基團(tuán)重疊
Ctrl(紅色)、AEA(綠色)、AM251(藍(lán)色)和AEA+AM251(淺藍(lán)色)的評分圖A有95%置信區(qū)域或B沒有95%置信區(qū)域。坐標(biāo)軸顯示PC1(63%)和PC2(19.3%)的分?jǐn)?shù)。CBiplot顯示了加載分析，紅色箭頭表示變量。下軸和左軸表示PC1和PC2的得分，上軸和右軸表示加載值。
討論
從宏觀證據(jù)出發(fā)，AEA暴露使異種移植物腸道亞血管化減少，從而影響腫瘤生長，綜合本多學(xué)科方法獲得的結(jié)果，強(qiáng)烈提示AEA能夠改變腫瘤環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞增殖條件變差，其生存能力不受直接影響。在這些異種移植物中，RNAseq確實揭示了這一點(diǎn)無論治療方式如何，HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本之間沒有差異，這一證據(jù)通過體外癌細(xì)胞暴露于AEA進(jìn)一步觀察到。事實上，AEA暴露在每個測試濃度下都不影響細(xì)胞活力，更深入的分析，集中在10nM濃度下，顯示暴露不影響細(xì)胞增殖和凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
RNAseq分析可以鑒定出一組轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本合作創(chuàng)建適合HCT116細(xì)胞增殖和腫瘤血管化的適當(dāng)微環(huán)境。在DEGs中，考慮到socs3蛋白在結(jié)直腸癌、乳腺癌和卵巢癌中的致癌作用，我們選擇了細(xì)胞因子信號3的抑制因子socs3蛋白。一些研究描述了它通過激活I(lǐng)l-6/Jak/Stat3通路，在調(diào)節(jié)炎癥、血管生成和細(xì)胞存活的關(guān)鍵蛋白，包括Vegf、Il-6和Bcl-2中的作用。因此，本研究的結(jié)果表明，AEA通過下調(diào)斑馬魚社會mRNA可能導(dǎo)致暴露于AEA的異種移植物中Il6和Vegf蛋白的減少，通過Westernblot分析，可能影響Il6/Jak/Stat3信號傳導(dǎo)。該信號在觀察結(jié)果中的關(guān)鍵作用也得到了PCA的證實。然而，RNA-seq顯示jak1和stat3mRNA呈下降趨勢，盡管不顯著，這與報道AEA抗增殖作用的研究一致。對于Vegf家族成員，研究報道Vegf因子的低表達(dá)與影響血管生成的腫瘤體積減小一致。因此，正如之前在體外觀察到的那樣，在小鼠異種移植模型中，可以假設(shè)AEA可能通過降低VEGF水平來調(diào)節(jié)腫瘤增殖，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞和HCT116細(xì)胞之間VEGF/VEGFR2-的結(jié)合。此外，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumorassociatedmacrophages,tam)在缺氧條件下也能產(chǎn)生VEGF，分泌VEGF。因此，雖然沒有觀察到巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化，但可以認(rèn)為，AEA可能不會影響TAM的遷移，從而增加了它們的數(shù)量，而只是VEGF的分泌，從而造成了對腫瘤細(xì)胞生長不利的環(huán)境。事實上，已知HCT116細(xì)胞表達(dá)高水平的VEGF，通過旁分泌/自分泌血管內(nèi)皮信號保證其生長。
事實上，在結(jié)直腸癌中，Vegf的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，Vegf-c的下調(diào)導(dǎo)致腫瘤啟動細(xì)胞減少和轉(zhuǎn)移抑制，這支持了我們在異種移植中觀察到的無轉(zhuǎn)移。在aea誘導(dǎo)的DEGs中，集落刺激因子3(粒細(xì)胞)b(csf3b)是一種促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的多效細(xì)胞因子，通過合成VEGF促進(jìn)血管生成，特別是在原始內(nèi)皮小管形成的早期。因此，其下調(diào)可能導(dǎo)致觀察到的Vegf-C蛋白減少。
一些研究報道，AEA治療可以通過調(diào)節(jié)炎癥靶基因和激活炎性小體成分來減輕炎癥。在這項競賽中，RNA-seq分析和Westernblot數(shù)據(jù)均報告Il6水平下降，支持AEA抗炎活性。Il6的高產(chǎn)量確實會導(dǎo)致豐富的炎癥環(huán)境，并能促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，支持癌細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移傳播。已知IL6通過作用于抗凋亡、血管生成、增殖和免疫反應(yīng)因子，包括BCL-2、BCL-xL、VEGF和MMP2/9的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致STAT3磷酸化和二聚化。
在這方面，在本研究中，人類和斑馬魚的轉(zhuǎn)錄組均顯示bcl-2下調(diào)，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但可能與Il6減少有關(guān)，這與先前在IL6?/?小鼠中的研究結(jié)果一致。本研究中觀察到的bcl2水平缺乏顯著變化，表明細(xì)胞凋亡在腫瘤生理或幼蟲生長中的作用都很微弱。這一結(jié)果得到了Caspase3分析的支持，實驗組之間的mRNA和蛋白水平?jīng)]有變化，這表明細(xì)胞凋亡在異種移植物生理的這一特定階段起著邊緣作用。
最近，一種新的參與細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和凋亡的核因子被發(fā)現(xiàn)，即含有pest的核蛋白(PCNP)。該因子以組織特異性的方式降解與腫瘤細(xì)胞生長和分化相關(guān)的殘留蛋白。因此，我們測量的斑馬魚pcnp的下調(diào)可能與stat3和stat5的減少(盡管不顯著)有關(guān)，影響了上述Il6/Jak/Stat3信號傳導(dǎo)。
除了Il6,AEA處理也影響il11轉(zhuǎn)錄水平。Il11是與Il6細(xì)胞因子家族相關(guān)的細(xì)胞因子，控制抑制核因子NF-kB的釋放，NF-kB是促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄激活因子。它已在包括胃腸道和肝臟在內(nèi)的許多器官中被檢測到，并已被證明可促進(jìn)CRC和前列腺癌的進(jìn)展。第一次，在我們的模型中，Cel結(jié)果表明，AEA誘導(dǎo)il-11顯著下調(diào)，可能影響Il11/Stat3通路。這一結(jié)果與先前的數(shù)據(jù)一致，這些數(shù)據(jù)描述了內(nèi)源性大麻素對JAKs和STAT家族成員以及白細(xì)胞介素的抑制作用，并表明其作為一種具有強(qiáng)大抗腫瘤潛能的分子實體的作用。另一個分析的過程是自噬，自噬被認(rèn)為是一把雙刃劍，因為它可以調(diào)節(jié)腫瘤抑制和腫瘤細(xì)胞存活。
在本研究中，LC3蛋白水平在實驗組之間沒有明顯變化。然而，在我們的異種移植物中，可以假設(shè)自噬調(diào)節(jié)的兩種可能情況:在對照組和暴露于AM251的組中，自噬調(diào)節(jié)代謝物攝取，有利于HCT116增殖，正如之前在不同的癌細(xì)胞系中觀察到的那樣。而在暴露于AEA的異種移植物中，可以假設(shè)自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)、組織保護(hù)和抗炎作用，這得到了促炎趨化因子減少的支持，并與暴露于AEA的人角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)果一致。此外，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是所有有核細(xì)胞的免疫反應(yīng)和非自我表達(dá)的膜識別的主角之一。MHC-I的主要功能是向CD8+T細(xì)胞呈遞肽抗原，觸發(fā)其分化，從而輔助免疫應(yīng)答。對斑馬魚轉(zhuǎn)錄組的RNA-seq分析顯示mhcIuba轉(zhuǎn)錄下調(diào)，其與哺乳動物MHC具有高度的同一性，表明AEA處理激活了自然殺手介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。然而，由于AEA對MHC-I對非自體識別的控制有待深化，因此還需要進(jìn)行一些研究。根據(jù)我們的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，我們可以推測其減少可能與il11mRNA水平的降低有關(guān)，正如最近在HD11細(xì)胞系中所證明的那樣。研究內(nèi)源性大麻素如何減輕抗原免疫反應(yīng)可能會很有趣，不僅關(guān)注炎癥的控制，還關(guān)注自我和非自我之間的調(diào)節(jié)。
我們的研究結(jié)果證實了金屬蛋白酶家族基因表達(dá)的變化。金屬蛋白酶(ADAMs)是參與結(jié)締組織穩(wěn)態(tài)、腸道屏障功能和免疫過程的細(xì)胞外蛋白酶。其中，meprins具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能特征:meprinα是一種促血管生成酶，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而meprinin主要與某些疾病有關(guān)。金屬蛋白酶的底物是許多跨膜蛋白，如TNF-a、IL6R等促炎細(xì)胞因子。此外，meprins通過調(diào)節(jié)IL1B、IL18和IL6的活性來平衡免疫環(huán)境，IL1B、IL18和IL6是組織損傷和炎癥反應(yīng)中釋放的主要產(chǎn)物。當(dāng)細(xì)胞因子和單核細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力或ROS產(chǎn)生的反應(yīng)中發(fā)生不平衡時，meprins也參與ECM重塑。令人驚訝的是，在本研究中，RNA-seq分析顯示mep1b基因表達(dá)增加，據(jù)一些研究報道，mep1b基因表達(dá)增加可能與白細(xì)胞內(nèi)流促進(jìn)和腫瘤細(xì)胞遷移導(dǎo)致細(xì)胞因子增加有關(guān)。相反，在DEG中，Ils導(dǎo)致下調(diào)，這表明在我們的異種移植物模型中，mep1b可能僅參與幼蟲發(fā)育，可能控制早期幼蟲典型的活躍細(xì)胞進(jìn)展。
結(jié)論
總的來說，我們的數(shù)據(jù)表明，AEA在細(xì)胞間腫瘤-內(nèi)皮細(xì)胞通訊的抗血管生成、抗增殖和抗炎過程中起著關(guān)鍵作用，從而抑制腫瘤，并證明斑馬魚幼蟲異種移植物是一種有前途的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)快速檢測方法，在體內(nèi)環(huán)境中彌合了基因型和表型之間的差距。
基金：該項目由泰國國家研究委員會資助，并在清邁大學(xué)(HVD)和馬爾凱理工大學(xué)(OC)“內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對癌癥治療的操縱:以斑馬魚為模型”的資助協(xié)議下實現(xiàn)。
本文章原文 Sella F, Giommi C, Facchinello N, ; Cell Death Dis (2022); PMID: 36564370
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